En metod för att uppskatta affinitetskonstant av en agonist för den aktiva staten (<em> K<sub> B</sub</em>) I ett G-protein-kopplade receptorer beskrivs. Analysen ger absolut eller relativt mått på<em> K<sub> B</sub</em> Beroende på om konstitutiv aktivering av receptorn är mätbara. Vår metod gäller olika svar nedströms aktivering av receptorn.
När en agonist aktiverar en population av G-protein-kopplade receptorer (GPCRs), framkallar det en signalväg som kulminerar i ett svar från de celler eller vävnader. Denna process kan analyseras på samma nivå som en enda receptor, en befolkning av receptorer, eller nedströms svar. Här beskriver vi hur man kan analysera nedströms svar för att få en uppskattning av agonist affinitet konstant för det aktiva tillståndet av enstaka receptorer.
Receptorer beter sig som quantal växlar som växlar mellan aktiva och inaktiva stater (Figur 1). Den aktiva staten interagerar med specifika G-proteiner eller andra signalsystem partner. I avsaknad av ligander, dominerar inaktiva tillstånd. Bindningen av agonist ökar sannolikheten för att receptorn växlar till aktivt läge eftersom dess affinitet konstant för det aktiva tillståndet (K b) är mycket större än för den inaktiva staten (K a). Den summering avslumpmässiga utgångar av alla de receptorer i befolkningen ger en konstant nivå av aktivering av receptorn i tid. Den ömsesidiga av koncentrationen av agonist utlösande halv-maximal aktivering av receptorn motsvarar den observerade affinitet konstant (K OBS), och andelen agonist-receptor komplex i den aktiva staten definieras som effekt (ε) (Figur 2).
Metoder för att analysera nedströms svar GPCRs har utvecklats som gör det möjligt för uppskattning av K-obs och relativa effekten av en agonist 1,2. I denna rapport visar vi hur du ändrar denna analys för att uppskatta agonist k B värde i förhållande till en annan agonist. För analyser som uppvisar konstituerande aktivitet visar vi hur man kan beräkna k B i absoluta enheter av M -1.
Vår metod för att analysera agonist koncentration-respons-kurvor 3,4 bestårav de globala icke-linjär regression med verksamhetsmodellen 5. Vi beskriver ett förfarande med hjälp av programmet, Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA). Analysen ger en uppskattning av produkten av K-obs och en parameter proportionell effekt (τ). Uppskattningen av τK obs av en agonist, delat med en annan, är ett relativt mått på K b (RA i) 6. För alla receptorn uppvisar konstitutiv aktivitet är det möjligt att skatta en parameter i proportion till effekten av den fria receptor komplex (τ sys). I det här fallet är K b värdet av en agonist motsvarande τK obs / τ SYS 3.
Vår metod är användbar för att bestämma selektiviteten hos en agonist för receptor subtyper och för att kvantifiera agonist-receptor signalering genom olika G-proteiner.
Eftersom vår metod för att uppskatta RA i (relativ K B-värdet) kräver endast mätning av agonist koncentration-respons-kurvor, kan vår analys göras när som helst dessa kurvor mäts.
Om dag till dag variation i svaret från den experimentella preparat (t.ex. celler eller vävnader) är stor, kan svaret mätningar av koncentration-respons-kurvan normaliseras i förhållande till "toppen" uppskattning av standard-agonist för varje dag ex…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av en National Institutes of Health Grant GM 69.829.