תסיסנית גלמי אימונוהיסטוכימיה בטן

Summary

נוגדן מכתים של<em> תסיסנית</em> גלמים יכול לשפר ניתוח גנטי של מבוגר גנטיקה התפתחותית הבטן. אנו מציגים פרוטוקול שלנו מכתים, דיסקציה קיבוע של נוגדן ו מבוים<em> תסיסנית</em> גלמי הבטן.

Abstract

הבטן גלמי תסיסנית היא מערכת מודל הוקמה לחקר המורפוגנזה אפיתל לבין התפתחות מינית מורפולוגיות דימורפית ^1-3. במהלך התגלמות, אשר משתרע על פני כ 96 שעות (במהירות של 25 ° C), אוכלוסיות של תאים מתרבים דמותי להחליף את האפידרמיס הזחל כדי ליצור את קטעי בטן מבוגר. תאים אלה דמותי, נולד במהלך embryogenesis, קיימים זוגות לרוחב של קינים histoblast בכל מגזר בטן של הזחלים. ארבעה זוגות של קנים histoblast להצמיח לציפורן הגב מבוגר (קינים הגבית קדמית אחורית), לציפורן הגחוני (קינים הגחון) ואת spiracles קשור כל פלח (קינים spiracle) ^4. עם puparation, תאים אלה דיפלואידי (להבחין לפי גודל גדול יותר מן הזחל polyploid אפידרמיס התאים-LECs) להתחיל בתהליך סטריאוטיפי של הגירה התפשטות, והחלפת LECs. כלים מולקולריים וגנטיים שונים יכול להיות מועסק לחקור את תרומתם של המסלולים הגנטיים המעורבים המורפוגנזה של הבטן מבוגר. פנוטיפים מבוגר האולטימטיבי מנותחים בדרך כלל לנתיחה הבא של העור הקרני בטן מבוגר. עם זאת, חקירה של התהליכים המולקולריים שבבסיס דורש ניתוח immunohistochemical של האפיתל גלמי, אשר נוכח אתגרים ייחודיים. באופן זמני המורפוגנזה דינמי את יחסי הגומלין של שתי אוכלוסיות נפרדות אפיתל (הזחל ואת דמותי) ליצור רקמת שברירי מועדים לאובדן התא מופרז במהלך עיבוד לנתיחה שלאחר מכן. פיתחנו שיטות לנתיחה, קיבעון, הרכבה הדמיה של האפיתל תסיסנית abdominem גלמי ללימודי immunohistochemical שיוצרים עקבי דגימות באיכות גבוהה מתאים מיקרוסקופ פלואורסצנטי confocal או רגיל.

Protocol

1. יום 1 לפני שתתחיל: אוכלוסיה בריאה של זבובים יש לשמור על שימוש בפרוטוקולים סטנדרטיים culturing: להסיר מבוגרים מבקבוקי או צלוחיות לאחר 3-4 ימים של ביצה להניח ולאפשר פיתוח להמשיך בטמפרטורה קבועה עד נדודים 3 rd הזחלים instar ליזום pupariation. המעבר הזחל / גלמי מסומן על ידי היווצרות של prepupae (0 נחשב שעות לאחר puparium היווצרות-APF). גלמים תנועה נבדלים גלמים מבוגרים על ידי צבע לבן שלהם מפני הזחלים, כי טרם החלו pupariation ידי מלבן שלהם, צורה מעוגלת בליטה של ​​spiracles הקדמי. יהיה עליך: המכחול לאיסוף גלמים חדר לח עבור גלמים culturing: צלחת פטרי מרופדת במגבת נייר הרטובות מכוסה בנייר מסנן המסומנים בנקודות זמן שונות של גנוטיפ אוסף, או מין של גלמים פוספט 1X שנאגרו מלוחים (PBS) לרחצה גלמים , אוסף culturing ובימוי גלמים בעזרת מכחול הרטובות בעדינות להסיר 0hr APF גלמים מבקבוקי תרבות / צלוחיות למקם אותם מכסה תא לח. בעזרת מכחול ו 1X PBS לשטוף בעדינות את גלמים להסיר פסולת במקרה גולם אם יש צורך למיין גלמים לפי מין. Primordia בלוטת המין של גלמים ניתן להשתמש כדי למיין את המינים. Primordia בלוטת המין הגברי הם זוג לרוחב של דיסקים שקוף לראות בקלות דרך לציפורן גלמי כ 2 / 3 לאורך הגוף 5. Primordia בלוטת המין הנשי הם קטנים ולא מזוהים בקלות. מניחים את גלמים בעמדה שכותרתו כראוי בחדר לח ולחזור טמפרטורה קבועה. תרבות לנקודת הזמן המתאים ההתפתחותי. 2. יום 2: Dissection, קיבעון ו הדגירה נוגדן ראשוני לפני שתתחיל: יהיה עליך: Dissection stereomicroscope כירורגי מלקחיים באזמל כירורגי עם מספר 11 להבים שני תשע גם דיכאון זכוכית מנות (מוצר קורנינג # 7220-85) מלאו בארות מנה אחת עם 1X PBS: זהו מאכל שטיפה לניקוי גלמים גזור מלאו בארות מנה שנייה עם חיץ קיבעון תא לחים עבור הדגירה נוגדן. אנחנו משתמשים בקופסאות פלסטיק כריך סגר מרופדת במגבות נייר הרטובות. חיץ קיבוע: 1x PBS, paraformaldehyde 4%, חומצה deoxycholic 0.2% (עבור permeabilization) פלטפורמה Dissection: שקופיות מיקרוסקופ נקה עם חתיכת סרט דו צדדית דבק בצד אחד 1X PBS P100 או p200 pipettor בתור בעזרת מלקחיים בעדינות להסיר את אחד גלמים בכל פעם ולמקם אותם על פלטפורמה דיסקציה עם סיום הקדמי של גלמים מול רוחב הרחב ביותר של הסרט. אם גלמים רטובות יתר על המידה, קודם למחוק אותם יבשים בעזרת מגבת נייר. לפני גלמים יש דבק לחלוטין לקלטת, להשתמש במכחול כדי למקם אותם. אפשר גלמים לאוויר יבש לדבוק קלטת (5-10 דקות) עם אזמל מנתחים לנתח כל גלמים בילטרלי. מטרה זו מושגת בצורה הטובה ביותר עם חתך מהיר אחד מן הקדמי עד הסוף האחורי של גלמים. אם נעשה כראוי, לחתוך יהיה לחצות בשני הקדמי ואת האחורי זוגות spiracles. לנתח לא יותר מ 10 גלמים בכל פעם כמו כביסה וניקוי דגימות במהירות נחוצה כדי למנוע נזק proteolytic לרקמה. באמצעות מכחול, העברת כמות קטנה של 1X PBS על גלמים כל גזור כדי לשחרר אותם מן הקלטת. , ניקוי קיבעון ו הדגירה נוגדן ראשוני בעזרת זוג מלקחיים כירורגיים לתפוס חצי אדם גולם anteriorly ומיד לטבול אותו היטב של צלחת השטיפה. הפלטפורמה לנתיחה צריך להיות מוחלף על ידי צלחת השטיפה על הבמה מיקרוסקופ. המקרה גלמים יש להשאיר על המדגם עד להשלמת העיבוד דגימות מוכנים להרכבה. בעודו אוחז את המחצית גולם להשתמש pipettor בעדינות כדי לשטוף את הרקמה הפנימית של הבטן. לחץ רב מדי במהלך הכביסה יכול להוביל לאובדן של תאים אפיתל. מיד להעביר את החצי נקי גולם למאגר קיבעון בטמפרטורת החדר תהליך החצאים הנותרים גולם דומה. עם, בפועל לנתיחה ושטיפת של 20 חצאים גולם צריך לקחת פחות מ -5 דקות. אפשר גלמים כדי לדגור במאגר קיבעון בטמפרטורת החדר 1 (אחד) לשעה. לשטוף קבוע 3x גלמים חמש דקות 1X PBS דוגמאות יכול להיות מעובד באופן מיידי עבור אימונוהיסטוכימיה או עשויים להיות מאוחסנים אתנול 100% ב -20 ° C עד 3 חודשים ללא הפסד של תאים או תגובתיות epitope. כדי לאחסן דגימות, לאזן דגימות באמצעות דילולסדרה של PBS: EtOH (03:01, 01:01, 01:03) בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות כל דילול לפני ההעברה EtOH 100%. דוגמאות יש מחדש equilibrated ב PBS באמצעות סדרה הפוכה לפני עיבוד אימונוהיסטוכימיה. בלוק דגימות 1x PBS (בתוספת 2% אלבומין בסרום שור) עבור 1 (אחד) שעה לפני תוספת של הנוגדן הראשוני. דגירה עם נוגדן ראשוני מדולל לריכוז המתאים 1X PBS לאורך הלילה 4 ° C ללא נדנדה. 3. יום 3: נוגדן הדגירה משניים, הרכבה הדמיה לפני שתתחיל: יהיה עליך: שני מלקחיים כירורגיים התקשורת הרכבה (גליצרול, Vectashield [וקטור מעבדות], או Slowfade זהב [Invitrogen]) גם דיכאון מיקרוסקופ שקופיות (0.8 מ"מ) Coverslips (24 x 40 מ"מ) נוגדן הדגירה ואת הרכבה משניים: לשטוף דגימות 3x דקה 10 כל אחד עם 1x PBS בלוק דגימות 1x PBS (בתוספת 2% אלבומין בסרום שור) עבור 1 (אחד) שעה לפני תוספת של נוגדנים משני. דגירה עם נוגדנים משני מדולל לריכוז המתאים 1X PBS בטמפרטורת החדר בחושך בלי נדנדה במשך 3 (שלוש) שעות. לשטוף דגימות 3x דקה 10 כל אחד עם 1x PBS במידת הצורך, counterstain גלמים (דוגמה אנו כתם גרעינים עם DAPI [4 ',6-diamidino-2-phenylindole] מדולל PBS למשך 10 דקות). לאזן דגימות (מינימום של 30 דקות) בתקשורת המתאים לפני הרכבה. הכן שקופית המדגם. המורפולוגיה של גלמים מונע הרכבה שטוחה. דוגמאות מורכבים בבאר של שקופית דיכאון (שקופית ירידה) עבור הדמיה. מקום 75 ​​100ul התקשורת הרכבה בשקע היטב. מספר דוגמאות יכול להיות מותקן בשקופית אחת. המקרה גולם יש להסיר מן הדגימות לפני הרכבה. אחוז מקרה בודד גולם anteriorly להיות בטוח שלא לתפוס את קרום גלמי פנימי. עם זוג נוסף של מלקחיים בעדינות לתפוס את קרום גלמי פנימי על ידי ראש ולהסיר ממנו במקרה גלמי. מיד להעביר את המדגם לדיכאון היטב ולהמשיך עיבוד דגימות נוספות. באמצעות עמדת בדיקה או מלקחיים דגימות אחיד הדיכאון היטב את פני השטח לרוחב פונה כלפי מעלה. בועות אוויר מזדמנים ניתן להסיר עם בדיקה. בעדינות להוריד את coverslip על דגימות מקפיד שלא להכניס בועות אוויר 4. נציג התוצאות: דוגמאות שהוכנו באמצעות פרוטוקול זה לשמור על מורפולוגיה ברוטו של הבטן מבוגר. ערימות תמונה עשוי להיות מוקרן כדי ליצור תמונה דו מימדי או 3-D טיוח ניתן להחיל לחקור טופולוגיה הבטן. באיור 1. גן פילוח מוצרים תסיסנית גלמים חלבון כנפיים וביטוי Engrailed (En-gal4: כטב"מ-GFP). דמיינו היו בשעה 26 לאחר היווצרות puparium (APF) עם העכבר אנטי WG (4D4: איווה Hybridoma בנק) ואנטי GFP. הגדלה 10x, הקדמי הוא עזב הגבי הוא למעלה. Nucleii היו counterstained עם DAPI. ערימות של כ -50 תמונות (ΔZ בין פרוסות היא 2.5μm) הוקרנו.

Discussion

הטכניקות שהוצגו וידאו זה יכול לשמש כדי להכין תסיסנית גלמים ממגוון רחב של נקודות זמן התפתחותי. גלמים מעובד במהלך התקופה של 24 שעות ל 32 שעות APF APF נוטים ביותר לאובדן התא האפיתל. השימוש בחומרי ניקוי (כגון טריטון X-100 ו Tween-20) במהלך השלבים דגירה ממושכת מגבירה את הסבירות של אובדן תאים ולכן אינו מומלץ. במקום זאת, חומצה deoxycholic משמש חומר ניקוי במהלך השלב הראשוני קיבעון. כל הצעדים הבאים מתבצעים 1X PBS ללא חומרי ניקוי. בנוסף, נדנדה דגימות במהלך השלבים דגירה ממושכת מגבירה איבוד התא יש להימנע.

דוגמאות ניתן הדמיה באמצעות טכניקות מיקרוסקופיה confocal. עם זאת, תסיסנית גלמים מעובד כפי שתואר יכול להיות גם הדמיה באמצעות מערכת תאורה מובנית מיקרוסקופיה מניב איכות התמונה דומה טכניקות confocal.

Materials

• Dissection stereomicroscope
• Surgical forceps
• Surgical scalpel with number 11 blades
• Nine-well glass depression dishes (Corning product # 7220-85)
• Humid chamber for culturing pupae
• 1X Phosphate buffered saline (PBS)
• #11 surgical scalpel
• double-sided tape
• Fixation buffer: 1x PBS, 4% paraformaldehyde, 0.2% deoxycholic acid (for permeabilization)
• p100 or p200 pipettor
• Depression well microscope slides (0.8 mm)