Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

قياس نشاط ناهض في مستقبلات البروتين يقترن G

doi: 10.3791/3179 Published: December 26, 2011

Summary

وهناك طريقة لتقدير تقارب مستمر لناهض للدولة النشط (

Abstract

عندما ناهض ينشط عدد سكانها مستقبلات البروتين يقترن G (GPCRs) ، فإنه يثير مسارا يشير إلى أن يتوج في استجابة الخلايا او الانسجة. ويمكن تحليل هذه العملية على مستوى واحد من مستقبلات ، بلغ عدد السكان المستقبلات ، أو استجابة المصب. هنا نحن تصف كيفية تحليل استجابة المتلقين للحصول على تقدير للتقارب ناهض المستمر للحالة نشطة من المستقبلات واحدة.

مستقبلات تتصرف كما أن تبديل كمي بالتناوب بين الدول النشطة وغير النشطة (الشكل 1). في حالة نشطة تتفاعل مع بروتينات معينة أو مجموعة الشركاء الآخرين في الإشارة. في غياب يغاندس ، وتسود حالة غير نشطة. الربط من ناهض يزيد من احتمال أن مستقبلات ستتحول الى حالة نشطة بسبب التقارب المستمر للحالة نشطة (K ب) هو أكبر بكثير من تلك التي للدولة غير نشطة (K أ). وخلاصة للالنواتج عشوائية من جميع المستقبلات في غلة السكان على مستوى ثابت من تفعيل مستقبلات في الوقت المناسب. والمتبادل للتركيز ناهض انتزاع نصف القصوى تنشيط مستقبلات تعادل ثابت لوحظ تقارب (K OBS) ، ويتم تعريف جزء من ناهض مستقبلات المجمعات في حالة نشطة وفعالية (ε) (الشكل 2).

وقد تم تطوير أساليب لتحليل استجابات المتلقين من GPCRs التي تمكن من تقدير K OBS والكفاءة النسبية ل1،2 ناهض. في هذا التقرير ، وتبين لنا كيفية تعديل هذا التحليل لتقدير القيمة النسبية ناهض ب K إلى أن من آخر ناهض. لفحوصات الذي يحمل النشاط التأسيسية ، وتبين لنا كيفية تقدير ب K في وحدات مطلقة من -1 م.

لدينا وسيلة لتحليل ناهض التركيز على الاستجابة منحنيات 3،4 يتكونمن الانحدار غير الخطية العالمية باستخدام نموذج تشغيلي 5. نحن تصف الإجراء باستخدام البرنامج التطبيقي ، بريزم (GraphPad برمجيات ، وشركة سان دييغو ، كاليفورنيا). تحليل الغلة تقديرا لنتاج K OBS ومعلمة تتناسب مع فعالية (τ). تقدير τK OBS واحد ناهض ، مقسوما على آخر ، هو قياس نسبي لب K (RA ط) 6. عن أي نشاط مستقبلات المعرض التأسيسي ، فمن الممكن لتقدير معلمة تتناسب مع فعالية مستقبلات معقدة الحرة SYS). في هذه الحالة ، القيمة ب K من ناهض ما يعادل τK OBS / τ SYS 3.

لدينا وسيلة مفيدة لتحديد الانتقائية لمستقبلات ناهض لفرعية لقياس وناهض مستقبلات إشارات من خلال مجموعة من البروتينات المختلفة.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. قياس تركيز منحنيات الاستجابة ناهض : أي نشاط التأسيسية

  1. لتقدير القيم النسبية ناهض ب K (RA ط) ، لا بد من سلسلة من اثنين على الأقل من منحنيات التركيز على الاستجابة ناهض. ويمكن قياس أي في الفحص المختبري للاستجابة وظيفية لتوفير النوع من الاختزال التي يمكن السيطرة عليها تركيز ناهض ونوع واحد من مستقبلات يتوسط الاستجابة. مناسبة الخلية المستندة إلى فحوصات تشمل قياس 4،7 في مخيم وتراكم inositolphosphate 8،9 في خط الخلية تعبر عن مستقبلات المؤتلف. أمثلة على المقايسات الأنسجة كلها تتضمن قياس تقلص العضلات الملساء أو 10 م 2 ومستقبلات المسكارينية β 1 - الأدرينية بوساطة التغيرات في الانكماش من فئران الحقول ، حفزت الأذين الأيسر 11.
  2. اختيار سلسلة من منبهات للتحليل بما في ذلك ناهض فعالة للغاية(على سبيل المثال ، يجند الذاتية). في تجربة معينة ، وقياس تركيز كامل للاستجابة لكل منحنيات ناهض. إذا كان عدد كبير جدا منبهات لاستكمال الفحص في تجربة واحدة ، تقسيم منبهات إلى مجموعات فرعية ، يتألف كل منها من عدد معقول من منبهات لإجراء تجربة واحدة. لكل فرعية ، وقياس منحنى التركيز على الاستجابة لناهض فعال للغاية مع تلك التي منبهات أخرى في فرعية (انظر الشكل 3). تكرار التجربة على كل مجموعة فرعية 3-6 مرات ، تقريبا ، تبعا لتباين البيانات.
  3. لكل منحنى التركيز على الاستجابة ، وقياس استجابة في غياب ناهض (الاستجابة القاعدية) ، وفي وجود زيادة تركيزات ناهض مساحة تركيزات ناهض موحد على نطاق وسجل تقريبا كل 0،3-0،7 سجل 10 وحدة ، تغطي مجموعة من الاستجابات وتحديد الاستجابة القصوى (E ماكس) (انظر الشكل 3). لexperimالوالدان على خطوط الخلية ، ويتم قياس كل من ثلاث نسخ.
  4. طرح استجابة القاعدية من أن يقاس بحضور كل تركيز ناهض. حسبت الاستجابات المرسومة في الشكل (3) في هذه الطريقة.

2. التحليل الأولي من المنحنيات التركيز على الاستجابة ناهض : أي نشاط التأسيسية

  1. إدخال البيانات من خلال تجارب التركيز على الاستجابة (على سبيل المثال ، الشكل 5) في جدول بيانات في المنشور. ودخلت كل من ناهض سجل تركيزات تحت العمود المسمى X. يتم إدخال قياسات استجابة لناهض الذي يظهر أن يكون الحد الأقصى أكبر قيمة في العمود E A ، ويتم إدخال تلك لناهض أخرى إلى الأعمدة بالحروف المجاورة. يتم إدخال قياسات تكرار لمنحنيات التركيز على الاستجابة إلى أعمدة الفرعية عمود معين بالحروف.
  2. حدد ورقة الرسم البياني الذي يتم رسم البيانات ، وتحليل البيانات عن طريق تحليل الانحدار غير الخطية باستخدامالمعادلة بعنوان السجل (ناهض) في مقابل الاستجابة -- المنحدر المتغير (أربع معلمات). تقييد "أسفل" المعلمة إلى الصفر ، وإجراء تحليل الانحدار. نسخ "الأعلى" (E كحد أقصى) ، وسجل EC 50 معلمات في جدول بيانات Excel لاستخدامها في حساب التقديرات الأولية المعلمة. وعينت ناهض مع التقدير E أكبر ماكس باسم "ناهض القياسية" ، في حين عينت منبهات أخرى ك "منبهات اختبار".
  3. حساب التقديرات الأولية لτK سجل OBS (LOGR1) كقيمة سلبية سجل 50 من المفوضية الأوروبية الموحدة ناهض (- EC سجل 50 ').

    حساب التقديرات الأولية لRA سجل ط قيمة كل اختبار ناهض (LOGRA) كما سجل {(EC الأعلى * 50 ') / (الأعلى' * EC 50)} ، الذي يتم الرمز المعلمات من ناهض القياسية مع الفاصلة .

    حساب سجل تقارب يخدعstants للمنبهات الاختبار (LOGK2 -- LOGK5) وسجل كل منهما السلبية للقيم 50 EC.

3. تقدير القيم الراي ناهض باستخدام تحليل الانحدار غير الخطية : أي نشاط التأسيسية

  1. إدخال البيانات في جدول البيانات في بريزم على النحو الموصوف أعلاه تحت 2.1. تأكد من أن يتم إدخال البيانات لناهض قياسية في العمود A.
  2. إدخال المعرفة المعادلة ، "سجل راي" ، في منشور على عدة أسطر كما هو موضح في القضية التي تنطوي على ما مجموعه خمسة منبهات :
    • <A>P = LOGK1
    • س = <A>LOGR
    • <~ A> = س + LOGR LOGRA
    • <B>P = LOGK2
    • <C>P = LOGK3
    • <D>P = LOGK4
    • <E>P = LOGK5
    • Y = Msys / (1 + {[(1 +10 ^ (X + P)) / (10 ^ (س + س))] ^ م})
  3. أدخل المعلمة التقديرات الأولية كما يلي :
    إدخال قيمة منخفضة بشكل تعسفي من 0 للتسجيل المستمر تقارب (LOGK1) من ناهض القياسية.

    أدخل التقدير الأولي للLOGR والثوابت تقارب (LOGK2 -- LOGK5) وسجل راي القيم (LOGRA) من منبهات الاختبار.

    تعيين التقدير الأولي للمحول عامل الانحدار (M) بقيمة 1.0.

    تعيين التقديرات الأولية للاستجابة القصوى للنظام (Msys) أي ما يعادل قيمة إلى أقصى الحدود هاء من ناهض القياسية (الأعلى ").
  4. تطبيق القيود المعلمة التالية : LOGK1 مقيدة إلى 0 ، ثابت ؛ LOGR1 ، Msys والرصد ، والقيمة المشتركة لجميع مجموعات البيانات ؛ LOGK2 -- LOGK5 وLOGRA ، دون أي قيود.
  5. الشروع في تحليل الانحدار غير الخطية. نتائج العائد K سجل OBS وسجل RA ط قيم ناهضات الاختبار. إذا كان المعيار هو ناهض ناهض كاملة ، ثم سجل كل من K OBS وسجل القيم RA ط دقيقة. إذا كان ناهض الأكثر فعالية (ناهض قياسي) هو في الواقع ناهض جزئي ، ثم K OBS قيم آغ أكثر فعاليةقد تكون المبالغة onists. ومع ذلك ، فإن تقديرات RA سجل ط لا يزال دقيقا في هذه الحالة.
  6. إذا لم تتقارب الانحدار ، قد ترغب في المؤامرة المجرب منحنى النظرية التي تحددها المعلمة التقديرات الأولية. إذا كانت هناك انحرافات كبيرة بين نقاط البيانات والمنحنيات النظرية ، والتحقق من حساب التقديرات الأولية المعلمة. إذا واحد أو أكثر من منبهات البريد أقصى القيم يعادل ذلك من ناهض القياسية ، قد يكون من الضروري تقييد K لهم سجل OBS القيم إلى 0 للانحدار لتلتقي على حل.

4. قياس تركيز منحنيات الاستجابة ناهض في الخلية المقايسات مقرها العارضة التأسيسية نشاط مستقبلات

  1. لتقدير القيم ناهض ب K في وحدات المطلقة M -1 ، الخلية التي يوجد مقرها في فحوصات المختبر وتستخدم هذا النشاط يحمل مستقبلات التأسيسية. Constituيتم تعريف نشاط مستقبلات tive مثل زيادة استجابة فوق مستوى القاعدية بسبب التعبير عن مستقبلات المصالح.
  2. ناهضات اختيار وتصميم التجربة على النحو الموصوف أعلاه في القسم 1.2.
  3. لكل منحنى التركيز على الاستجابة ، وقياس استجابة في غياب ناهض في خلايا غير transfected (الاستجابة القاعدية) في الخلايا وtransfected مع مستقبلات الفائدة (+ القاعدية استجابة استجابة التأسيسية). قياس استجابة في وجود تركيزات مختلفة من منبهات مختلفة كما هو موضح أعلاه في القسم 1.3.
  4. حساب التأسيسية نشاط مستقبلات وردا على تركيز كل ناهض باعتبارها استجابة قياس ناقص في الخلايا القاعدية استجابة لا transfected مع مستقبلات. ويبين الشكل 6 الردود على منبهات مختلفة تحسب على هذا النحو عن طريق إشارة عارضة النشاط التأسيسية منخفضة جدا.

5. أولي analysis منحنيات الاستجابة للتركيز النشاط ناهض العارضة التأسيسية

  1. إدخال البيانات (على سبيل المثال ، الشكل 6) في جدول بيانات في المنشور كما هو موضح في القسم 3.1 ، ولكن أيضا إدخال الاستجابة الناجمة عن نشاط مستقبلات التأسيسية في الأعمدة المناسبة بالحروف المقابلة لتسجيل تركيز ناهض من -20. يتم إدخال اللوغاريتم سلبية كبيرة لتقريب تركيز ناهض an صفر.
  2. تحليل البيانات كما هو موضح أعلاه في القسم 2.2 ، ولكن مع "القاع" المعلمة مقيدة بحيث يتم ذلك "المشتركة لجميع مجموعات البيانات." نسخ "الأعلى" (E بحد أقصى) ، وتقاسم "القاع" وسجل EC50 المعلمات في جدول بيانات Excel لاستخدامها في حساب التقديرات الأولية المعلمة.
  3. حساب التقديرات الأولية المعلمة على النحو التالي :

    يجب تحديد سجل تقارب المستمر لناهض القياسية (LOGK1) أو أي اختبار كامل ناهض ، في تجارب منفصلة كما هو موضح سابقا 3
    حساب التقديرات الأولية لسجل K OBS قيمة كل اختبار ناهض جزئي (أي LOGK2 فقط في هذه الحالة) ، وسجل {(Top' - الأعلى) / (EC 50 (Top' القاع))} ، حيث "القاع "تدل على الاستجابة الناجمة عن تنشيط مستقبلات التأسيسية.

    حساب التقديرات الأولية لسجل ك ب (LOGKb) لكل ناهض كما سجل {الأعلى / (EC 50 القاع)}.

    حساب التقديرات الأولية لسجل τ SYS (LOGTsys) كما سجل {أسفل / ('أعلى -- أسفل)}.

6. تقدير القيم كيلو بايت ناهض المعرض التأسيسي لاستجابات نشاط مستقبلات باستخدام تحليل الانحدار غير الخطية

  1. إدخال البيانات في جدول البيانات في بريزم على النحو الموصوف أعلاه تحت 3.1
  2. إدخال المعرفة المعادلة ، "تسجيل الدخول ك" ، في منشور على عدة أسطر كما هو مبين لحالة اثنين منبهات :
    • <A>LOGKOBS = LOGK1
    • <B>LOGKOBS = LOGK2
    • A = (10 ^ (X + LOGKOBS)) +1
    • B = 10 ^ (X + + LOGTSYS LOGKB)
    • C = (10 ^ (LOGTSYS))
    • Y = Msys / {1 + [(A / (B + C)) ^ M]}
  3. أدخل المعلمة التقديرات الأولية كما يلي :

    أدخل كل الثوابت تقارب ناهض (LOGK1 -- أدخل القيمة المحددة بموجب الخطوة 5.3).

    أدخل K OBS تقديرات ناهض كل اختبار.

    أدخل تقديرات كيلو بايت للمنبهات.

    سجل دخول τ SYS (LOGTsys) تقدير.

    تعيين عامل منحدر محول (M) والاستجابة القصوى للنظام (Msys) قيم 1.0 و 'الأعلى (E أقصى من ناهض قياسي) ، على التوالي.
  4. تطبيق القيود المعلمة التالية : LOGTsys ، Msys و M ، والقيمة المشتركة لجميع مجموعات البيانات ؛ LOGK2 وLOGKb ، دون أي قيود.
  5. الشروع في تحليل الانحدار غير الخطية. نتائج تسفر عن تسجيل K (ب) من ناهض القياسية ، وسجل K OBS ب K القيم من منبهات جزئية ، والاستجابة القصوى للنظام (Msys) ، وقيمة SYS τ للمجمع مستقبلات الحرة (LOGTsys) ، ومعامل الانحدار محول في نموذج تشغيلي (M).
  6. إذا لم تتقارب الانحدار ، اتبع الخطوات المذكورة أعلاه تحت النقطة 3.6.

7. ممثل النتائج

الشكل 5 يوضح بعض البيانات المتوفرة لدينا تنطبق على التحلل فسفوإينوزيتيد المسكارينية ناهض التي يسببها في خلايا مبيض الهامستر الصيني معربا عن ستابلي مستقبلات المسكارينية 12 م 3. تم قياس تركيز منحنيات الاستجابة للمنبهات المسكارينية المحدد في هذا الاختبار. وقد تم تحليل البيانات على النحو الموصوف أعلاه تحت الباب 3 لتقدير قيمة ب K كل ناهض ، أعرب النسبي لتلك التي oxotremorine - M. هذه التقديرات RA سجل ط هي ، كرباكول ، -0.56 ± 0.063 ؛ arecoالخط ، -0.60 ± 0.074 ؛ بيلوكاربين ، -1.20 ± 0.15 ، وMCN - A - 343 ، -1.92 ± 0.31. المنحنيات النظرية تمثل تناسب المربعات الصغرى لمعادلة الانحدار للبيانات (القسم 3.2). كانت التقديرات المقابلة من الاستجابة القصوى للنظام (M SYS) ، وعامل منحدر محول (M) 53.9 ± 1.3 و 1.15 ± 0.09 ، على التوالي. وسجل K OBS قيم منبهات ، إلا أنه من oxotremorine - M كانت ، كرباكول ، 5.19 ± 0.14 ؛ أريكولين ، 5.49 ± 0.12 ؛ بيلوكاربين ، 5.58 ± 0.16 وMCN - A - 343 ، 5.27 ± 0.33.

الشكل 6 يبين نتائج تجارب على التحلل المسكارينية فسفوإينوزيتيد ناهض - 293 حفز خلايا في كلوة الجنين البشري معربا عن ستابلي α15 G 3. تسبب التعبير عابرة للمستقبلات المسكارينية 3 M زيادة في التحلل فسفوإينوزيتيد القاعدية ، الذي ينسب إلى أكتيف مستقبلات التأسيسيةإيتي. وقد تم تحليل البيانات لتقدير القيم سجل K ب من oxotremorine - M - A وMCN 343 كما هو موضح تحت القسم 6. أثمر هذا التحليل سجل K من القيم ب 8.30 ± 0.59 و 6.59 ± 0.77 لoxotremorine - M - A وMCN 343 ، على التوالي. المنحنيات النظرية تمثل تناسب المربعات الصغرى لمعادلة الانحدار للبيانات (انظر القسم 6.2). وكانت تقديرات سجل τ SYS ، SYS M و M -2.29 ± 0.59 ، 95.8 ± 2.8 و 0.72 ± 0.08 ، على التوالي. وتقديرا لK OBS كانت قيمة MCN 343 - A 5.35 ± 0.46.

الشكل 1
الشكل 1 : العلاقة بين النشاط مستقبل واحد وعلى مستوى متوسط ​​من تفعيل مستقبلات السكان. نشاط مستقبلات واحدة ، السلوك النظري لمستقبل واحد يمر transitioويرد نانوثانية بين النشط (في) وغير نشط (إيقاف) ولايات في وجود ناهض. يتم الرمز الثوابت تقارب من ناهض للدول النشطة وغير النشطة التي كتبها ب K و K ، على التوالي. يظهر سلوك السكان ، والسلوك النظري للمستقبلات عدة تحولات عشوائي بين الدول النشطة وغير النشطة في وجود ناهض. السكان متوسط ​​، يظهر متوسط ​​مستوى تنشيط مستقبلات في عدد السكان من المستقبلات في وجود تركيز محدد من ناهض. ومن المعروف على مستوى تفعيل مستقبلات السكان كما التحفيز.

الشكل 2
الشكل 2. العلاقة بين مستقبلات وظيفة التنشيط وفعالية (ε) ، ولاحظ ثابتة تقارب (K OBS) من متوسط ​​ناهض. السكان ، ومتوسط ​​المستوىتنشيط مستقبلات التي تسببها زيادة تركيزات ناهض هو مبين. تنشيط مستقبلات ، هو تآمر على مستوى متوسط ​​من تفعيل مستقبلات ناهض تركيز سجل لناهض. تركيز السجل السلبي للناهض اللازمة لتنشيط مستقبلات نصف أقصى ما يعادل سجل وحظ تقارب المستمر لناهض (K سجل OBS). هو الرمز الحد الأقصى للمستقبلات وظيفة التنشيط ونجاعتها (ε).

الشكل 3
الشكل 3 أمثلة على التركيز والاستجابة منحنيات لتحفيز تراكم [H 3] inositolphosphate بواسطة مستقبلات المسكارينية في مختلف خلايا مبيض الهامستر الصيني معربا عن الإنسان مستقبلات المسكارينية م 3. تم قياس ما مجموعه تسعة منحنيات التركيز على الاستجابة ناهض. ويمكن تقسيم هذه التجربة إلى قسمين. لكل جزء ، وناهض القياسية (oxotremorinم) هو اختبار دائما مع منبهات إضافية. وهكذا ، تجربتين من النوع هو موضح في البندين أ و ب مطلوبة لقياس منحنيات التركيز على الاستجابة لتسعة ناهضات إذا كان يمكن يعاير سوى خمس منبهات في وقت واحد. البيانات هي من Ehlert وآخرون 12.

الشكل 4
الشكل 4. أمثلة من التركيز على الاستجابة لمنحنيات تحفيز تراكم [H 3] inositolphosphate بواسطة منبهات مختلفة في الخلايا المسكارينية 293 كلوة الجنين البشري معربا عن الإنسان مستقبلات المسكارينية م 2 و G α15. تسبب التعبير عن مستقبلات 2 م لمدة 30 -- 35 ٪ [3 H] inositolphosphate ردا على ذلك ، الذي ينسب إلى نشاط مستقبلات التأسيسية. البيانات هي من Ehlert وآخرون 12.

الشكل 5
الشكل 5. 3. تظهر منحنيات التركيز على الاستجابة لمنبهات المسكارينية المختارة لتحفيز التحلل فسفوإينوزيتيد. يعني القيم من ثلاث تجارب تظهر ± SEM. البيانات هي من Ehlert وآخرون 12.

الشكل 6
الشكل 6. Oxotremorine - M وMCN - A - 343 بوساطة التحلل في الخلايا فسفوإينوزيتيد 293 كلوة الجنين البشري معربا عن G α15 ومستقبلات المسكارينية م 3. وأعرب عن فسفوإينوزيتيد المائي النسبية إلى أقصى الحدود من oxotremorine E - M. في غياب ناهض ، عزا فسفوإينوزيتيد المائي ويتم التعبير عن مستقبلات 3 M تمثل حوالي 2 ٪ من الاستجابة. وتظهر وسائل ثلاثة ± SEM التجارب. دآتا هم من Ehlert وآخرون. 3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

لأن لدينا وسيلة لتقدير RA ط (القيمة النسبية ب K) لا يتطلب سوى قياس منحنيات التركيز على الاستجابة ناهض ، يمكن القيام به في أي وقت تحليلنا تقاس هذه المنحنيات.

إذا يوما بعد يوم الاختلاف في الاستجابة لإعداد التجريبية (مثل الخلايا أو الأنسجة) كبيرة ، لا يمكن تطبيع القياسات استجابة كل منحنى التركيز على الاستجابة النسبية لتقدير "أفضل" من ناهض موحدة لكل يوم التجربة. ويقدر تقديرا أعلى والمفوضية الأوروبية سجل 50 لكل منحنى التركيز على الاستجابة لتكرار ناهض القياسية من خلال تحليل الانحدار كما هو موضح في القسمين 2 و 5. تم تطبيع القيم استجابة لجميع منحنيات التركيز على الاستجابة ناهض في يوم معين بالنسبة لتقدير أعلى من مستوى ناهض لذلك اليوم. ثم يتم تحليل هذه البيانات تطبيع كما هو موضح أعلاه beginnجي في القسم 3.

دقة تقدير K ب يعتمد على تقدير دقيق لنشاط مستقبلات التأسيسية. في حالتنا ، تسبب ترنسفكأيشن من مستقبلات 3 M 293 كلوة الجنين البشري في الخلايا زيادة في التحلل فسفوإينوزيتيد التي تراوحت من حوالي 500 -- 1000 نسخة في الدقيقة من [3 ه] inositolphosphates يقاس في وجود من الليثيوم في الخلايا ما قبل المسمى مع اينوزيتول [3H] . كانت الاستجابة القصوى إلى ما يقرب من 50000 كرباكول -- 60000 نسخة في الدقيقة. كان قد تم الاستجابة التأسيسية أكبر حجما وأقل متغير ، وتقدير لدينا من قيم ب K من oxotremorine - M - A وMCN 343 أكثر دقة. تقدير ب K يتوقف أيضا على وجود تقدير دقيق للمحول عامل الانحدار (M) في نموذج تشغيلي. وبالتالي ، كان من الممكن تحقيق مزيد من الدقة إذا كانت متباعدة عن كثب على تركيزات ناهض على النحو الموصى به في إطار الباب 1.3. Runniناهضات إضافية نانوغرام في التجربة أيضا يزيد كثيرا من دقة تقدير M ، وبالتالي ، من ب ك.

إذا كانت هناك دول نشطة مختلفة من مستقبلات هذه الإشارة من خلال اقتران بروتينات مختلفة (على سبيل المثال ، البروتينات G) ، ثم لدينا وسيلة لتحليل يوفر تقدير دقيق لناهض K ب ط RA والقيم لكل مسار المستجيب 3،6. إذا كان أكثر من دولة واحدة نشطة تساهم في رد واحد قياسه ، ثم أسلوبنا في تقدير وRA ط ب K يمثل المتوسط ​​المرجح للدول النشطة مختلفة تبعا الوفرة النسبية والنشاط 3.

يمكن أن يتسبب النشاط التأسيسية مستقبلات أكثر من التعبير عن النوع من الاختزال والبروتين فيها 13 G التكميلية. هذا التغيير قد لوحظ تقارب وفعالية مجمع ناهض مستقبلات ويمكن أن يتسبب عدم عhysiological الإشارة. لكن التغيرات في طبيعة الرد ويلاحظ تقارب وفعالية مستقبلات السكان لا تنطوي على تغييرات في الدول كمي الأساسية للمستقبل ، فقط تغيير في عددها واحتمال ايزوميرة. وهكذا ، والبروتينات G ليست الكثير من العوامل من آثار المخدرات بقدر ما هو نافذة على الدول المستجيب انتقائية مختلفة من المستقبلات. إذا تم تطبيق أسلوب التحليل لدينا المقايسات GPCR إشارات محددة تنطوي على المستجيب واحد (على سبيل المثال ، G البروتين) ينبغي أن يكون من الممكن قياس ناهض K ب قيم المستجيب انتقائية دول مستقبلة -- المقياس النهائي لالتحيز ناهض.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح جنرال موتورز 69829.

References

  1. Stephenson, R. P. A modification of receptor theory. British Journal of Pharmacology. 11, 379-393 (1956).
  2. Furchgott, R. F. The use of b-haloalkylamines in the differentiation of receptors and in the determination of dissociation constants of receptor-agonist complexes. Advances in Drug Research. 3, 21-55 (1966).
  3. Ehlert, F. J., Suga, H., Griffin, M. T. Analysis of agonism and inverse agonism in functional assays with constitutive activity: Estimation of orthosteric ligand affinity constants for active and inactive receptor states. J. Pharmacol. Exp. Ther. 33, 671-686 (2011).
  4. Griffin, M. T., Figueroa, K. W., Liller, S., Ehlert, F. J. Estimation of Agonist Activity at G Protein-Coupled Receptors: Analysis of M2 Muscarinic Receptor Signaling through Gi/o,Gs, and G15. J. Pharmacol. Exp. Ther. 321, 1193-1207 (2007).
  5. Black, J. W., Leff, P. Operational models of pharmacological agonism. Proceedings of the Royal Society of LondonSeries B: Biological Sciences. 220, 141-162 (1983).
  6. Tran, J. A., Chang, A., Matsui, M., Ehlert, F. J. Estimation of relative microscopic affinity constants of agonists for the active state of the receptor in functional studies on M2 and M3 muscarinic receptors. Mol. Pharmacol. 75, 381-396 (2009).
  7. Schultz, J., Hamprecht, B., Daly, J. W. Accumulation of adenosine 3':5'-cyclic monophosphate in clonal glial cells: labeling of intracellular adenine nucleotides with radioactive adenine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 69, 1266-1270 (1972).
  8. Berridge, M. J., Downes, C. P., Hanley, M. R. Lithium amplifies agonist-dependent phosphatidylinositol responses in brain and salivary glands. Biochemical Journal. 206, 587-595 (1982).
  9. Kendall, D. A., Hill, S. J. Methods in Neurotransmitter Receptor Analysis. Raven Press. Yamamura, H.I. 68-87 (1990).
  10. Pulido-Rios, M. Vitro Isolated Tissue Functional Muscarinic Receptor Assays. Current Protocols in Pharmacology. 48, 4-15 (2010).
  11. Kenakin, T. Current Protocols in Pharmacology. Enna, S. J. John Wiley & Sons. (2001).
  12. Ehlert, F. J., Griffin, M. T., Sawyer, G. W., Bailon, R. A. simple method for estimation of agonist activity at receptor subtypes: comparison of native and cloned M3 muscarinic receptors in guinea pig ileum and transfected cells. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 289, 981-992 (1999).
  13. Burstein, E. S., Spalding, T. A., Brann, M. R. Pharmacology of muscarinic receptor subtypes constitutively activated by G proteins. Mol. Pharmacol. 51, 312-319 (1997).
قياس نشاط ناهض في مستقبلات البروتين يقترن G
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Ehlert, F. J., Suga, H., Griffin, M. T. Quantifying Agonist Activity at G Protein-coupled Receptors. J. Vis. Exp. (58), e3179, doi:10.3791/3179 (2011).More

Ehlert, F. J., Suga, H., Griffin, M. T. Quantifying Agonist Activity at G Protein-coupled Receptors. J. Vis. Exp. (58), e3179, doi:10.3791/3179 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter