の抗体染色<em>ショウジョウバエ</em>蛹は成人腹部発生遺伝学の遺伝学的解析を強化することができます。我々は段階の解剖、固定し、抗体染色のために我々のプロトコルを提示<em>ショウジョウバエ</em>蛹の腹部。
ショウジョウバエの蛹の腹部には、上皮形態形成と1-3性的二形性形態の開発の研究のための確立されたモデルシステムです。 (25℃)で約96時間にわたって蛹化、中に、成虫の細胞の増殖集団は、大人の腹部のセグメントを生成するために幼虫の表皮を交換してください。これらの成虫の細胞は、胚形成の間に生まれ、幼虫の各腹部セグメントにおける組織原細胞の巣の外側のペアとして存在する。組織原細胞の巣の4つのペアは、大人の背側クチクラ(前部と後部の背巣)、腹側クチクラ(腹側の巣)と、各セグメント(気門巣)4に関連付けられている気門を生じさせる。 puparation時には、これらの二倍体細胞は、(より大きい倍数体幼生表皮細胞- LECSからサイズによって区別できる)の増殖、遊走およびLECの交換のステレオタイプのプロセスを開始します。様々な分子と遺伝学的ツールは、成人の腹部の形態形成に関与する遺伝的経路の寄与を調査するために用いることができる。究極の大人の表現型は、通常、成人の腹部キューティクルの以下の解剖を分析している。しかし、基盤となる分子過程の研究は、固有の課題を提示蛹上皮の免疫組織化学的分析を、必要とする。時間的に動的な形態形成と二つの異なる上皮集団(幼虫と成虫)の相互作用は、解剖やその後の処理中に、過剰な細胞の損失を受けやすい脆弱な組織を生成する。我々は解剖、固定、マウントと共焦点または標準的な蛍光顕微鏡に適した一貫性のある高品質のサンプルを生成する免疫組織化学的研究のためのショウジョウバエ蛹のabdominem上皮のイメージングの方法を開発した。
このビデオで紹介するテクニックは、発達時のポイントの様々なショウジョウバエ蛹を準備するために使用することができます。 32時間に24時間の期間APF中に処理サナギは、APF上皮からの細胞の損失に最もなりやすいです。拡張インキュベーションステップの間に界面活性剤の使用は、(そのようなトリトンX – 100とTween – 20)細胞の損失の可能性が高く、したがって、推奨されません。むしろ、デオキシコール酸は、最初の固定ステップの間に洗浄剤として使用されます。後続のすべての手順は、洗剤なしで1X PBSで実行されます。さらに、拡張されたインキュベーションステップの間に試料を揺動する細胞の損失を増加させ、回避する必要があります。
サンプルは共焦点顕微鏡技術を用いて画像化することができます。しかし、説明したように処理されたショウジョウバエ蛹はまた共焦点技術に匹敵する画質をもたらす構造化照明顕微鏡システムを用いて画像化することができます。
The authors have nothing to disclose.
この作品は、全米科学財団からの助成金によって支えられている。