Summary
我们描述了从被感染的细胞中分离高纯度的疱疹病毒衣壳DNA的过程。从溶液中捕获的是最后的DNA浓度和纯度高，使得它非常适合高通量测序，高保真PCR反应，并产生新的病毒重组体转染。
Abstract
病毒是专性细胞寄生虫，因此它们的DNA的研究需要从宿主细胞中的污染物和DNA分离病毒的材料。几个下游应用需要大量的纯病毒DNA，这是由本议定书规定。这些应用程序包括病毒基因组测序，去除宿主DNA病毒序列数据输出是至关重要的优化，新的重组病毒株生产的，共转染纯化的质粒和线性病毒DNA有利于重组 。1,2， 3
此过程采用的提取和基于密度离心分离纯化线性疱疹病毒感染的细胞的核衣壳的DNA相结合 。4,5初步纯化步骤的目的是分离纯化病毒衣壳，其中包含和保护过程中的病毒DNA的提取和离心步骤去除细胞的蛋白质和DNA。核衣壳裂解，然后释放病毒DNA，最后两个酚 - 氯仿的步骤删除剩余的蛋白质。最后的DNA从溶液中捕获的是高度集中和纯粹，平均外径为 1.90 260/280。根据感染的细胞，病毒DNA范围从150-800微克或以上的产量的数量。这种DNA的纯度，使之稳定，在长期储存在4C。这种DNA，因此非常适合于高通量测序，高保真PCR反应，并转染。
开始前的协议，重要的是要知道每道菜的细胞（如平均15厘米在一个融合的菜，8 × 10 6 PK - 15细胞），和滴度的病毒的股票要使用的平均数（如1 × 10 8每毫升空斑形成单位）。这些是必要的适当的感染复数（MOI）计算的协议。， 例如 6，感染15 PK - 15细胞与上述病毒的股票在MOI为5厘米的菜，你会使用400μL病毒的股票和稀介质为3.6毫升（共接种4毫升，一个15厘米板卷）。
多个病毒DNA的制剂可以在同一时间准备。同时筹备工作的数量是有限的，只有超速离心机转子举行管的数量（每病毒之一;见下面的步骤3.9）。在这里，我们描述了，就像做一个病毒程序。
Protocol
1。第一天：病毒感染和缓冲区的制备
- 准备5-10菜的组织培养细胞感染（直径15厘米），如PK - 15细胞为伪狂犬病病毒（PRV）Vero细胞或疱疹病毒（HSV）单纯。
- 当细胞是95 - 100％融合，感染（MOI），5-10。要做到这一点，接种使用病毒库存总量在4毫升每盘每盘，然后孵育1小时板块在37 ° C。岩石板轻轻每15分钟一班，以确保细胞单层仍然完全由涂病毒接种。同时，热情为下一步的介质。
- 感染一小时后，吸板从病毒接种，加入15毫升温介质，37 °培养箱在12-20小时的彗星。
- 准备LCM的缓冲区（见表1）和岩石在4℃，充分搅拌过夜。病毒DNA再悬浮准备TNE（见表2）。
2。第二天，第1阶段：细胞裂解和超速离心法
- 目视确认感染的细胞造成统一的细胞病变效应（CPE）。允许感染的进展，直到所有的细胞都四舍五入，但没有关闭该板块解除。
- 刮成中期感染的细胞，并组合成50 ml锥形管的细胞和介质。这一步所需的锥形管的数量将取决于感染步骤1.2以上菜的数量，锥形管例如，一个50毫升，可用于颗粒最大的3个菜 15 毫升培养基，每个可选：冲洗板用10 ml PBS，并结合细胞和介质。
- 离心细胞和介质在2000年的相对centifugal力量在室温（RCF）10分钟，然后吸出上清液，并在每10毫升的PBS重悬沉淀。如果一个病毒感染的沉淀蔓延到多个步骤2.2锥形管，这些可重新组合成一个锥形管在这一步。重复离心和愿望可选：此颗粒可能被储存在-20 ° C和协议继续在以后的时间。
3。第二天，第2阶段：超速离心
在以下的步骤，保持细胞沉淀和液晶显示模块缓冲区尽可能在冰上。
- 0％甘油中添加β-巯基乙醇 - 液晶显示模块缓冲区。开始冷却超速离心机（以下步骤3.9），将它设置为4 ° C和转折点上的真空。
- 细胞沉淀重悬在0％甘油5毫升 - LCM的缓冲区中，直到它不再是块状。如果有必要，涡管，打破任何不溶的细胞沉淀。
- 提取物加入1.5毫升的氟里昂（1,1,2 - 三氯-2,2,2 - 三氟）和涡旋大力。立即在4 ° C的温度为10分钟2000 RCF离心收集与一个大口径的枪头（避免了接口）的顶层，并转移到一个新的管可选：如果颗粒是一种凝胶状固体，您可以很快地倒到一个新的管的顶层。
- 重复提取氟利昂，离心一次。
- 收集顶层（约5毫升），并转移到一个新的polyallomer超速离心机管。添加β-巯基乙醇，剩下的两个甘油 - 液晶显示模块缓冲区。
- 准备渐变polyallomer离心管中，下部用3毫升，5％甘油氟利昂提取物（顶层） - LCM（中间层），然后再次下部用2.5毫升45％甘油 - LCM（底层）。使用薄移液器管的内容，以避免溢出。
- 如果需要，准备等效平衡管LCM的缓冲区使用相同的比例。
- 超速离心机桶转移到管。平衡水桶内彼此的0.1克，轻轻地添加额外的0％甘油 - 液晶显示模块缓冲区顶层（〜50-100一次μL）。
- 使用水平或水平转头冷超速离心机，旋转平衡样品77000 RCF为SW41Ti转子（如25,000 RPM）在4 ° C的温度为1小时
- 在离心过程中，使玻璃挂钩浮动的DNA捕捉乙醇沉淀步骤（4.6以下）。巴斯德玻璃吸管的两端，并暂停对火焰的中间部分。当一段玻璃几乎熔化，轻轻拉伸展的玻璃，轻轻弯曲，创建一个紧密直角钩（<90度），并大幅拉封锁的结束。如果玻璃钩提示是开放的，缓缴的火焰尖端，使玻璃融化，足以将其关闭。
- 离心后，你应该看到一个在中间的暗斑薄不透明的颗粒。小心吸液管的，包括沿线两侧往，但避免沉淀在试管底部。
- 在室温下加入0.5毫升TNE。
- 让球团坐至少10分钟，让颗粒水化，Optional：颗粒也可能重悬在TNE过夜，如果保持在4 ° C。
4。第三天：“人鬼情未了”的DNA沉淀
- 分手用一个小口径的枪头（例如一个P200枪头）吹打的颗粒。不要担心在这一步，因为在这一点上衣壳中的病毒DNA仍然是剪切。添加下列试剂的试管中的病毒颗粒，在常温下，摧毁衣壳：
- 4.25毫升TNE
- 0.25毫升10％SDS
- 2毫克蛋白酶K
提防从这里剪切，如使用大口径的移液器和不旋涡病毒物质
- 加入5毫升酚 - 氯仿提取病毒的蛋白质，并立即开始反转或震荡保持乳液。混合10秒钟，然后在室温下于2000 RCF离心5分钟的乳液。收集与一个大口径的枪头的顶层，避免了接口，并转移到一个新的管可选：使用锁相凝胶（PLG）管，在这一步，以避免污染从接口。
- 重复的酚 - 氯仿抽提，离心一次。
- 第二酚 - 氯仿提取后，收集到一个30毫升的玻璃Corex公司管的顶层和寒意管在-20 ° C为10-15分钟，照顾它不冻结。
- 添加10毫升的冰冷乙醇，盖管（ 如拉伸封口膜中号的过顶的一块），反转立即混合。观察的DNA“鬼”出现，它由一个薄的粘稠沉淀。反转管轻轻拌匀进一步导致粘DNA沉淀集中在一起。
- 使用玻璃钩捕获的DNA鬼（S）。仔细印迹的DNA，以除去多余的液体，然后放入1.5毫升管挂钩（尖向下），并晾干。添加0.25 - 0.5毫升的TE溶解DNA的鬼。允许再悬浮的DNA进行至少一小时。商店的DNA在4 ° C。 可选：为了最大限度地提高DNA产量，打破玻璃钩到1.5 ml管，使关闭的玻璃碎片再悬浮可以随着时间的推移继续。
5。代表性的成果
有了足够高MOI，细胞应达到充分的CPE〜18小时后感染（HPI）内为野生型伪狂犬病毒株，野生型HSV - 1株（图1）〜24 HPI。一旦被感染的细胞沉淀收获外，其余协议的步骤可以在一个漫长的一天完成或进行两天（图2）。
当准备玻璃钩子来捕获DNA的鬼，这是很重要的，使钩角小于90度，这样，以后它可以放入1.5毫升管基地（图3）。这个钩子的尖端封口防止吸管内的DNA损失。
DNA鬼形成过程中的沉淀步骤，并会显示为白色，粘稠的线程（图4）。这些聚合和坚持对方和/或用于捕获的DNA玻璃钩。因此，同样的玻璃挂钩可用于收集从多个线程的DNA内降水的解决方案。
| 选择所需体积的列： | 10毫升 | 15毫升 | 20毫升 | 40毫升 |
| 1M KCL | 1.3毫升 | 1.9毫升 | 2.5毫升 | 5毫升 |
| 1M的Tris（pH值7.4） | 300μL | 450μL | 600μL | 1.2毫升 |
| 1M氯化镁2 | 50μL | 75μL | 100μL | 200μL |
| 0.5 EDTA的 | 10μL | 15μL | 20μL | 40μL |
| NP40/IGEPAL | 50μL | 75μL | 100μL | 200μL |
| β-巯基乙醇（添加使用前） | 4.3μL | 6.5μL | 8.6μL | 17.2μL |
| 使用所需％甘油（0，5，或45％）的比例 | ||||
| 0％的甘油 | 没有 | 没有 | 没有 | 没有 |
| 水 | 8.3毫升 | 12.5毫升 | 16.7毫升 | 33.4毫升 |
| 5％的甘油 | 0.5毫升 | 0.8毫升 | 1.0毫升 | 2.0毫升 |
| 水 | 7.8毫升 | 11.7毫升 | 15.7毫升 | 31.4毫升 |
| 45％Glycerol | 4.5毫升 | 6.8毫升 | 9.0毫升 | 18.0毫升 |
| 水 | 3.8毫升 | 5.7毫升 | 7.7毫升 | 15.4毫升 |
表1。为LCM的缓冲区准备的食谱
| 对于50毫升的量 |
| 5毫升1M氯化钠 |
| 三，pH值7.5 2.5毫升1M |
| 1毫升0.5 EDTA的 |
| H 2 O 41.5毫升 |
表2。制备TNE（0.1 M氯化钠，50毫米的Tris，pH值7.5; 10毫米EDTA）
| 对于1升容积 |
| 0.2克氯化钾 |
| 0.2克KH 2 PO 4 |
| 8 g氯化钠 |
| 1.15克NA 2 HPO 4 |
| H 2 O至1L |
表3。制备PBS（2.7毫米氯化钾1.5毫米KH 2 PO 4，137毫米氯化钠，8.1毫米的Na 2 HPO 4，pH值7.0）
图1。PK15细胞（a）在感染，（二）中途感染，和（c）在细胞病变效应（CPE）后高的多重感染， 。
图2协议的概述。
图3。玻璃的三个有代表性的例子钩子用来收集病毒DNA鬼。
图4。良好的形成和丰富的“幽灵”的DNA有代表性的例子。
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Discussion
本协议的某些部分最初是病毒DNA隔离BSL4条件，但它同样适应非BSL条件。4，我们通常使用此协议隔离α-疱疹病毒，伪狂犬病毒和HSV - 1，其中有DNA的基因组DNA封闭在一个蛋白质衣壳和脂质信封包围。7,8然而，它可能是直接适应其他大型DNA病毒，包括β-和γ-疱疹病毒和腺病毒。类似的提取通常用于RNA病毒以及9。
这个DNA的制备，净化多种方法，包括可能的结果的鲁棒性。最初的氟利昂提取变性脂质膜，分离的细胞成分，也释放出的脂质包膜外的表膜蛋白环绕疱疹病毒衣壳。其次是超速离心法，沉重的颗粒病毒核衣壳通过两个梯度垫子，有效地分离从大多数其他细胞成分。重悬于这些衣壳，病毒核衣壳的DNA是由破裂的衣壳蛋白与蛋白酶K和洗涤剂。两个酚 - 氯仿抽提彻底清除核衣壳组成部分和任何余下的细胞蛋白。最后，在溶液中的病毒DNA基因组的大降水减少盐或颗粒污染物的结转。
此过程隔离病毒核衣壳DNA下游应用提供了丰富的的，高纯度材料。多个提取和离心步骤的结合，区别于简单的单一提取协议，留下更多的细胞碎片或退化的蛋白产物与 DNA的10本议定书。蛋白质污染物可以减少病毒DNA的储存稳定性，并减少进入细胞的转染效率。细胞DNA污染物1本议定书的DNA产量也很高，使得它非常适合于限制性片段长度多态性（RFLP）分析和Southern杂交。5,11一核衣壳准备提供足够的负面影响PCR反应和高通量测序协议。所有这些分析的材料。
感染的细胞数量影响的病毒DNA的最终产量。对于伪狂犬病毒株与野生型的增长速度，PK - 15细胞（一个直径为15厘米的菜持有约 8 × 10 6细胞）5-10菜的输入通常会产生250-500微克的病毒DNA。对于具有传染性的病毒颗粒减少产量病毒突变体，输入材料，应相应上升缩放。盎司的菜肴输入数字将增加约一倍的产量，并可以与这里所描述的试剂的相同数量处理。为了增加输入超出了这一点，我们建议分成两个并行处理数据流（例如两个细胞颗粒和两个提取管）通过步骤3.13的输入材料。了同样的病毒的离心颗粒可以合并成一个筒，在此再悬浮步骤。如果DNA不干净形成一个幽灵在该过程结束，主要解决问题的方法是增加细胞的输入量，这会增加DNA的产量和提高其沉淀。
其他条件也可以影响鬼形成的成功。例如，它是重要的感染在一个点上时，病毒核衣壳丰富的收获时间，但大多是细胞内或细胞相关。此过程中，病毒颗粒释放介质将不被捕获，并因此收获太晚（例如当CPE已经发展到从盘的地步细胞分离），在感染的细胞会减少潜在的DNA产量和鬼形成。同样重要的是完全溶解在LCM的缓冲区收获细胞沉淀（步骤3.2），采取以下的提取步骤的充分利用;已冻结在前面的步骤，如果细胞沉淀，再悬浮需要更多的时间和照顾。轻微的程序细节以及影响DNA产量。步骤3和4就可以进行，而无需使用冷冻解决方案，并保持在冰上所有的管子，DNA的鬼影的成功率要高得多，所用试剂均为保冷。同样，解决方案，随着时间的推移下降，并因此将它添加到LCM的解决方案，使用前优化其还原能力，提高蛋白质的破坏和增加DNA的产量和鬼形成的β-巯基乙醇的稳定。仔细注意这些细节，将提高输出高质量的病毒DNA。
由于病毒的DNA是粘性的，最终的解决方案可以是异构的。允许更多的时间从玻璃钩再悬浮增加了有用的DNA产量和提高解决方案的同质性。标准光度法可用于定量DNA产量和纯度。 DNA荧光提供更精确的DNA产量的措施（如Invitrogen公司PicoGreen dsDNA抗体染色）。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
作者欣赏，莉萨彭慕兰格雷格史密斯，马特 - 莱曼，Marlies埃尔德里奇，Halina Staniszewska Goraczniak和Enquist实验室成员在本议定书微调的贡献。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Freon (1,1,2-trichloro-1,2,2-trifluor–thane) | Fisher Scientific | T178-4 | Check with your institution for guidelines on appropriate disposal of Freon-containing waste, or see Mendez et al. for potential Freon alternatives.9 |
| Phase lock gel tubes, Heavy 15ml capacity | 5 PRIME | 2302850 | Optional |
| Polyallomer ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter Inc. | 331372* | *Select tubes appropriate for your own ultracentrifuge; these are included as an example only |
| NP-40 / IGEPAL | Sigma-Aldrich | I-3021 | |
| PK-15 cells | ATCC | CCL-33 | |
| Vero cells | ATCC | CCL-81 | |
| PBS | Hyclone | SH30028.03 |
References
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