Antikropp färgning av<em> Drosophila</em> Puppor kan förbättra genetiska analyser av vuxna buken utvecklande genetik. Vi presenterar våra protokoll för dissektion, fixering och antikroppar färgning av iscensatta<em> Drosophila</em> PUPP-buken.
Den Drosophila PUPP-buken är ett etablerat modellsystem för att studera epiteliala morfogenes och utveckling av sexuellt dimorfa morfologier 1-3. Under pupation, som sträcker sig över cirka 96 timmar (vid 25 ° C), förökar populationer av imaginal celler ersätter larver överhuden för att generera den vuxna buken segment. Dessa imaginal celler, född under fosterutvecklingen, finns som lateral par histoblast bon i varje buken segment av larver. Fyra par histoblast bon ger upphov till den vuxna rygg nagelband (främre och bakre rygg-bon), den ventrala nagelband (ventrala bon) och spiracles i samband med varje segment (spiracle bon) 4. Vid puparation dessa diploida celler (som kan särskiljas efter storlek från de större polyploida larver epidermala celler-LECS) påbörja en stereotyp process av tillväxt, migration och utbyte av LECS. Olika molekylära och genetiska verktyg som kan användas för att undersöka bidrag genetiska vägar inblandad i morfogenes av den vuxna buken. Ultimate vuxna fenotyper är vanligtvis analyseras efter dissektion av vuxna buken nagelband. Kräver dock utredning av de bakomliggande molekylära processer immunhistokemisk analyser av PUPP-epitel, som innebär unika utmaningar. Tidsmässigt dynamisk morfogenes och växelverkan av två olika epiteliala populationer (larver och imaginal) genererar en ömtålig vävnad benägna att alltför cell förlust under dissekering och efterföljande behandling. Vi har utvecklat metoder för dissektion, fixering, montering och avbildning av Drosophila PUPP-abdominem epitel för immunhistokemisk studier som genererar en jämn och hög kvalitet prover lämpar sig för konfokala eller standard fluorescerande mikroskopi.
De tekniker som presenteras i denna video kan användas för att förbereda Drosophila puppor från en mängd av utvecklingsstörningar tidpunkter. Puppor behandlas under 24 timmar APF till 32 timmar är APF mest utsatta för cell förlust från epitelet. Användningen av rengöringsmedel (t.ex. Triton X-100 och Tween-20) under längre inkubering steg ökar sannolikheten för att cellen förlust och rekommenderas därför inte. Snarare är desoxicholsyra syra används som rengöringsmedel under den inledande fixering steg. Alla efterföljande stegen utförs i 1X PBS utan rengöringsmedel. Dessutom gunga prover under längre inkubationstid steg ökar cell-förlust och bör undvikas.
Prover kan avbildas med konfokalmikroskopi tekniker. Men Drosophila puppor behandlas som beskrivs kan också avbildas med ett strukturerat system belysning mikroskopi ger bildkvalitet jämförbar med konfokala tekniker.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av ett bidrag från National Science Foundation.