In vivo Lever Endocytosis följt av rening av leverceller genom levern perfusion

Summary

Studien av levern sinusformad endotelceller (sek) måste utföras med primära celler från djuret som inget cellinjer finns. Denna metod förlitar sig på levern matsmältningen och differentierad centrifugering för SEC rening för efterföljande odling och experimenterande.

Abstract

Levern är den metaboliska centrum av däggdjur kroppen och fungerar som ett filter för blodet. Den grundläggande strukturen av levern illustreras i figur 1 där mer än 85% av levern massa består av hepatocyter och resterande 15% av den cellulära massan består av Kupfferceller (KCS), stellate celler (HSCs), och sinusformad endotelceller (sek). SECS bildar blodkärlens väggar i levern och innehåller speciella morfologi kallas fenestrae inom i cytoplasman. Fasadentreprenör av cytoplasman är uppkomsten av hål (~ 100 mikrometer) i cellerna så att SECS fungerar som ett såll där de flesta kylomikroner, rester chylomicron och makromolekyler, men inte celler, passera till hepatocyter och HSCs ¹ (Fig. 1). På grund av avsaknaden av en källare membran, gapet mellan sekunder och hepatocyter utgör område för spridning och annan. HSCs ockupera detta utrymme och spela en framträdande roll i reglering och svar jagnjury, lagring av retinoinsyra och immunoregulation i levern ^2.

SECS är bland de mest endocytically aktiva celler i kroppen som visar en rad renhållare receptorer på cellens yta ^3. Dessa inkluderar SR-A, Stabilin-1 och Stabilin-2. Generellt är små kolloidala partiklar mindre än 230 nm och makromolekyler i buffert fas tas upp av Sek, medan stora partiklar och cellulära skräp endocyteras (fagocyteras) genom att KCS ^4. Således är huvuddelen clearance av extracellulärt material såsom glykosaminoglykaner från blodet till stor del beroende på hälsa och endocytic funktioner SECS ^5,6. Till exempel är en ökning i blodet hyaluronan nivåer tecken på leversjukdom, från lätt till svårare former ^7.

Med undantag av en rapport ^8, det finns inga förevigade SEC cellinjer som finns. Även denna förevigat cellinje är de-difreras i att det inte uttrycker renhållare receptorer som finns på primära sek (våra data, visas inte). Alla cellbiologiska studier måste utföras på galvaniska element erhålls friskt från djuret. Tyvärr SECS dedifferentiate under normala odlingsförhållanden och måste användas inom 1 eller 2 dagar efter isolering från djuret. Differentiering av SECS präglas av ett uttryck för Stabilin-2 eller hare receptorn ^9, CD31, och närvaron av cytoplasmisk fenestration ^1. Differentiering av SECS kan förlängas genom tillsats av VEGF i kultur media eller genom odling av celler i hepatocyte betingad medelstora ^10,11.

I denna rapport kommer vi att visa endocytic aktivitet SECS i intakta orgeln med radioaktivt märkt heparin för hyaluronan för SEC-specifika Stabilin-2 receptorn. Vi kommer då att rena hepatocyter och SECS från perfusion levern att mäta endocytos.

Protocol

1. Excision av levern (som antogs från PO Seglen ¹² och R. Blomhoff ¹³ med ändringar ^14,15)

1. Tillsätt 10 ml 30% isofluran i polyetylenglykol till en petriskål i en sluten 5,5 L kammare. Det är optimalt att vänta 10-15 minuter efter tillsats av isofluran för att skapa en stabiliserad stämning i kammaren.
2. Placera en råtta i sluten kammare och låt det bli sövd. Fulla effekten av anestesi är uppenbara när djuret blir slappa, likgiltiga och utställningar djupa andetag.
3. Häll 2 ml isofluran i polyetylenglykol i några bomullstussar på botten av en 30 ml spruta rör.
4. Placera råttan på rygg på en blöja täckta magasinet och placera sprutan slangen över nosen.
5. Omedelbart bekräfta djupa anestesi genom att blöta buken med 70% etanol. Låt inte djuret dör av isofluran överdos.
6. Använda bandage sax och pincett, exponera hela abdominal hålighet.
7. Leta reda på vena porta och med hjälp av pincett, rita två delarna av kirurgiska siden eller polyester (ligatur) under vena porta omedelbart ovanför mesenteriala gren.
8. Dra ut pincett och knyt en lös överhandsknop.
9. Använd pincett under vena porta och dra försiktigt tillbaka för att räta ut venen, cannulate venen med en Insyte Autoguard kateter (18 GA, 1,3 x 300 mm, BD Biosciences) eller liknande kateter. Katetern bör gå flera mm utanför slingan som bildas av tråden.
10. Dra in och ta bort nålen genom att släppa den fjädrande avtryckaren på katetern. Blod bör starta sipprar upp i katetern anger korrekt ligatur placering.
11. Dra ner överhandsknop och säkra den med en annan överhandsknop.
12. Sever antingen sämre vena cava eller fallande kroppspulsådern (aorta abdominals) att låta blodet rinna ut ur cirkulationssystemet.
13. Börja spola levern med syresattTBS vid 37 ° C för att ta bort blod (blanchering) med en flödeshastighet på 20 ml / min. Levern ska förvandlas från en rödlila till en lerjord färg.
14. Även levern är rodnad, punktskatter levern genom att skära bort mag-tarmkanalen och bindväv. Det är viktigt att inte slita sönder levern eller punktera Glisson är kapsel.
15. Lägg levern på en plast nät över en tratt som gör buffertar som ska samlas in och återcirkuleras. Buffertar på denna punkt bör inte recirkuleras, men strömma in avfallet bägaren. Spolning bör inte pågå i mer än 10 min. (Fig. 2A). Förbered endocytos lösning krävs i steg 2,1.

2. Internalisering av ¹²⁵ I-SA-b-Hep (eller annan lämplig märkt ligand)

1. Till 50 ml RPMI media i en liten bägare, lägg till en slutlig koncentration 0,05% BSA och 0,01 mCi ¹²⁵ I-SA-b-Hep eller annan motsvarande märkning ligand för endocytos.
2. Fäst denna bägare till apparatus för att möjliggöra syresättning.
3. Stäng av pumpen, byta inloppsslang och sedan slå på pumpen på 20 ml / min.
4. Som märkt RPMI närmar sig levern, stäng av pumpen och låt överflödig vätska i tratten och slangar avlopp.
5. Placera avloppet slangen i medierna bägaren att återcirkulation av märkt medier och starta pumpen.
6. Låt vätska för att cirkulera genom levern för inte mer än 1 timme.
7. Under denna internalisering steg, se till att temperaturen i levern är stabilt genom att täcka den och förbereda kollagenas för matsmältningen.

3. Nedbrytning av levern genom kollagenas matsmältningen

1. Färskt upplöst och filtrerade (0,45 ìm) (100 mg / kg råtta vikt) kollagenas bör läggas till Buffer 2 i en total volym inte överstiga 60 ml vid 37 ° C. Volymen är beroende av längden / inre volym slangen och bör anpassas därefter.
2. Stoppa pumpen och utbytainloppsslang från media bägaren till TBS.
3. Skölj levern i 2 min vid 50 ml / min vilket ger utrymme för uppluckring av desmosomal cell junctions som är kalcium beroende.
4. Även levern är rodnad, utbyta media bägare med bägaren innehåller kollagenas på apparaten.
5. Omedelbart efter spolning, börja matsmältningen med kollagenas i en cirkulations slinga med en flödeshastighet av 20 ml / min i upp till 15 min. Eftersom kollagenas partier varierar beroende på partiets nummer, variationer i mängd och tid för matsmältningen behöver optimeras för varje ny lot kollagenas. Kollagenas är också kalcium beroende. Stäng av pumpen och byta buffert och gasledningar från kolv A till kolv B. Överlåtelse utflödet linje från avfallsbehållaren till kolv B (Fig. 2B).
6. Stoppa pumpen, ta bort katetern och överföra levern till en maträtt som innehåller 20-30 ml buffert 1.
7. Dra av Glisson s kapsel i levern och skaka cellenär ute i vätskan.
8. Eftersom vätskan blir ogenomskinlig med poröst material, överföra celler genom en 100 ìm mesh följt av filtrering genom ett 30 ìm mesh och sedan i en 50 ml konisk på is.
9. Lägg till fler buffert 1 till levern och fortsätta skaka celler från levern matris, överföra vätskan mesh filter och koniska.
10. Upprepa steg från 3,7 till 3,9 tills inga fler celler kan rubbas med rimliga skakning av levern.

4. Hepatocyte och SEK rening

1. Centrifugera 50 ml conicals innehåller celler vid 150 xg i 3 min. till pellets i hepatocyter.
2. Överför vätskan fraktion som innehåller icke-parenkymceller till frisk 50 ml conicals på is.
3. Tvätta hepatocyter vara resuspending pelleten i buffert 3 och upprepa steg 4,1 och 4,2 tre gånger.
4. I slutet av tvättar, pelletsen är ≥ 97% ren hepatocyter. För att få Sek, centrifug alla rör containing poolade supernatant (innehållande HSCs, Sek, och KCS och några små hepatocyter) vid 200 xgi 10 minuter. vid 4 ° C.
5. Aspirera bufferten och resuspendera alla pellets i 5 ml RPMI / BSA vid 4 ° C.
6. Pool cellerna tillsammans i 2 rör och tillsätt RPMI / BSA upp till en volym av 35 ml.
7. Centrifugera conicals vid 100 xg i 3 min.
8. Samla upp 25 ml vätska och överför till en ren 50 ml konisk.
9. Återsuspendera pelleten i de återstående 10 ml media och lägga tillbaka 25 ml kall RPMI / BSA och centrifugera vid 100 xg i 3 min.
10. Upprepa steg 3,8 och 3,9 gång, kasta cellpelleten och lägre 10 medier ml.
11. Centrifugera supernatents till pellets Sek, KCS och HSCs vid 200 xgi 10 minuter. vid 4 ° C.
12. Förbered tre 50 ml rör som innehåller 20 ml 25% Percoll i PBS på is. Underlag med 15 ml 50% Percoll i varje rör.
13. Resuspendera cellen pellets i en total volym på 30 ml RPMI / BSA.
14. Noggrant overlay EACh lutning med 10 ml av celler och centrifugera vid 900 xg under 20 minuter vid 4 ° C.
15. Sekunder och KCS har mycket nära stark densitet och är på 25/50% gränssnitt. HSCs är oftast på 25% / media-gränssnitt på grund av deras högre bärighet som lipid lagring celler. Eventuella återstående hepatocyter och blodkroppar har lägre buoyancies och är pelleterat. Sug uppifrån och ner i närheten av 25/50% gränssnittet och kasta detta material.
16. Samla cellerna i 25/50% gränssnitt och överföring till en ny konisk med kallt RPMI. Den slutliga volymen bör vara ~ 40 ml för att späda ut Percoll.
17. Centrifugera koniska vid 350 xgi 10 minuter vid 4 ° C till pellets cellerna.
18. Resuspendera cellerna i ~ 10 ml förvärmda RPMI innehåller 100 U / ml Penicillin/100 g / ml streptomycin och placera celler i en syratvättad glas petriskål eller kristalliserande maträtt.
19. Inkubera cellerna i 15 min. vid 37 ° C i en vävnad kultur inkubator.
20. Rock eller snurra plattan liteoch sedan hämta ut SECS i supernatanten. Den KCS följa glaset mycket snabbare än sekunder. Alternativt kan SECS separeras från KCS genom immunopurification med anti-CD31 eller anti-Stabilin2/HARE antikroppar konjugerade med magnetiska kulor.
21. Livskraft och cell nummer kan bedömas med trypan blå utanförskap med hjälp av en hemacytometer eller med hjälp av en automatiserad celltalsräknare.
22. Kultur SECS på fibronektin-belagd plastskålar vid 37 ° C, 5% CO _2, RPMI/0.25% BSA med 40 ng / mL VEGF, 100 U / ml penicillin, 100 mikrogram / ​​ml streptomycin eller med hepatocyte betingad medier.
23. Hepatocyter, KCS och SECS kan bedöma för internalisering av märkt material med hjälp av en gamma disken och normalisera till totala cellulära protein eller genom mikroskopering (om fluorescerande) med hjälp av dessa odling metoder.

5. Representativa resultat:

Hepatocyte rening är ≥ 97% och SEK rening typicallierad ≥ 95% med denna metod. Excision av bukhålan, kanylering av portalen ven och bleknande i levern alla bör ske inom en minut för bästa resultat. HARE/Stabilin-2 är en specifik receptor på levern sekunder och uttrycks inte i andra typer leverceller. I det här exemplet var cell lysates både hepatocyter och SECS separerade med 5% SDS-PAGE och sonderade med en monoklonal antikropp mot både isoformer av Stabilin-2 (Fig. 3).

Ofraktionerat heparin sprutas in i blodbanan elimineras via levern ^16. Clearance är i första hand utförs av levern SECS i motsats till hepatocyter och KCS ^17. Den Stabilin-2/HARE receptorn är den viktigaste avslut receptor som binder och internaliserar heparin i SECS ^18. I vårt exempel här, märkt vi heparin med en biotin tag på karboxylat grupp GlcNAc / NS. Den biotin var konjugerat med joderade streptavidin för detektion av internaliserad heparin proteoglycan. Injektion av de märkta heparin följt av exsanguination 30 minuter efter injektion ger oss möjlighet att övervaka vilka organ internalisera denna form av heparin. I detta korta tidsintervall, är levern den primära clearance orgeln (bild 4).

För att tydligare förstå vilka celltypen är ansvarig för insamling, lade vi till ¹²⁵ I-SA-b-Hep att RPMI media kompletteras med 0,05% BSA och lät det cirkulera genom levern för 20 min. Efter kollagenas matsmältning och cellulär rening, är de allra flesta märkt heparin internaliserad av SECS i motsats till hepatocyter (bild 5).

Figur 1. Grundläggande levern arkitektur. SECS bildar väggarna i sinusoider och normalt Fenestrated (små kluster av cirklar). Stellate celler (HSCs) finns i loppet av spridning och annan i motsats till Kupffers Calnar (KCS) som normalt finns i mikrocirkulation av sinusoider. Hepatocyter ockupera den andra sidan av loppet av spridning och annan.

Figur 2. Schematisk av perfusion apparaten. A) Set-up av apparater under spolning / tvättning av sinusoider i levern. TBS är i en 1 L flaska. B) En 125 ml kolv som innehåller ca 60 ml buffert 2 med kollagenas används för nedbrytning av levern i en sluten krets. Utflödet linjen är också ändras från avfallsbehållaren till kolv B genom ett hack sänkning av gummiproppen. Syret linjen är inte nedsänkt i buffert innehållande kollagenas (kolv b) för att undvika skumbildning. De proppar i varje kolv är spårat för att möjliggöra effektiv överföring av utflödet linjen och för att förhindra ökat tryck från syrgas.

Figur 3.

Figur 4. Fördelning av märkta heparin med organ. Råttor injiceras via laterala svansvenen med ¹²⁵ I-SA-b-Hep vänta i 30 minuter och sedan exsanguinated. Blodet har samlats för att inte ge någon organ artificiellt höga värden. Räknar per minut (CPM) för varje organ normaliserades mot vikten av orgeln i gram.

Figur 5. Mängden märkt heparin i hepatocyter och sek. RPMJag media som innehåller ¹²⁵ I-SA-b-Hep tilläts cirkulera genom en intakt lever i 20 minuter följt av kollagenas matsmältning och cellulär rening. Lika delar hepatocyte och SEK lysates cellprotein kvantifierades med Bradford analys och räknade med en gamma disk.

Figur 6. Kupfferceller skiljs från SECS genom vidhäftning på glas. Cellerna placerades i en syratvättad glas kristalliserande skålen och får hålla i 15 minuter vid 37 ° C, 5% CO _2. Den supernatent innehåller icke-efterlevs celler snurras försiktigt och placeras i ett centrifugrör. Lysates från båda levt celler på glas (bana 1) och från icke följs-celler (Lane 2) har separerade med 8% SDS-PAGE, utplånade, och sonderade med en antikropp mot CD163 som är specifik för Kupfferceller.

Figur 7. SECS pläterade på fibronektin belagt plast 6-såväl rätter inkuberades över natten i RPMI kompletteras med 0,1% BSA. Fas kontrastrika bilder togs vid (A) 100x och (B) 200x förstoring.

Discussion

Anestesi av råtta med droppe metod där isofluran ånga framkallar medvetslöshet är den bästa metoden för våra studier. En förgasare kan också användas i stället för en spruta med bomull för att hålla djuret utanför kammaren, men kirurgiska ingrepp är så snabb, att det inte behövs. Polyetylenglykol läggs till isofluran för att minska ångtryck och avdunstningen. För mycket isofluran ångan kommer att leda till döden för snabbt. Om djuret dör innan levern är kanylerade och skållade med TBS, samla blod kan koagulera i levern och förhindra effektiv tvättning av sinusoider och matsmältning med kollagenas. Tillsatsen av heparin kan vara användbara som antikoagulantia men används inte i dessa studier eftersom vi använder heter heparin som vår sond.

Gey är buffrad saltlösning (GBSS) är ofta ersätts med andra laboratorier för rening av sekunder. Även om det är användbart för SEC rening, Hepatocytes tolererar inte GBSS samt Buffertar 1-3 och viabilitet är inte alls lika hög. Vid mätning av endocytos, är det god sed att mäta bakgrundsnivåerna i orgeln och i renat hepatocyter.

Denna metod är en av två för effektiv rening av SECS efter levern perfusion med kollagenas. Den andra metoden skiljer icke-parenkymceller av elutriation centrifugering ¹⁹ istället för Percoll lutning. Fördelarna att använda elutriation över Percoll lutningar är något högre cell viabilitet och siffror. Nackdelen är att elutriation centrifugering kräver en specialiserad rotor, dedikerad centrifug och Slangpumpar tillsammans som kostar tiotusentals dollar. Denna metod kräver endast användning av en kyld bordsskiva centrifug och peristaltiska pump som är standard i många laboratorier.

Separation av sekunder och KCS genom selektiv vidhäftning är en standardmetod20-22. Även om det är sant att SECS kommer att följa glas och plast, är nyckeln som ska användas syratvättad rent glas med högst 15 minuters inkubation vid 37 ° C vid 5% CO _2. KCS kommer alltid att hålla sig snabbare än sekunder och det är lämpligt att försiktigt tvätta KCS med media för att hämta eventuella kvarvarande SECS som blivit löst bifogad. Pronase och andra proteaser är också utelämnats i stegen kollagenas matsmältningen i detta protokoll för att öka viabilitet av cellerna. Proteaser smälta extracellulära receptorer och kan hämma cellulär adhesion i sista reningssteg.

Den metod som presenteras här har en mängd olika tillämpningar. Även om vi visar slutresultatet som heparin initialt tas upp för godkännande, perfusion av levern för att erhålla primära hepatocyter, kan KC, Sek, och HSCs vara användbart för ett antal studier med metaboliska vägar, immunoregulation, aktiviteter asätare, och andra fysiologiska StudiES. Den svåraste delen av detta förfarande är bra kanylering, nedbrytning av levern, och hantering av levern utan att ha katetern glida från portalen ven.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Buffer 1: 142 mM NaCl 6.7 mM KCl, 10 mM HEPES, 1.5% BSA, pH 7.4 Buffer 2 (perfusion buffer): 67.0 mM NaCl, 6.7 mM KCl, 4.8 mM CaCl2-H2O, 101.0 mM HEPES, BSA 1.5%, pH 7.4. Buffer 3: 137 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 0.7 mM MgSO4, 1.2 mM CaCl2-2H2O, 10 mM HEPES, 1.5% BSA, pH 7.4 RPMI/BSA: 15g/L BSA in RPMI TRIS-buffered Saline (TBS): 154 mM NaCl, 10 mM Trizma Base salt. Collagenase: Collagenase A (#11088785103) from Roche, Collagenase Type I (#LS004691) from Worthington Biochemical or Collagenase I (#C0130) or IA (#C9891) from Sigma-Aldrich.
All salts are from Sigma-Aldrich
20L water bath	ThermoFisher	2231	Water is about 45 °C to compensate for cooling within the tubing.
Peristaltic Pump	Cole-Parmer	7553-70	Masterflex series
Refrigerated Centrifuge	Sorvall	Legend XTR
Catheter	BD Biosciences	381444
Dessicator chamber	Fisher	08595E	Use internal plate
Percoll	Sigma	P4937
Bovine Serum Albumin	SeraCare	AP-4510-01
100 μm mesh	Spectrum labs	146488
30 μm mesh	Spectrum labs	146506
RPMI 1640	Invitrogen	21870
Polyethylene glycol	Spectrum labs	PO107