Summary
هذا الفيديو يوفر بروتوكول مفصلة لدراسة الوضع الدوائي من القنوات TRPA1 الإنسان باستخدام FlexStation 3. البروتوكول يشمل تفاصيل إعداد الخلية ، وتحميل وتشغيل صبغ القارئ microplate ، FlexStation 3.
Abstract
FlexStation الجزيئية في أجهزة "3 هو قارئ الفوق microplate متعددة قادرة على قياس النمط مضان الآلي في لوحات متعددة جيدا. ومن المثالي لشاشات عالية الإنتاجية المتوسطة لفي بيئات أكاديمية. أنه يحتوي على نقل السوائل وحدة متكاملة مجهزة pipetter متعدد القنوات وجهاز يقرأ عمود واحد في وقت واحد لرصد التغيرات مضان من مجموعة متنوعة من الكواشف الفلورسنت. على سبيل المثال ، استخدمت FlexStation 3 إلى دراسة وظيفة كا 2 + المنفذة للقنوات الأيونات ومستقبلات البروتين G - يقترن ذلك عن طريق قياس التغيرات في مستويات الكالسيوم داخل الخلايا الحرة + 2. عابر مستقبلات محتملة (الحزب) قنوات هي عائلة كبيرة من القنوات غير انتقائية الموجبة التي تلعب أدوارا مهمة في العديد من الوظائف الفسيولوجية والمرضية في جسم المريض. معظم القنوات الحزب والكالسيوم ونفاذية لحث على تنشيط تدفق الكالسيوم. في هذا الفيديو ، وندلل على تطبيق FlexStation 3 لدراسة الوضع الدوائي للقناة TRPA1 ، جهاز استشعار الجزيئية للمنبهات الضارة العديدة. ويتم قياس يتم تحميل خلايا HEK293 عابر أو التعبير عن الإنسان ستابلي TRPA1 القنوات ، ونمت في لوحات 96 - جيدا ، مع كا 2 + حساسة صبغة الفلورسنت ، Fluo - 4 ، والتغييرات في الوقت الحقيقي ومضان في هذه الخلايا قبل وأثناء تطبيق ناهض TRPA1 باستخدام وضع FLEX من FlexStation 3. وقد درست أيضا تأثير مضاد TRPA1 المفترضة. يتم نقل البيانات من البرنامج برو SoftMax تركيز على بناء علاقات والاستجابة TRPA1 تفعيل ومثبطات.
Protocol
1. استعدادات في الخلية 96 - جيدا لوحات
لHEK293 الخلايا trasfected عابر مع TRPA1 الإنسان [كدنا]
- تزرع الخلايا HEK293 1-2 أيام في متوسطة Dulbecco من الضروري الحد الأدنى (DMEM) التي تحتوي على 4،5 ملغ / مل الجلوكوز (الحرارية العلمية ، SH3002201) ، على أن تستكمل مع الحرارة المعطل 10 ٪ مصل بقري جنيني (Invitrogen ، 16000-044) ، 50 وحدة / مل البنسلين و 50 ميكروغرام / مل الستربتوميسين (Invitrogen ، 15140-163). في يوم من ترنسفكأيشن ، ينبغي أن تصل كثافة الخلية 70-90 ٪.
- معطف 96 - جيدا لوحات بواسطة pipetting 50 ميكرولتر بولي - L - الأورنيثين (سيغما P3655 ، 20 ميكروغرام / مل في الماء المقطر المعقم) إلى كل بئر ويحتضنها في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة على الأقل. شطف كل مرة بشكل جيد مع التخزين المؤقت للفوسفات Dulbecco المالحة (DPBS) بدون المغنيسيوم والكالسيوم 2 + 2 + (الحرارية العلمية ، SH3002803). قد يكون غادر لوحة في الخلية هود الثقافة لبضع ساعات.
- على كل جانب من لوحة 96 - جيدا ، وتمييع في أنبوب إيبندورف 1.5 مل 0.2 ميكروغرام [كدنا] في 25 ميكرولتر OPTI - MEM (Invitrogen ، 31985-070). رفع مستوى متناسب وفقا لعدد من الآبار لتكون transfected من [كدنا] نفسه. أيضا في تخفيف منفصلة Lipofectamine إيبندورف 1.5 - 0.4 مل أنبوب ميكرولتر 2000 (Invitrogen ، 11668-019) في 25 ميكرولتر OPTI - MEM لكل بئر أن transfected. نطاق هذا الأمر وفقا لعدد من الآبار لتكون transfected.
- دوامة لفترة وجيزة عام 2000 المخفف [كدنا] وLipofectamine والسماح لهم الجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
- نقل حجم مساو من Lipofectamine المخفف 2000 إلى الأنبوب الذي يحتوي على المخفف [كدنا] ، دوامة ، والسماح للخليط الجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة إلى 2 ساعة. خلال هذا الوقت ، نقل [كدنا] / 2000 Lipofectamine الخليط في 49 ميكرولتر / إضافة إلى لوحة بولي - L - الأورنيثين المغلفة.
- يعرض للتريبسين الخلايا HEK293 (الخطوة 1.1) ، عد كثافة الخلايا باستخدام عدادة الكريات أو الكونتيسة خلية مكافحة الآلي (Invitrogen ، C10227) ، ونقل المبلغ المطلوب من الخلايا (عادة حول ~ 125،000-150،000 خلايا / جيد) إلى 15 مل العقيمة مخروطية القاع أنبوب الطرد المركزي. الطرد المركزي في × 1000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق. Resuspend الخلايا في الخلايا 1،250،00-1،500،000 ~ / مل في مستنبت DMEM ، على أن تستكمل مع مصل الجنين بنسبة 10 ٪ للحرارة الأبقار المعطل ، ولكن بدون المضادات الحيوية.
- الاستغناء عن 98 لتعليق الخلية ميكرولتر كل بئر الذي يحتوي على [كدنا] Lipofectamine - 2000 باستخدام خليط pipetter الأقنية أو الصيدلي Microplate MicroFill (بيو تيك). دعونا نجلس في لوحة غطاء لما لا يقل عن 30 دقيقة قبل وضعه في حاضنة الثقافة ترطيب الخلية. احتضان ثاني أكسيد الكربون في 37 ° C ، 5 ٪ 2 لل20-44 ساعة.
للتعبير عن خلايا HEK293 ستابلي TRPA1
- اتبع الخطوة 1.2 إلى 96 لوحات معطف جيدا.
- وقدم بسخاء محرض خط HEK293 - hTRPA1 الخلية الدكتور أ Patapoutian (معهد سكريبس للأبحاث) ، وحافظت على المدى المتوسط نفس الخلايا HEK293 البرية من نوع (الخطوة 1.1) ولكن مع استكمال 5 ميكروغرام / مل blasticidin (Invitrogen ، A1113902) ، و 50 ميكروغرام / مل B هيغروميسين (Invitrogen ، 10687010). عندما تصل كثافة خلية حوالي 90 ٪ ، يعرض للتريبسين الخلايا ، عد كثافة الخلية ، وأجهزة الطرد المركزي المبلغ المطلوب من الخلايا في 1000 دورة في الدقيقة العاشرة لمدة 5 دقائق. Resuspend الخلايا في مناطق ذات كثافة الخلايا 1000000 ~ / مل في نفس الثقافة المتوسطة تستكمل مع الدوكسيسيكلين (فيشر ، BP26535 ، 0.25 ميكروغرام / مل).
- الاستغناء عن التعليق الخلية لبولي - L - الأورنيثين لوحات مغلفة ب 100 ميكرولتر / pipetter جيدا باستخدام الأقنية أو MicroFill (بيو تيك). دعونا نجلس في لوحة غطاء لما لا يقل عن 30 دقيقة قبل وضعه في حاضنة الثقافة ترطيب الخلية. احتضان عند 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO 2 لل16-24 ساعة.
2. الحلول
- يستخدم محلول الملح مخزنة في هانك (HBSS) كحل خارج الخلية. أنه يحتوي على (مم) : 137 كلوريد الصوديوم و 5.4 بوكل ، 0.25 نا 2 هبو 4 ، 0.44
KH 2 PO 4 ، 1.3 CaCl 2 ، 1.0 MgSO 4 ، 1.0 MgCl 2 ، 10 السكر ، و 10 HEPES ، مع تعديل الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 باستخدام 1N هيدروكسيد الصوديوم). - Fluo - 4 العازلة مقايسة يحتوي على 2 ملم في HBSS بالبروبنيسيد. جعل 250 ملم بالبروبنيسيد الأسهم (سيغما ، P8761) في هيدروكسيد الصوديوم N 0.5. لتمييع HBSS في نسبة 1:125. تعدل الحموضة إلى 7.4 باستخدام حمض الهيدروكلوريك 1 N.
3. تحميل زنزانة مع Fluo ، 04:00
- حل 1 ملغ Fluo ، 04:00 (Invitrogen ، F14202) في DMSO 912 اللامائية ميكرولتر لجعل محلول المخزون من 1 ملم. و- Fluo 04:00 يمكن تخزين المخزون في حل -20 درجة مئوية لمدة لا تقل عن شهر واحد.
- مزيج 10 ميكرولتر Fluo 1 ملم ، مع 10 04:00 Pluronic ميكرولتر F - 127 (Invitrogen ، P3000MP ، و 20 ٪ (W / V) في حل DMSO) ثم نقل المحتوى بالكامل إلى 5 العازلة Fluo - 4 مل مقايسة (الخطوة 2.2) تستكمل مع ألبومين المصل البقري بنسبة 0.1 ٪ (سيغما ، A9418).
- غسل الخلايا المزروعة في لوحات - 96 كذلك (الخطوة 1.7 أو 1.10) مع HBSS في 80 ميكرولتر / 2 مرات جيدا باستخدام غسالة microplate (مثل ELx405TM من بيو تيك).
- إضافة Fluo-4 AM تحميل الحل (الخطوة 3.2) في 50 ميكرولتر / pipetter جيدا باستخدام الأقنية أو MicroFill (بيو تيك) ، واحتضان لوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
- غسل الخلايا 3 مرات مع العازلة مقايسة Fluo - 4 (الخطوة 2.2.) باستخدام غسالة microplate ELx405TM. بعد غسل الماضي ، ترك 80 ميكرولتر من المنطقة العازلة Fluo - 4 مقايسة في كل بئر.
4. إعداد لوحة المركبة
- خلال الفترة من 1 ساعة تحميل الخلية ، وإعداد سلسلة من التخفيفات 3X للمنبهات (أو الخصوم) من 3X تركيزات النهائي المنشود في المنطقة العازلة Fluo - 4 مقايسة.
- ماصة 250-300 ميكرولتر من الحلول مجمع المخفف لوحة المركب 96 - جيدا. الترتيبات اللازمة لالتخفيفات المتسلسلة من مركب والضوابط المقابلة الإيجابية والسلبية في نفس العمود لوحة المركب كلما كان ذلك ممكنا لأن FlexStation 3 يقرأ عمود واحد واحد في وقت واحد.
5. قراءة في لوحة FlexStation 3
- بدوره على نظام (FlexStation 3 ، الكمبيوتر ، والبرمجيات SoftMax برو 5.2)
- حفظ التجربة مع اسم ملف جديد. في تعيين ما يصل ، واختيار النمط FLEX وأدخل القيم التالية :
البروتوكول رقم 1 ، تأثير ناهض 
البروتوكول رقم 2 ، تأثير مضاد 
- مكان مربع معلومات جديدة ، لوحة لوحة المركبة والقراءة لالأدراج المناسبة في FlexStation 3 ثم انقر على "قراءة" الزر. سوف FlexStation 3 قراءة عمود واحد في وقت واحد وإضافة المركبات في نقاط زمنية مبرمجة دون مقاطعة القراءة. الامر يستغرق نحو 3 دقائق (5 دقائق عن البروتوكول رقم 2) على الانتهاء من قراءة عمود واحد والجهاز سوف تستمر لقراءة العمود التالي مع اضافات المجمع يقوم المبرمج من قبل المستخدم في الخطوة 5.2 حتى تتم قراءة كافة الأعمدة.
6. تحليل البيانات
- ويمكن معالجة البيانات التجريبية مباشرة باستخدام SoftMax برو 5.2 البرامج أو نسخ ولصق في أي برنامج جدول بيانات ، مثل Microsoft Excel. هي التي شيدت تركيز استجابة منحنى حمض ناهض الفلوفيناميك TRPA1 (FFA) باستخدام ما يلي الروتينية تركيب المربعات الصغرى.
حيث Y هو استجابة لوحظ ، Y ماكس هو استجابة طبيعية القصوى ، C هو تركيز الدواء المقابلة ، والمفوضية الأوروبية 50 هو الذي أثار تركيز استجابة نصف القصوى ، و n هو معامل H هيل واضح. تركيز تثبيط منحنى لمجمع المفترضة خصم TRPA1 هو الحصول على باستخدام تركيز ثابت من الاتحاد الاسترالي (100 ميكرون) ، وزيادة التركيز تدريجيا من قيمة 50 ألف مركب IC مجمع يحسب ألف متر مربع لأقل من قبل المناسب لما يلي المعادلة. 
حيث Y هو استجابة لاحظ وتطبيع Y أقصى استجابة قصوى ، [النمل] هو مركب المقابلة والتركيز ، وIC 50 هو تركيز الخصم الذي ينتج نصف القصوى تثبيط FFA - أثار ردا على ذلك ، و n H هو هيل واضح معامل.
حيث Y هو استجابة لوحظ ، Y ماكس هو استجابة طبيعية القصوى ، C هو تركيز الدواء المقابلة ، والمفوضية الأوروبية 50 هو الذي أثار تركيز استجابة نصف القصوى ، و n هو معامل H هيل واضح. تركيز تثبيط منحنى لمجمع المفترضة خصم TRPA1 هو الحصول على باستخدام تركيز ثابت من الاتحاد الاسترالي (100 ميكرون) ، وزيادة التركيز تدريجيا من قيمة 50 ألف مركب IC مجمع يحسب ألف متر مربع لأقل من قبل المناسب لما يلي المعادلة. 
حيث Y هو استجابة لاحظ وتطبيع Y أقصى استجابة قصوى ، [النمل] هو مركب المقابلة والتركيز ، وIC 50 هو تركيز الخصم الذي ينتج نصف القصوى تثبيط FFA - أثار ردا على ذلك ، و n H هو هيل واضح معامل. 7. ممثل النتائج :
TRPA1 هو كا 2 قناة الموجبة + - نفاذة ، وتفعيل الأمر الذي يؤدي إلى تدفق الكالسيوم التي يمكن الكشف عنها بواسطة كا 2 + حساسة للصباغة ، Fluo - 4 (1-2). تم استخدام خط الخلية HEK293 - hTRPA1 مستقرة لدراسة العلاقات التركيز والاستجابة للمنبهات وTRPA1 الخصوم. تم تحميل الخلايا مع Fluo ، 04:00 ، وضعت في 80 ميكرولتر من مقايسة العازلة ، وقراءة باستخدام FlexStation 3. بعد تسجيل مضان الأساس لمدة 30 ثانية ، تم إضافة 40 ميكرولتر من التخفيف المتسلسل للناهض TRPA1 ، FFA ، كل في 3X التركيز النهائي المطلوب ، إلى الخلايا من خلال القنوات المتعددة pipetter إدراجها كجزء من وحدة fluidics من FlexStation 3. وتم رصد التغيرات مضان لS. 180 إضافية وأعرب عن التغيرات النسبية Fluo - 4 مضان لكل كذلك ΔF = (F -- 0 F) ، حيث F و F 0 قيم مضان في وقت وبداية الفائدة من القراءة ، على التوالي. وتظهر آثار ممثل دوام التألق للتغيرات في استجابة لسلسلة من تركيزات FFA في الشكل. 1. مذكرة لتركيزات مشاركة FFA الأربعة ، على الرغم من أن مستويات الاستجابة القصوى متشابهة ، وتفعيل حركية أسرع بوضوح في أعلى مما كانت عليه في تركيزات أقل FFA. لذلك ، لتمييز هذه الاختلافات ، فإن تركيز -- شيد العلاقة استجابة عن طريق قياس معدلات الأولية (المنحدر) من الزيادة على مضان إضافة تركيزات مختلفة من FFA (الشكل 2). تأثير half القصوىوقد تقرر تركيز إيف (EC 50) من الاتحاد الاسترالي لتكون 55.4 ميكرومتر (ن = 3). أجرينا لاختبار المفترضة TRPA1 خصم ، مجمع A ، تجربة مماثلة باستخدام بروتوكول # 2 (الخطوة 2). في هذه الحالة ، وأضيفت سلسلة من التخفيفات للخصم في 30 ثانية (40 ميكرولتر من تركيزات 3X النهائي المطلوب) ، وأضاف في وقت لاحق FFA 180 ق (60 ميكرولتر في 300 ميكرومتر لتركيز النهائي من 100 ميكرومتر). مجمع وتخفيض الجرعة بشكل تابع استجابة الخلايا لTRPA1 FFA مع تركيز المثبطة half القصوى (IC 50) من 4.3 ميكرومتر (ن = 3) (الشكل 2).
الشكل 1. التركيز تعتمد على تفعيل TRPA1 الإنسان من قبل الاتحاد الاسترالي. واثار زيادة FFA - استحضر من مضان على مر الزمن (وترد ردود فقط في أول 60 ق لتوضيح أفضل للحركية السريعة للردود FFA - أثار). يرجى ملاحظة أنه في تركيزات أعلى FFA أثارت الزيادة مع مضان. الحركية أسرع بكثير مما كان عليه في تركيزات أقل ، على الرغم من أن مستويات الذروة كانت مشابهة مضان
الشكل 2 تركيز -- الاستجابة لعلاقات الاتحاد الاسترالي التغير بفعل مضان والمركبة والتي يسببها تثبيط استجابة FFA في TRPA1 الإنسان أعربت ستابلي HEK293 في الخلايا. تم تحديد العلاقة استجابة FFA عن طريق قياس معدلات الأولية (المنحدر) من زيادة مضان على تطبيع إضافة تركيزات مختلفة من الاتحاد الاسترالي -- Δ ، والتركيز. يا والتركيز والاستجابة علاقة تثبيط FFA - أثار ردا الكالسيوم قبل خصم TRPA1 المفترضة ، A. مجمع
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
كا 2 + الخلايا تلعب أدوارا مهمة في العديد من الظروف الفسيولوجية والمرضية ، مثل الإفراج العصبي (3) ، القلب إمكانات العمل (4) ، وتقلص العضلات الخلية (5) ، الخلية نقل الإشارة (6-7) ، وموت الخلايا excitotoxic ( 8). قياس مستويات الكالسيوم داخل الخلايا + 2 يساعد على توضيح التغيرات الوظيفية كا 2 + المنفذة للقنوات في غشاء البلازما أو عضيات الخلايا ومساهمة
كاليفورنيا 2 + إلى العمليات المذكورة أعلاه (9-13). ويمكن أيضا أن تستخدم لفحص للتحقق من وظيفة البروتين G - مستقبلات مقترنة ، وكثير منها ، بناء على التنشيط ، يؤدي إلى زيادة الكالسيوم داخل الخلايا الحرة 2 + تركيزات الكالسيوم عن طريق الإفراج عن 2 + من الكالسيوم داخل الخلايا 2 + مخازن أو تفعيل كا 2 + أخرى نفاذية أيون قنوات (14-16). FlexStation 3 يجعل من استخدام كا 2 + الأصباغ الحساسة ، التي تؤدي إلى زيادة كثافة مضان ، أو تغييرات ratiometric ، مع زيادة الكالسيوم داخل الخلايا 2 + التركيز. هذه المقالة يوضح الفيديو تطبيق FlexStation 3 في دراسة كا 2 + المنفذة للقنوات TRPA1 أعرب heterologously HEK293 في الخلايا. على الرغم من أن لدينا سوى استخدام لوحات 96 - جيدا لهذه التظاهرة ، يمكن للمستخدمين بسهولة اختيار من 96 -- 384 أو جيدا شكل لوحة عن طريق تحويل pipetters الاستغناء عن (8 -- أو 16 قناة). هذا الاختبار يوفر وسيلة سريعة لارتفاع القدرة الإنتاجية فرز منبهات و / أو الخصوم ، وينطبق على العديد من القنوات الأيونية كا 2 + - نفاذة. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن الخلايا مقايسة الكالسيوم هو القياس غير المباشرة لأنشطة القناة الايونية. متابعة تفصيلية لا تزال هناك حاجة الدراسات باستخدام التسجيلات المشبك التصحيح الحالية لقياس مباشرة الأيونية تتدفق عبر غشاء الخلية إلى استخلاص الاستنتاجات المناسبة.
للحصول على بيانات موثوقة الجودة ، ينبغي اتخاذ الاحتياطات التالية :
- لخلايا ملتصقة فضفاضة ، مثل HEK293 الخلايا ، طلاء لوحات أمر ضروري. ومع ذلك ، لخلايا ملتصقة بقوة ، مثل خلايا الهامستر الصينية (تشو) أو خلايا المبيض الحله ، والطلاء ليست ضرورية.
- من المهم أن يتم المصنف كمية متساوية من الخلايا في كل بئر من لوحة متعددة بشكل جيد وكثافة خلية في كل بئر يجب أن تكون بين 9-10 ٪ confluency في وقت الفحص.
- الاستغناء بلطف السائل إلى الخلايا وتجنب تعكير الخلايا عند التحميل وغسل الخلايا.
- يضاف بالبروبنيسيد لمنع تسرب الصبغة. ومع ذلك ، منذ بالبروبنيسيد كما أثر على بعض القنوات الأيونية ، ينبغي اتخاذ الحذر عند تفسير البيانات التي تم الحصول عليها من التجارب التي تشمل بالبروبنيسيد في مقايسة العازلة.
- لتحديد تركيزات المركب في لوحة المركبة ، والنظر في عامل التخفيف عن كل حسب جيدا لحجم المخزن المؤقت في البئر المقابلة من لوحة عينة قبل وبعد إضافة المركب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نشكر الدكاترة. جون هانكوك ، راي الشواية ، واندرو موريس أولغا Chumakova على دعمهم. وFlexStation 3 النظام هو جزء من مرفق التصوير Cytodynamic UTHSC. كما نشكر الدكاترة. Ardem Patapoutian وBandell مايكل من معهد سكريبس للأبحاث ومعهد جينوم لمؤسسة أبحاث نوفارتيس (GNF) لتوفير خط خلية HEK293 - hTRPA1 مستقرة. ويدعم هذا البحث في جزء من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (GM081658 لMXZ) وتكساس المركز الطبي لأمراض الجهاز الهضمي مركز (لسمو) وبعثة الاتصال / TIRR مؤسسة (سمو).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FlexStation 3 | Molecular Devices | FLEX3 | |
| 96-Well, FlexStation Pipet Tips | Molecular Devices | 9000-0912 | |
| 96-Well Plates | Greiner Bio-One | 655090 | |
| 96-Well Clear Flat Bottom plates | Costar | 3595 | |
| DMEM | Invitrogen | 12430-104 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985-070 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Fluo-4 AM | Invitrogen | F14202 | |
| PluronicF-127 | Invitrogen | P3000MP | |
| Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P36551 | |
| probenecid | Sigma-Aldrich | P8761 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 |
References
- Hu, H. Activation of TRPA1 channels by fenamate nonsteroidal anti-inflammatory drugs. Pflugers Arch. 459, 579-592 (2010).
- Hu, H., Bandell, M., Petrus, M. J., Zhu, M. X., Patapoutian, A. Zinc activates damage-sensing TRPA1 ion channels. Nat Chem Biol. 5, 183-190 (2009).
- Perney, T. M., Hirning, L. D., Leeman, S. E., Miller, R. J. Multiple calcium channels mediate neurotransmitter release from peripheral neurons. Proc Natl Acad Sci. 83, 6656-6659 (1986).
- Mason, S. A., MacLeod, K. T. Cardiac action potential duration and calcium regulation in males and females. Biochem Biophys Res Commun. 388, 565-570 (2009).
- Raat, N. J., Wetzels, G. E., DeMey, J. G. Calcium-contraction relationship in rat mesenteric arterial smooth muscle. Effects of exogenous and neurogenic noradrenaline. Pflugers Arch. 436, 262-269 (1998).
- Alagarsamy, S., Johnson, K. M. Voltage-dependent calcium channel involvement in NMDA-induced activation of NOS. Neuroreport. 6, 2250-2254 (1995).
- Su, L. T. TRPM7 regulates cell adhesion by controlling the calcium-dependent protease calpain. J Biol Chem. 281, 11260-11270 (2006).
- Dubinsky, J. M., Rothman, S. M. Intracellular calcium concentrations during "chemical hypoxia" and excitotoxic neuronal injury. J Neurosci. 11, 2545-2551 (1991).
- George, J. Sodium channel activation augments NMDA receptor function and promotes neurite outgrowth in immature cerebrocortical neurons. J Neurosci. 29, 3288-3301 (2009).
- Price, K. L., Lummis, S. C. FlexStation examination of 5-HT3 receptor function using Ca2+ - and membrane potential-sensitive dyes: advantages and potential problems. J Neurosci Methods. 149, 172-177 (2005).
- Laude, A. J. Rapid functional assays of recombinant IP3 receptors. Cell Calcium. 38, 45-51 (2005).
- Marincsak, R. The analgesic drug, tramadol, acts as an agonist of the transient receptor potential vanilloid-1. Anesth Analg. 106, 1890-1896 (2008).
- Xie, X. Validation of high throughput screening assays against three subtypes of Ca(v)3 T-type channels using molecular and pharmacologic approaches. Assay Drug Dev Technol. 5, 191-203 (2007).
- Christensen, B. N., Kochukov, M., McNearney, T. A., Taglialatela, G., Westlund, K. N. Proton-sensing G protein-coupled receptor mobilizes calcium in human synovial cells. Am J Physiol Cell Physiol. 289, C601-C608 (2005).
- Boulay, G. Cloning and expression of a novel mammalian homolog of Drosophila transient receptor potential (Trp) involved in calcium entry secondary to activation of receptors coupled by the Gq class of G protein. J Biol Chem. 272, 29672-29680 (1997).
- Nanda, K. Functional screening of adrenergic receptors by measuring intracellular calcium using the FlexStation scanning fluorimeter. Biotechnol J. 4, 417-422 (2009).
