के एंटीबॉडी धुंधला<em> ड्रोसोफिला</em> Pupae वयस्क पेट विकास आनुवंशिकी की आनुवंशिक विश्लेषण में वृद्धि कर सकते हैं. हम मंचन के विच्छेदन के निर्धारण, और एंटीबॉडी धुंधला के लिए हमारे प्रोटोकॉल वर्तमान<em> ड्रोसोफिला</em> पोटा संबंधी पेट.
ड्रोसोफिला पोटा संबंधी पेट एक स्थापित उपकला morphogenesis और यौन dimorphic 1-3 morphologies के विकास के अध्ययन के लिए मॉडल प्रणाली है. प्यूपीकरण है, जो 96 लगभग घंटे spans (25 डिग्री सेल्सियस) के दौरान, imaginal कोशिकाओं के proliferating आबादी लार्वा epidermis की जगह के लिए वयस्क पेट क्षेत्रों उत्पन्न. इन imaginal कोशिकाओं, embryogenesis दौरान पैदा हुए, लार्वा के प्रत्येक पेट खंड में histoblast घोंसले के पार्श्व जोड़े के रूप में मौजूद है. Histoblast घोंसले के चार जोड़े वयस्क पृष्ठीय छल्ली (पूर्वकाल और कूल्हों पृष्ठीय घोंसले), वेंट्रल छल्ली (ventral घोंसले) और प्रत्येक खंड (झरोखा घोंसले) 4 के साथ जुड़े spiracles को जन्म दे. Puparation पर, इन द्विगुणित कोशिकाओं (बड़ा polyploid लार्वा epidermal कोशिकाओं LECs से आकार से अलग पहचाना) प्रसार, प्रवास, और LECs के प्रतिस्थापन की एक टकसाली प्रक्रिया शुरू करते हैं. विभिन्न उपकरण आणविक और आनुवंशिक आनुवंशिक वयस्क पेट के morphogenesis में शामिल रास्ते के योगदान की जांच करने के लिए नियोजित किया जा सकता है. परम वयस्क phenotypes आम तौर पर वयस्क पेट cuticles के निम्नलिखित विच्छेदन विश्लेषण कर रहे हैं. हालांकि, अंतर्निहित प्रक्रियाओं आणविक की जांच पोटा संबंधी उपकला, जो वर्तमान अद्वितीय चुनौतियों का immunohistochemical विश्लेषण की आवश्यकता है. अस्थायी गतिशील morphogenesis और दो अलग उपकला आबादी (लार्वा और imaginal) की बातचीत एक नाजुक विच्छेदन और बाद के प्रसंस्करण के दौरान अत्यधिक सेल घटाने के लिए प्रवण ऊतक उत्पन्न करते हैं. हम विच्छेदन, निर्धारण, बढ़ते और ड्रोसोफिला immunohistochemical अध्ययन है कि लगातार उच्च गुणवत्ता confocal या मानक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के लिए उपयुक्त नमूने उत्पन्न के लिए पोटा संबंधी abdominem उपकला के इमेजिंग के तरीके विकसित किया है.
इस वीडियो में प्रस्तुत तकनीक विकासात्मक समय अंक की एक किस्म से ड्रोसोफिला pupae तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. 24 घंटे की अवधि APF के दौरान 32 घंटे तक संसाधित pupae APF सबसे उपकला से सेल घटाने के लिए प्रवण हैं. डिटर्जेंट की विस्तारित ऊष्मायन चरणों के दौरान (जैसे ट्राइटन X-100 और बीच-20 के रूप में) का उपयोग करें सेल हानि की संभावना बढ़ जाती है और इसलिए की सिफारिश नहीं है. बल्कि, deoxycholic एसिड एक साबुन के रूप में निर्धारण प्रारंभिक चरण के दौरान प्रयोग किया जाता है. 1X पीबीएस में डिटर्जेंट के बिना सभी बाद के चरणों का प्रदर्शन कर रहे हैं. इसके अलावा, विस्तारित ऊष्मायन चरणों के दौरान नमूने कमाल सेल नुकसान बढ़ता है और बचा जाना चाहिए.
नमूने confocal माइक्रोस्कोपी तकनीकों का उपयोग imaged किया जा सकता है. हालांकि, ड्रोसोफिला pupae संसाधित है के रूप में वर्णित भी एक संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी confocal तकनीक करने के लिए तुलनीय छवि गुणवत्ता उपज प्रणाली का उपयोग imaged किया जा सकता है.
The authors have nothing to disclose.
यह काम राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.