Summary
जिगर sinusoidal endothelial कोशिकाओं (सेकेंड) के अध्ययन के प्राथमिक पशु से प्राप्त के रूप में कोई सेल लाइनों मौजूद कोशिकाओं के साथ किया जाना चाहिए. यह जिगर और बाद संवर्धन और प्रयोग के लिए एसईसी शुद्धि के लिए अंतर है centrifugation पाचन विधि पर निर्भर करता है है.
Protocol
1. जिगर के छांटना (14,15 संशोधनों के साथ पीओ Seglen 12 और आर. Blomhoff 13 से अपनाया)
- एक बंद 5.5 एल कक्ष में एक पेट्री डिश के लिए polyethylene glycol में 10 एमएल 30 isoflurane% जोड़ें. यह isoflurane के अलावा कक्ष के भीतर एक स्थिर माहौल बनाने के बाद 10-15 मिनट इंतजार करने के लिए इष्टतम है.
- सील कक्ष में एक चूहा प्लेस और यह anesthetized बनने के लिए अनुमति देते हैं. पूर्ण संज्ञाहरण के प्रभाव स्पष्ट कर रहे हैं जब जानवर लंगड़ा, अनुत्तरदायी हो जाता है, और गहरी साँस लेने दर्शाती है.
- एक 30 मिलीलीटर सिरिंज ट्यूब के नीचे कुछ कपास गेंदों में polyethylene glycol प्लेस में 2 isoflurane की एमएल.
- एक ट्रे डायपर कवर और थूथन अधिक सिरिंज ट्यूब की जगह पर अपनी पीठ पर चूहे रखें.
- तुरंत 70% इथेनॉल के साथ पेट को गीला करके गहरी संज्ञाहरण की पुष्टि करें. जानवर isoflurane अधिक मात्रा से मरने मत करो.
- पट्टी कैंची और संदंश का प्रयोग, पूरे अब्द बेनकाबominal गुहा.
- रग Porta के पता लगाएँ और, संदंश का उपयोग करने के लिए, शल्य चिकित्सा या रग Porta के तुरंत mesenteric शाखा ऊपर नीचे पॉलिएस्टर धागे (संयुक्ताक्षर) रेशम की दो किस्में आकर्षित.
- संदंश वापस लेने और एक ढीला overhand गाँठ बाँध.
- रग Porta के नीचे संदंश का प्रयोग और धीरे से वापस खींच बाहर नस सीधा, एक Insyte Autoguard कैथेटर (18 GA, 1.3 x 300 मिमी, बी.डी. बायोसाइंसेज) या इसी तरह कैथेटर के साथ नस cannulate. कैथेटर धागा द्वारा गठित पाश से परे कई मिमी जाना चाहिए.
- वापस लेना और कैथेटर पर वसंत - लोड ट्रिगर जारी करके सुई हटायें. रक्त उचित संयुक्ताक्षर प्लेसमेंट संकेत कैथेटर में रिसाव शुरू कर देना चाहिए.
- नीचे overhand गाँठ कस और यह एक और overhand गाँठ के साथ सुरक्षित.
- अवर रग Cava या अवरोही महाधमनी (महाधमनी उदरतलस्थित) रक्त संचार प्रणाली से पलायन करने की अनुमति देने के लिए या तो तोड़.
- Oxygenated के साथ जिगर निस्तब्धता शुरू37 में टीबीएस ° 20 एमएल / मिनट की एक प्रवाह दर पर खून (blanching) निकालने के सी. जिगर एक लाल बैंगनी से एक चिकनी बलुई मिट्टी रंग के लिए बारी चाहिए.
- हालांकि जिगर निस्तब्धता है, आबकारी दूर GI पथ और संयोजी ऊतक के काटने से जिगर. यह जिगर या पंचर Glisson कैप्सूल नहीं चीर - फाड़ करना महत्वपूर्ण है.
- एक कीप है कि buffers को एकत्र किया जा करने के लिए और recirculated की अनुमति देता है पर एक प्लास्टिक नेट पर जिगर रखें. इस बिंदु पर Buffers, नहीं recirculated चाहिए, लेकिन बेकार बीकर में प्रवाह. Flushing 10 मिनट से अधिक पिछले नहीं करना चाहिए. (छवि 2A). Endocytosis कदम 2.1 में आवश्यक समाधान तैयार है.
2. 125 मैं SA-B-Hep (या अन्य उपयुक्त लेबल ligand) के internalization
- एक छोटे से बीकर में 50 एमएल RPMI मीडिया करने के लिए, एक अंतिम एकाग्रता 0.05% BSA और 0.01 एमसीआई 125 मैं एसए बी Hep endocytosis के लिए या अन्य उचित लेबल ligand जोड़ें.
- Apparatu इस बीकर संलग्नoxygenation के लिए अनुमति देने के लिए.
- मुड़ें बंद पंप, इनलेट टयूबिंग स्विच करने के लिए, और फिर 20 एमएल / मिनट पंप पर बारी.
- के रूप में लेबल RPMI जिगर दृष्टिकोण, पंप बंद बारी और कीप और टयूबिंग नाली में अधिक तरल पदार्थ की अनुमति है.
- मीडिया बीकर में नाली टयूबिंग प्लेस लेबल मीडिया के पुनःपरिसंचरण की अनुमति और फिर पंप को पुनरारंभ करें.
- तरल पदार्थ जिगर के माध्यम से कोई अधिक से अधिक 1 घंटे के लिए recirculate दें.
- इस internalization कदम के दौरान, सुनिश्चित करें कि जिगर में तापमान यह कवर और पाचन के लिए collagenase तैयार करके स्थिर है.
3. जिगर की collagenase पाचन द्वारा पाचन
- हौसले से भंग और फ़िल्टर (0.45 सुक्ष्ममापी) collagenase (100 चूहे वजन मिलीग्राम / किग्रा) कुल 37 में 60 एमएल से अधिक नहीं मात्रा डिग्री सेल्सियस में 2 बफर जोडी होना चाहिए मात्रा लंबाई / टयूबिंग की आंतरिक मात्रा पर निर्भर है और तदनुसार समायोजित किया जाना चाहिए.
- पंप और विनिमय बंद करोइनलेट मीडिया बीकर से टीबीएस टयूबिंग.
- 50 एमएल / मिनट जो desmosomal सेल जंक्शनों जो कैल्शियम निर्भर हैं ढीला करने के लिए अनुमति देता है पर 2 मिनट के लिए जिगर फ्लश.
- हालांकि जिगर निस्तब्धता है, तंत्र पर collagenase युक्त बीकर के साथ मीडिया बीकर का आदान - प्रदान.
- निस्तब्धता के तुरंत बाद, एक संचार पाश में collagenase से 20 एमएल / मिनट के प्रवाह की दर पर 15 मिनट के लिए पाचन शुरू हो. चूंकि collagenase बैचों बहुत संख्या के हिसाब से बदलती है, और पाचन की राशि और समय में बदलाव collagenase के हर नए बहुत कुछ के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता है. Collagenase भी कैल्शियम निर्भर है. पंप बंद मुड़ें और फ्लास्क से बफर और गैस लाइनों स्विच बर्बाद कंटेनर से एक फ्लास्क बी फ्लास्क बी प्रवाह लाइन (छवि 2B) स्थानांतरण .
- पंप बंद करो, कैथेटर को हटाने और एक 20-30 एमएल 1 बफर युक्त डिश के लिए जिगर हस्तांतरण.
- वापस पील जिगर की Glisson कैप्सूल और सेल हिलातरल में बाहर है.
- के रूप में तरल सेलुलर सामग्री के साथ अपारदर्शी हो जाता है, एक 100 सुक्ष्ममापी 30 सुक्ष्ममापी जाल के माध्यम से और फिर एक 50 एमएल शंक्वाकार में बर्फ पर निस्पंदन द्वारा पीछा जाल के माध्यम से कोशिकाओं को हस्तांतरण.
- जिगर को अधिक एक बफर जोड़ें और जिगर मैट्रिक्स कोशिकाओं से मिलाते जारी जाल फिल्टर और शंक्वाकार तरल हस्तांतरण.
- चरणों को दोहराएँ 3,7 करने के लिए 3,9 जब तक कोई और अधिक कोशिकाओं जिगर की उचित झटकों के साथ उखाड़ फेंकना जा सकता है.
4. Hepatocyte और एसईसी शुद्धि
- 50 एमएल 3 मिनट के लिए 150 XG पर कोशिकाओं से युक्त conicals अपकेंद्रित्र. गोली hepatocytes.
- स्थानांतरण तरल अंश युक्त ताजा बर्फ पर 50 एमएल conicals गैर parenchymal कोशिकाओं.
- धो hepatocytes 3 बफर में गोली resuspending और 4.1 कदम और 4.2 तीन गुना अधिक दोहरा.
- Washes के अंत में, छर्रों ≥ 97% शुद्ध hepatocytes हैं. सेकेंड प्राप्त करने के लिए ट्यूबों ग के सभी अपकेंद्रित्रसतह पर तैरनेवाला (HSCs, सेकेंड, और KCS और कुछ छोटे hepatocytes युक्त) के 10 मिनट के लिए 200 XG पर जमा ontaining. 4 में डिग्री सेल्सियस
- बफर महाप्राण (व्यंजन) और 4 में सभी 5 एमएल RPMI / BSA में छर्रों डिग्री सेल्सियस resuspend
- कोशिकाओं को एक साथ 2 ट्यूबों में पूल और 35 एमएल की एक मात्रा RPMI / BSA जोड़ने.
- 3 मिनट के लिए 100 XG पर conicals अपकेंद्रित्र.
- तरल और एक साफ 50 एमएल शंक्वाकार करने के लिए स्थानांतरण के शीर्ष 25 एमएल लीजिए.
- शेष 10 एमएल मीडिया में गोली Resuspend और वापस ठंड RPMI / BSA के 25 एमएल और 3 मिनट के लिए 100 XG पर अपकेंद्रित्र जोड़ें.
- 3.8 और 3.9 दोहराएँ कदम एक बार और, सेल गोली और कम 10 एमएल मीडिया त्यागें.
- गोली सेकेंड, KCS, और 10 मिनट के लिए 200 XG पर HSCs supernatents अपकेंद्रित्र. 4 में डिग्री सेल्सियस
- तीन 50 एमएल बर्फ पर 20 एमएल पीबीएस में 25% Percoll युक्त ट्यूबों तैयार करें. प्रत्येक ट्यूब में 15 एमएल 50% Percoll के साथ बुनियाद.
- 30 एमएल RPMI / BSA की कुल मात्रा में सेल छर्रों Resuspend.
- ध्यान से उपरिशायी पूर्वी वायु कमानज 4 बजे 20 मिनट के लिए 900 XG पर 10 एमएल कोशिकाओं और अपकेंद्रित्र के साथ ढाल डिग्री सेल्सियस
- सेकेंड और KCS बहुत घनत्व प्रसन्नचित्त बंद है और 25/50% इंटरफेस में हैं. HSCs 25% पर आम तौर पर कर रहे हैं / मीडिया लिपिड भंडारण कोशिकाओं के रूप में अपने उच्च उछाल के कारण इंटरफ़ेस. कोई शेष hepatocytes और रक्त कोशिकाओं को कम buoyancies है और pelleted हैं. 25/50% इंटरफ़ेस के पास ऊपर नीचे से महाप्राण (व्यंजन) और इस सामग्री को त्यागें.
- 25/50% इंटरफ़ेस और ठंड RPMI के साथ एक ताजा शंक्वाकार के लिए स्थानांतरण में कोशिकाओं लीजिए. अंतिम मात्रा ~ 40 के लिए बाहर एमएल Percoll पतला होना चाहिए.
- 4 में 10 मिनट के लिए 350 XG पर शंक्वाकार ° गोली कोशिकाओं सी अपकेंद्रित्र.
- ~ 10 एमएल पूर्व गर्म RPMI एक गिलास एसिड धोया पेट्री डिश में 100 यू / एमएल Penicillin/100 छ / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन और जगह कोशिकाओं से युक्त या पकवान crystallizing में कोशिकाओं Resuspend.
- 15 मिनट के लिए कोशिकाओं को सेते हैं. 37 डिग्री सेल्सियस एक टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में.
- रॉक या थाली के एक छोटे ज़ुल्फ़और फिर सतह पर तैरनेवाला में सेकेंड इकट्ठा. KCS कांच सेकेंड की तुलना में अधिक तेजी से पालन. वैकल्पिक रूप से, सेकेंड KCS से विरोधी CD31 या anti-Stabilin2/HARE चुंबकीय मोतियों को संयुग्मित एंटीबॉडी का उपयोग immunopurification द्वारा अलग किया जा सकता है.
- व्यवहार्यता और सेल नंबर trypan नीले एक hemacytometer का उपयोग कर बहिष्करण या एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग कर के साथ मूल्यांकन किया जा सकता है.
- संस्कृति 37 पर fibronectin लेपित प्लास्टिक के बर्तन पर सेकेंड डिग्री सेल्सियस, 5% 2 सीओ, 40 एनजी / एमएल VEGF, 100 यू एमएल / पेनिसिलीन, 100 स्ट्रेप्टोमाइसिन μg एमएल / या hepatocyte वातानुकूलित मीडिया के साथ साथ RPMI/0.25% BSA.
- Hepatocytes, KCS, और सेकेंड लेबल सामग्री के internalization के लिए आकलन एक गामा काउंटर के उपयोग के द्वारा किया जा सकता है और कुल सेलुलर प्रोटीन या माइक्रोस्कोपी द्वारा (अगर fluorescently लेबल) सामान्य इन संवर्धन तरीकों का उपयोग कर.
5. प्रतिनिधि परिणाम:
Hepatocyte शुद्धि ≥ 97% है और एसईसी शुद्धि typic है≥ सहयोगी 95% इस विधि का उपयोग कर. उदर गुहा, पोर्टल शिरा के केन्युलेशन, और जिगर की blanching के छांटना सभी सर्वोत्तम परिणामों के लिए एक मिनट के भीतर हो जाना चाहिए. HARE/Stabilin-2 जिगर सेकेंड पर एक विशिष्ट रिसेप्टर और अन्य जिगर प्रकार की कोशिकाओं में व्यक्त नहीं है. इस नमूने में, दोनों hepatocytes और सेकेंड के सेल lysates 5% एसडीएस पृष्ठ से अलग हो गए थे और एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ Stabilin-2 के दोनों isoforms (छवि 3) के खिलाफ जांच.
Unfractionated रक्त प्रवाह में इंजेक्शन हेपरिन 16 जिगर द्वारा मंजूरी दे दी है. क्लीयरेंस hepatocytes और 17 KCS के विपरीत में मुख्य रूप से जिगर सेकेंड के द्वारा प्रदर्शन किया . Stabilin-2/HARE रिसेप्टर मुख्य निकासी रिसेप्टर है कि बांध और 18 सेकेंड में हेपरिन internalizes है. हमारे यहाँ उदाहरण में, हम GlcNAc / NS के carboxylate समूह पर एक बायोटिन टैग के साथ हेपरिन लेबल. बायोटिन भली भाँति हेपरिन prot के पता लगाने के लिए iodinated streptavidin के साथ संयुग्मितeoglycan. लेबल हेपरिन इंजेक्शन exsanguination द्वारा पीछा किया 30 मिनट के बाद इंजेक्शन पर नजर रखने के लिए हमें की अनुमति देता है जो अंगों के लिए इस प्रपत्र हेपरिन internalize है. इस छोटे से समय अंतराल में, जिगर प्राथमिक मंजूरी अंग (4 छवि) है.
अधिक स्पष्ट रूप से समझने के लिए जो सेल प्रकार की मंजूरी के लिए जिम्मेदार है, हम 125 जोड़ी मैं एसए ख - Hep RPMI 0.05% BSA के साथ पूरक मीडिया और यह जिगर के माध्यम से 20 मिनट के लिए प्रसारित करने की अनुमति दी. Collagenase पाचन और सेलुलर शुद्धि के बाद, लेबल हेपरिन के विशाल बहुमत hepatocytes (5 छवि) के लिए इसके विपरीत में सेकेंड के द्वारा भली भाँति है.
चित्रा 1 मूल जिगर वास्तुकला. सेकेंड sinusoids की दीवारों के रूप में और कर रहे हैं सामान्य गवाक्षित (हलकों के छोटे समूहों). तारामय कोशिकाओं (HSCs) Disse के अंतरिक्ष में Kupffer ग करने के लिए इसके विपरीत में पाए जाते हैं(KCS) ells जो सामान्य sinusoids के microvasculature में मौजूद हैं. Hepatocytes Disse के अंतरिक्ष के दूसरे पक्ष पर कब्जा.
चित्रा 2 छिड़काव तंत्र के योजनाबद्ध. ए) तंत्र की निस्तब्धता / जिगर की sinusoids की धुलाई के दौरान सेट अप. टीबीएस 1 एल फ्लास्क में है. बी) 125 एमएल collagenase साथ ~ 60 एमएल 2 बफर युक्त कुप्पी जिगर के पाचन के लिए एक बंद सर्किट में प्रयोग किया जाता है. प्रवाह लाइन भी रबर डाट में एक पायदान कटौती के माध्यम से बर्बाद कंटेनर से फ्लास्क बी में बदल दिया है. ऑक्सीजन लाइन collagenase (बी फ्लास्क) युक्त foaming से बचने के बफर में नहीं डूबे हुए है. प्रत्येक फ्लास्क पर stoppers के प्रवाह लाइन के कुशल हस्तांतरण की अनुमति है और ऑक्सीजन गैस से बढ़ा दबाव को रोकने के वील हैं.
चित्रा 3.
चित्रा 4 अंगों में लेबल हेपरिन का वितरण. चूहे पार्श्व पूंछ नस के माध्यम से 125 30 मिनट के लिए प्रतीक्षा मैं एसए ख - hep के साथ अंतःक्षिप्त थे और तब exsanguinated . रक्त एकत्र किया गया था ताकि किसी भी कृत्रिम अंगों उच्च रीडिंग देने के लिए नहीं. प्रत्येक अंग के मिनट (सीपीएम) के अनुसार गणना ग्राम में अंग के वजन के खिलाफ normalized थे.
चित्रा 5 लेबल हेपरिन की hepatocytes और सेकेंड में राशि. आरपीएममैं 125 से युक्त मीडिया मैं एसए ख - Hep 20 collagenase पाचन और सेलुलर शुद्धि द्वारा पीछा मिनट के लिए एक अक्षुण्ण जिगर के माध्यम से प्रसारित करने की अनुमति दी थी. Hepatocyte और एसईसी सेल प्रोटीन lysates के समान मात्रा में ब्रैडफोर्ड परख के साथ मात्रा थे और एक गामा काउंटर द्वारा गिना.
चित्रा 6 Kupffer कोशिकाओं सेकेंड से कांच पर आसंजन के द्वारा अलग कर रहे हैं. कक्ष एक एसिड धोया गिलास पकवान crystallizing में रखा गया और को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% 2 CO 15 मिनट के लिए पालन की अनुमति दी. गैर - पालन कोशिकाओं से युक्त supernatent धीरे swirled था और एक अपकेंद्रित्र ट्यूब में रखा. कांच पर दोनों पालन कोशिकाओं (1 लेन) से lysates और गैर - पालन कोशिकाओं (2 लेन) से 8% एसडीएस पृष्ठ से अलग हो गए थे blotted, और CD163 जो Kupffer कोशिकाओं के लिए विशिष्ट है के खिलाफ एक एंटीबॉडी के साथ जांच.
7 चित्रा fibronectin लेपित प्लास्टिक पर मढ़वाया सेकेंड 6 अच्छी तरह व्यंजन रातोंरात RPMI में incubated रहे थे 0.1% BSA के साथ पूरक . चरण विपरीत छवियाँ (ए) 100x (बी) 200x बढ़ाई में ले जाया गया.
Discussion
फांसी ड्रॉप विधि जिसमें isoflurane वाष्प लाती बेहोशी हमारे अध्ययन के लिए पसंदीदा तरीका है द्वारा चूहे की संज्ञाहरण. एक vaporizer भी चैम्बर के बाहर जानवरों को बनाए रखने के लिए कपास के साथ एक सिरिंज के बजाय हो सकता है इस्तेमाल किया जा है, लेकिन शल्यचिकित्सा की प्रक्रियाओं इतनी जल्दी, यह आवश्यक नहीं है. Polyethylene glycol isoflurane करने के लिए जोड़ा जाता है वाष्प दबाव और वाष्पीकरण की दर में कमी. बहुत isoflurane वाष्प की मौत भी जल्दी प्रेरित करेगा. यदि पशु मर जाता से पहले जिगर और cannulated टीबीएस, जिगर में pooling खून कर सकते हैं थक्का साथ blanched और collagenase साथ sinusoids और पाचन के कुशल धोने को रोकने. हेपरिन के अलावा एक anticoagulant के रूप में उपयोगी हो सकता है, लेकिन प्रयोग किया जाता है के बाद से हम अपनी जांच के रूप में लेबल हेपरिन का उपयोग इन अध्ययनों में नहीं हो सकता है.
एक बड़ी सीमा तक बफर नमकीन घोल (GBSS) अक्सर सेकेंड की शुद्धि के लिए अन्य प्रयोगशालाओं द्वारा प्रतिस्थापित. हालांकि यह एसईसी शुद्धि, hep के लिए उपयोगी हैatocytes के रूप में के रूप में अच्छी तरह से GBSS Buffers 1-3 बर्दाश्त नहीं और viabilities लगभग के रूप में उच्च नहीं कर रहे हैं. जब endocytosis को मापने, यह अंग में और hepatocytes शुद्ध में पृष्ठभूमि के स्तर को मापने के लिए अच्छा अभ्यास है.
इस विधि collagenase साथ जिगर छिड़काव के बाद सेकेंड के कुशल शुद्धि के लिए दो में से एक है. अन्य विधि धावन 19 centrifugation के बजाय Percoll ढाल द्वारा गैर parenchymal कोशिकाओं को अलग . Percoll gradients पर धावन का उपयोग करने के लिए लाभ से थोड़ा अधिक सेल viabilities और संख्या हैं. नकारात्मक पक्ष यह है कि धावन centrifugation एक विशेष रोटर, समर्पित अपकेंद्रित्र, और क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला साथ पंप है जो डॉलर के हजारों के दसियों की लागत की आवश्यकता है. इस विधि केवल एक प्रशीतित तालिका के शीर्ष अपकेंद्रित्र और क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप जो कई प्रयोगशालाओं में मानक के उपयोग की आवश्यकता है.
चयनात्मक आसंजन सेकेंड और KCS के पृथक्करण एक मानक पद्धति है20-22. हालांकि यह सच है कि सेकेंड कांच और प्लास्टिक का पालन करना होगा, प्रमुख बिंदु के लिए एक 15 मिनट ऊष्मायन से अधिक नहीं के साथ 37 पर एसिड धोया साफ कांच का उपयोग ° सी 5% से कम सीओ 2. KCS हमेशा सेकेंड की तुलना में तेजी से पालन करेंगे और यह धीरे मीडिया के साथ KCS को धोने के लिए किसी भी शेष सेकेंड कि शिथिल संलग्न हो गए हैं निकालने की सलाह दी जाती है. Pronase और अन्य proteases भी इस प्रोटोकॉल में collagenase पाचन कदम से छोड़े गए कक्षों की वृद्धि viabilities. Proteases कोशिकी रिसेप्टर्स को पचाने और अंतिम शोधन चरणों में सेलुलर आसंजन को बाधित कर सकते हैं.
विधि यहाँ प्रस्तुत आवेदनों की एक विस्तृत विविधता है. हालांकि हम अंतिम परिणाम में जो हेपरिन शुरू में मंजूरी प्राथमिक hepatocytes प्राप्त करने के लिए, जिगर के छिड़काव के लिए लिया जाता है दिखाने के लिए, के.सी., सेकेंड, और HSCs चयापचय रास्ते, immunoregulation, मेहतर गतिविधियों, और अन्य शामिल अध्ययन का एक नंबर के लिए उपयोगी हो सकता है शारीरिक Studiतों. इस प्रक्रिया का सबसे कठिन हिस्सा पोर्टल शिरा से कैथेटर पर्ची के बिना अच्छा केन्युलेशन, जिगर की पाचन, और जिगर की हैंडलिंग है.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम Univ पर डॉ. पॉल Weigel धन्यवाद देना चाहूंगा. HARE/Stabilin-2 और उसे तकनीकी सहायता के लिए रिसेप्टर जेनेट Weigel का पता लगाने के के लिए मोनोक्लोनल एंटीबॉडी 30 के उपयोग के लिए ओकलाहोमा के. इस शोध विश्वविद्यालय नेब्रास्का रिसर्च फंड के द्वारा वित्त पोषित है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
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All salts are from Sigma-Aldrich |
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| 20L water bath | ThermoFisher | 2231 | Water is about 45 °C to compensate for cooling within the tubing. |
| Peristaltic Pump | Cole-Parmer | 7553-70 | Masterflex series |
| Refrigerated Centrifuge | Sorvall | Legend XTR | |
| Catheter | BD Biosciences | 381444 | |
| Dessicator chamber | Fisher | 08595E | Use internal plate |
| Percoll | Sigma | P4937 | |
| Bovine Serum Albumin | SeraCare | AP-4510-01 | |
| 100 μm mesh | Spectrum labs | 146488 | |
| 30 μm mesh | Spectrum labs | 146506 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 21870 | |
| Polyethylene glycol | Spectrum labs | PO107 | |
References
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