Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Quantificare attività agonista a G recettori accoppiati alla proteina

doi: 10.3791/3179 Published: December 26, 2011

Summary

Un metodo per la stima della costante di affinità di un agonista per lo stato attivo (

Abstract

Quando un agonista attiva una popolazione di G recettori accoppiati alla proteina (GPCR), suscita una via di segnalazione che culmina nella risposta della cellula o tessuto. Questo processo può essere analizzato a livello di un solo recettore, una popolazione di recettori, o una risposta a valle. Qui descriviamo come analizzare la risposta a valle di ottenere una stima della costante di affinità agonista per lo stato attivo di singoli recettori.

Recettori si comportano come interruttori quantica che si alternano tra gli stati attivi e inattivi (Figura 1). Lo stato attivo interagisce con le proteine ​​G specifiche o altri partner di segnalazione. In assenza di ligandi, lo stato inattivo predomina. Il legame di agonista aumenta la probabilità che il recettore passerà nello stato attivo, perché la sua affinità costante per lo stato attivo (K b) è molto maggiore di quella per lo stato inattivo (K a). La somma deiuscite casuale di tutti i recettori della popolazione produce un costante livello di attivazione dei recettori nel tempo. Il reciproco della concentrazione di agonista suscitando mezza massimo l'attivazione del recettore è equivalente alla costante osservato affinità (K obs), e la frazione di agonista dei recettori complessi nello stato attivo è definita come efficacia (ε) (Figura 2).

Metodi per l'analisi delle risposte a valle di GPCR sono stati sviluppati che permettono la stima della K oss e l'efficacia relativa di un 1,2 agonista. In questo rapporto, si mostra come modificare questa analisi per stimare il valore agonista K b rispetto a quello di un altro agonista. Per i saggi che mostrano l'attività costitutiva, mostriamo come stimare K b in unità assolute di M -1.

Il nostro metodo di analisi agonista curve concentrazione-risposta 3,4 è costituitoglobale di regressione lineare utilizzando il modello operativo 5. Abbiamo descritto una procedura utilizzando l'applicazione software, Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA). L'analisi produce una stima del prodotto di K obs e un parametro proporzionale alla efficacia (τ). La stima del τK obs di un agonista, divise da quella di un altro, è una misura relativa di K b (RA i) 6. Per qualsiasi attività costitutiva del recettore espositrici, è possibile stimare un parametro proporzionale alla efficacia del complesso recettore libero sys). In questo caso, il valore K b di un agonista è equivalente a τK obs / τ sistema 3.

Il nostro metodo è utile per valutare la selettività di un agonista per i sottotipi del recettore per la quantificazione e agonista dei recettori segnalazione attraverso diverse proteine ​​G.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Misura della agonista curve concentrazione-risposta: nessuna attività costitutiva

  1. Per la stima dei relativi valori agonista K b (RA i), una serie di almeno due agonista curve concentrazione-risposta è necessaria. Qualsiasi test in vitro per la risposta funzionale di un GPCR può essere misurata a condizione che la concentrazione di agonista può essere controllato e un solo tipo di recettore della risposta media. Adatto saggi cellulari includono la misurazione del cAMP 4,7 e l'accumulo inositolphosphate 8,9 in una linea cellulare che esprime un recettore ricombinante. Esempi di analisi del tessuto intero includono la misurazione della contrazione della muscolatura liscia 10 o M 2 recettori muscarinici e β-1-adrenergico mediato cambiamenti nella contrazione del campo-ratto stimolato sinistra dell'atrio 11.
  2. Scegli una serie di agonisti per l'analisi tra cui un agonista altamente efficace(Ad esempio, ligando endogeno). In un dato esperimento, misura completa curve concentrazione-risposta per ogni agonista. Se il numero degli agonisti è troppo grande per completare il test in un singolo esperimento, dividere gli agonisti in sottogruppi, ognuno composto da un numero gestibile di agonisti per un singolo esperimento. Per ogni sottogruppo, misurare la curva concentrazione-risposta di un agonista altamente efficace insieme a quelli degli altri agonisti nel sottogruppo (vedi figura 3). Ripetere l'esperimento per ogni sottogruppo 3-6 volte, circa, a seconda della variabilità dei dati.
  3. Per ogni curva concentrazione-risposta, misurare la risposta in assenza di agonista (risposta basale), e in presenza di concentrazioni crescenti di agonista. Spazio le concentrazioni agonista uniformemente su scala logaritmica circa ogni 0,3-0,7 log 10 unità, che coprono la gamma di risposte e definire la risposta massima (E max) (vedi figura 3). Per experimgenitori su linee cellulari, ogni misurazione è fatta in triplice copia.
  4. Sottrarre la risposta basale da quello misurato in presenza di ogni concentrazione di agonista. Le risposte tracciate in figura 3 sono stati calcolati in questo modo.

2. Analisi preliminare di agonista curve concentrazione-risposta: nessuna attività costitutiva

  1. Inserisci i dati della concentrazione-risposta esperimenti (ad esempio, Figura 5) in una tabella dati in Prism. Tutte le concentrazioni di agonista del registro vengono inseriti nella colonna etichettata X. Le misure di risposta per l'agonista che sembra essere il più grande valore massimo e sono entrato in colonna A, e quelli per l'agonista altri sono entrati in colonne adiacenti lettere. Misurazioni ripetute di una concentrazione curve di risposta sono entrato in sub-colonne di una data colonna lettere.
  2. Selezionare il foglio grafico su cui sono tracciati i dati e analizzare i dati mediante analisi di regressione lineare utilizzandol'equazione diritto, log (agonista) vs risposta - pendenza variabile (quattro parametri). Vincolare il parametro "Bottom" a zero, ed eseguire l'analisi di regressione. Copiare il "Top" (E max) e log CE 50 parametri in un foglio Excel per l'utilizzo nel calcolo delle stime dei parametri iniziali. L'agonista con la stima più grande E max è designato come il "agonista standard", mentre gli altri agonisti sono designati come "agonisti di prova".
  3. Calcolare la stima iniziale di log τK obs (LOGR1) come negativo log EC 50 valore del agonista standard (-log CE 50 ').

    Calcolare la stima iniziale della RA log i valore di ogni agonista prova (LOGRA) come log {(* CE Top 50 ') / (Top' * CE 50)}, in cui sono indicati i parametri dei agonista standard con un apostrofo .

    Calcolare il registro affinità constants degli agonisti prova (LOGK2 - LOGK5) come il registro negativo dei rispettivi valori di EC 50.

3. Stima dei valori agonista Rai usando l'analisi di regressione lineare: nessuna attività costitutiva

  1. Inserire i dati in una tabella dati in Prism, come descritto al precedente punto 2.1. Assicurarsi che i dati per l'agonista standard sono inseriti nella colonna A.
  2. Inserisci definita dall'utente equazione, "log Rai", in Prisma su diverse linee, come mostrato per il caso che coinvolge un totale di cinque agonisti:
    • <A> P = LOGK1
    • <A> Q = logr
    • <~ A> Q = logr + LOGRA
    • <B> P = LOGK2
    • <C> P = LOGK3
    • <D> P = LOGK4
    • <E> P = LOGK5
    • Y = MSYS / (1 + {[(1 +10 ^ (X + P)) / (10 ^ (X + Q))]} ^ M)
  3. Inserisci le stime iniziali dei parametri come segue:
    Inserire un valore arbitrariamente basso pari a 0 per la costante affinità log (LOGK1) della agonista standard.

    Inserisci la stima iniziale diLogr e le costanti di affinità (LOGK2 - LOGK5) e registrare i valori Rai (LOGRA) degli agonisti prova.

    Assegnare la stima iniziale del fattore pendenza del trasduttore (M) un valore di 1,0.

    Assegnare la stima iniziale per la risposta massima del sistema (MSYS) un valore equivalente al massimo E della agonista standard (Top ').
  4. Applicare i seguenti vincoli parametro: LOGK1 vincolato al costante, 0; LOGR1, MSYS e M, valore condiviso per tutti i set di dati; LOGK2 - LOGK5 e LOGRA, nessun vincolo.
  5. Avviare l'analisi di regressione lineare. I risultati di rendimento del log K oss e log RA i valori degli agonisti prova. Se l'agonista standard è un agonista completo, quindi il sia il log K oss e registrare i valori di RA sono precisi. Se l'agonista più efficace (agonista standard) è in realtà un agonista parziale, la K oss valori della più efficace agonists può essere sopravvalutato. Tuttavia, le stime di log RA i sono ancora precisi in questa situazione.
  6. Se la regressione non converge, lo sperimentatore potrebbe voler tracciare la curva teorica definita dalla stime dei parametri iniziali. Se ci sono grandi deviazioni tra i punti dati e le curve teoriche, verificare il calcolo delle stime dei parametri iniziali. Se uno o più agonisti E max valori equivalenti a quello della agonista standard, può essere necessario per limitare i loro log K obs valori a 0 per la regressione a convergere su una soluzione.

4. Misura della agonista curve concentrazione-risposta in saggi cellulari espositrici attività costitutiva del recettore

  1. Per la stima dei valori agonista K b in unità assolute di M -1, a base di cellule in vitro sono utilizzati mostrano che l'attività del recettore costitutivo. Costituzionel'attività del recettore tiva è definito come l'aumento della risposta al di sopra del livello basale causato dalla espressione del recettore di interesse.
  2. Scegli agonisti e progettare l'esperimento, come descritto sopra nella sezione 1.2.
  3. Per ogni curva concentrazione-risposta, misurare la risposta in assenza di agonista a non transfettate cellule (risposta basale) e in cellule trasfettate con il recettore di interesse (risposta basale + risposta costitutiva). Misurare la risposta in presenza di differenti concentrazioni di agonisti diversi, come descritto sopra nella sezione 1.3.
  4. Calcolare l'attività costitutiva del recettore e la risposta ad ogni concentrazione di agonista come la risposta misurata meno la risposta basale in cellule non transfettate con il recettore. La Figura 6 illustra le risposte a vari agonisti calcolato in questo modo per una via di segnalazione espone molto bassa attività costitutiva.

5. Preliminare unoANALISI DELLA agonista curve concentrazione-risposta espositrici attività costitutiva

  1. Inserire i dati (ad esempio, Figura 6) in una tabella dati in Prism, come descritto nella sezione 3.1, ma anche inserire la risposta causata da attività costitutiva dei recettori nelle varie colonne lettere corrispondenti ad una concentrazione log agonista di -20. Un grande logaritmo negativo è entrato a ravvicinare una concentrazione agonista pari a zero.
  2. Analizzare i dati come sopra descritto nella sezione 2.2, ma con il parametro "Bottom" costretti in modo che sia "condivisa per tutti i set di dati." Copiare il "Top" (E max), condiviso "Bottom" e accedere EC50 parametri in un foglio Excel per l'utilizzo nel calcolo delle stime dei parametri iniziali.
  3. Calcolare le stime dei parametri iniziali come segue:

    L'affinità log costante del agonista standard (LOGK1) o completa, agonista di prova deve essere determinata in esperimenti separati, come descritto in precedenza 3
    Calcolare la stima iniziale del log K oss valore di ogni agonista prova parziale (cioè solo LOGK2 in questo caso) come log {(Top'-Top) / (CE 50 (Top'-Bottom))}, in cui "Bottom "indica la reazione causata dall'attivazione del recettore costitutivo.

    Calcolare la stima iniziale di log K b (LOGKb) per ogni agonista come log {Top / (EC 50 in basso)}.

    Calcolare la stima iniziale di log τ sistema (LOGTsys) come log {Basso / (Top '- basso)}.

6. Stima dei valori Kb agonista per le risposte esporre l'attività costitutiva del recettore attraverso l'analisi di regressione lineare

  1. Inserire i dati in una tabella dati in Prism come sopra descritto ai punti 3.1
  2. Inserisci definita dall'utente equazione, "Log Kb", in Prisma su diverse linee, come indicato per la condizione di due agonisti:
    • <A> LOGKOBS = LOGK1
    • <B> LOGKOBS = LOGK2
    • A = (10 ^ (X + LOGKOBS)) +1
    • B = 10 ^ (X + + LOGTSYS LOGKB)
    • C = (10 ^ (LOGTSYS))
    • Y = MSYS / {1 + [(A / (B + C)) ^ M]}
  3. Inserisci le stime iniziali dei parametri come segue:

    Inserisci le costanti di affinità di ogni agonista (LOGK1 - inserire un valore determinato dalla fase 5.3).

    Inserisci il K oss stime di ogni agonista prova.

    Inserisci le stime Kb degli agonisti.

    Inserisci log τ sistema (LOGTsys) stima.

    Assegnare il fattore pendenza trasduttore (M) e la risposta massima del sistema (MSYS) i valori di 1,0 e 'superiore (E max del agonista standard), rispettivamente.
  4. Applicare i seguenti vincoli parametro: LOGTsys, MSYS e M, valore condiviso per tutti i set di dati; LOGK2 e LOGKb, nessun vincolo.
  5. Avviare l'analisi di regressione lineare. I risultati di rendimento del log K b della agonisti standard, il log K obs K b della agonisti parziali, e la risposta massima del sistema (MSYS), il valore τ sistema per il complesso recettore libero (LOGTsys), e il fattore pendenza del trasduttore nel modello operativo (M).
  6. Se la regressione non converge, seguire la procedura descritta al precedente punto 3.6.

7. Rappresentante Risultati

La Figura 5 mostra alcuni dei nostri dati precedentemente pubblicati su agonisti muscarinici indotti idrolisi fosfoinositide in cellule ovariche di criceto cinese esprimono stabilmente il recettore M 3 muscarinici 12. Le curve concentrazione-risposta di selezionati agonisti muscarinici sono stati misurati in questo saggio. I dati sono stati analizzati come descritto sopra nella sezione 3 per stimare il valore K b di ogni agonista, ha espresso rispetto a quello di oxotremorine-M. Questi log RA stime i sono, carbacolo, -0,56 ± 0,063; Arecolinea, -0,60 ± 0,074; pilocarpina, -1,20 ± 0,15 e MCN-A-343, -1,92 ± 0,31. Le curve rappresentano il teorico dei minimi quadrati dell'equazione di regressione dei dati (Sezione 3.2). Le stime corrispondenti della risposta massima del sistema (sistema M) e il fattore pendenza del trasduttore (M) erano 53,9 ± 1,3 e 1,15 ± 0,09, rispettivamente. Il registro K oss valori degli agonisti, diversa da quella del oxotremorine-M sono stati, carbacolo, 5,19 ± 0,14; arecolina, 5,49 ± 0,12; pilocarpina, 5,58 ± 0,16 e MCN-A-343, 5,27 ± 0,33.

La Figura 6 illustra i risultati degli esperimenti su agonisti muscarinici idrolisi stimolata fosfoinositide in cellule HEK 293 che esprimono stabilmente G α15 3. Espressione transitoria dei recettori muscarinici 3 M ha causato un aumento di idrolisi fosfoinositide basale, che è stato attribuito al recettore activ costitutivotilità. I dati sono stati analizzati al fine di stimare i valori di log K b del oxotremorine-M e MCN-A-343 come descritto nella sezione 6. Questa analisi ha dato valori di log K b di 8,30 ± 0,59 e 6,59 ± 0,77 per oxotremorine-M e MCN-A-343, rispettivamente. Le curve rappresentano il teorico dei minimi quadrati dell'equazione di regressione per i dati (vedi Sezione 6.2). Le stime di log τ sys, sistemi M e M sono state -2,29 ± 0,59, 95,8 ± 2,8 e 0,72 ± 0,08, rispettivamente. La stima del valore di K oss MCN-A-343 era 5,35 ± 0,46.

Figura 1
Figura 1. Relazione tra l'attività del recettore singolo e il livello medio di attivazione del recettore della popolazione. Recettore singola attività, il comportamento teorico di un solo recettore in fase transitions tra attivo (On) e inattivi (Off) dichiara, in presenza di un agonista è mostrato. Le costanti di affinità l'agonista per gli stati attivi ed inattivi sono indicate con K b e K una, rispettivamente. Comportamenti della popolazione, il comportamento teorico di recettori diversi in fase di transizioni casuali tra gli stati attivi e inattivi in presenza di un agonista è mostrato. Popolazione media, il livello medio di attivazione dei recettori in una popolazione di recettori in presenza di una specifica concentrazione di agonista è mostrato. Il livello di attivazione del recettore popolazione è conosciuto come lo stimolo.

Figura 2
Figura 2. Relazione tra la funzione di attivazione del recettore e l'efficacia (ε) e costante osservato affinità (K obs) della agonista. Popolazione media, il livello medio dil'attivazione del recettore suscitato aumentando le concentrazioni di agonista è mostrato. attivazione del recettore, il livello medio di attivazione del recettore agonista è tracciata la concentrazione log di agonista. La concentrazione log negativo di agonista necessaria per la metà-massimale l'attivazione del recettore è equivalente al affinità log osservato costante della agonista (log K obs). Il massimo della funzione di attivazione del recettore è denotato come efficacia (ε).

Figura 3
Figura 3. Esempi di curve concentrazione-risposta per la stimolazione della [3 H] accumulo inositolphosphate da vari agonisti muscarinici in cellule ovariche di criceto cinese che esprime il recettore umano M 3 muscarinici. Un totale di nove agonista curve concentrazione-risposta sono state misurate. L'esperimento può essere diviso in due parti. Per ogni parte, l'agonista standard (oxotremorineM) è sempre testati insieme con agonisti aggiuntivi. Così, due esperimenti del tipo indicato in A e B sono tenuti a misurare le curve concentrazione-risposta di nove agonisti se solo cinque agonisti possono essere analizzati in una volta. I dati sono da Ehlert et al. 12.

Figura 4
Figura 4. Esempi di curve concentrazione-risposta per la stimolazione del [3 H] inositolphosphate accumulo da diversi agonisti muscarinici in HEK 293 cellule che esprimono il recettore M 2 muscarinici e G α15. Espressione del recettore 2 M causato un 30 - 35% [3 H] inositolphosphate risposta, che è stato attribuito alla attività del recettore costitutivo. I dati sono da Ehlert et al. 12.

Figura 5
Figura 5. 3. Le curve concentrazione-risposta di selezionati agonisti muscarinici per stimolare l'idrolisi fosfoinositide sono mostrati. I valori medi di tre esperimenti ± SEM sono mostrati. I dati sono da Ehlert et al. 12.

Figura 6
Figura 6. Oxotremorine-M-e MCN-A-343-idrolisi fosfoinositide in HEK 293 cellule che esprimono G α15 e il recettore M 3 muscarinici. Idrolisi fosfoinositide è espressa in relazione al massimo e di oxotremorine-M. In assenza di agonista, idrolisi fosfoinositide attribuito all'espressione del recettore 3 M rappresentato circa il 2% della risposta. I mezzi di tre esperimenti ± SEM sono mostrati. Il data sono da Ehlert et al. 3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Perché il nostro metodo per la stima RA i (relativo valore di K b) richiede solo la misura della agonista curve concentrazione-risposta, la nostra analisi può essere fatta in qualsiasi momento queste curve sono misurate.

Se il giorno per giorno variazione della risposta della preparazione sperimentale (ad esempio, cellule o tessuti) è di grandi dimensioni, le misure di risposta di ogni curva concentrazione-risposta possono essere normalizzati rispetto al preventivo "Top" della agonista standard per ogni giorno esperimento. Una stima di Top e log CE 50 è stimato per ogni replica curva concentrazione-risposta della agonista standard da analisi di regressione, come descritto nei paragrafi 2 e 5. I valori di risposta di tutte le curve concentrazione-risposta agonista in un dato giorno sono normalizzati rispetto alla stima Top of the agonista standard per quel giorno. Questi dati normalizzati sono poi analizzati come descritto sopra Iniziozione alla Sezione 3.

L'accuratezza della stima K b dipende da una stima accurata di attività costitutiva del recettore. Nel nostro caso, trasfezione del recettore 3 M in cellule HEK 293 ha causato un aumento di idrolisi fosfoinositide che variava da circa 500 - 1.000 cpm di [3 H] inositolphosphates misurato alla presenza del litio nelle cellule pre-etichettate con [3H] inositolo . La risposta a carbacolo massima è stata di circa 50.000 - 60.000 cpm. Se la risposta costitutiva stato maggiore e meno variabile, la nostra stima dei valori b K del oxotremorine-M e MCN-A-343 sarebbe stato più preciso. La stima di K b dipende anche avere una stima accurata del fattore pendenza trasduttore (M) nel modello operativo. Di conseguenza, una maggiore precisione avrebbe potuto essere raggiunto se le concentrazioni di agonista erano più ravvicinati, come raccomandato nel paragrafo 1.3. Running agonisti ulteriori nell'esperimento anche notevolmente aumenta la precisione della stima di M, e quindi, di K b.

Se ci sono diversi stati attivi del recettore che segnale attraverso le proteine ​​di accoppiamento diversi (ad esempio, le proteine ​​G), allora il nostro metodo di analisi fornisce una stima accurata di agonista K b e RA i valori per ciascun percorso effettrici 3,6. Se più di uno stato attivo contribuisce ad una singola risposta misurata, allora il nostro metodo di stima di RA I e K b rappresenta una media ponderata dei diversi stati attivi a seconda della loro abbondanza relativa e attività 3.

L'attività del recettore costitutivo può essere indotta da più di esprimere la GPCR e la sua proteina complementare G 13. Questo potrebbe cambiare l'affinità osservata e l'efficacia del agonista del recettore complesso e può causare non-psegnalazione hysiological. Ma i cambiamenti nella natura della risposta e l'affinità osservato e l'efficacia della popolazione recettore non implicano cambiamenti negli stati fondamentali quantica del recettore, solo un cambiamento nel loro numero e la probabilità di isomerizzazione. Quindi, le proteine ​​G non sono tanto un fattore determinante degli effetti del farmaco tanto come una finestra su diversi effettrici selettivi stati del recettore. Se il nostro metodo di analisi è applicato a test specifici GPCR segnalazione che comportano un singolo effettore (per esempio, la proteina G) dovrebbe essere possibile misurare i valori agonista K b per effettrici stati selettivi del recettore - il provvedimento finale di polarizzazione agonista.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato supportato da una National Institutes of Health di Grant GM 69829.

References

  1. Stephenson, R. P. A modification of receptor theory. British Journal of Pharmacology. 11, 379-393 (1956).
  2. Furchgott, R. F. The use of b-haloalkylamines in the differentiation of receptors and in the determination of dissociation constants of receptor-agonist complexes. Advances in Drug Research. 3, 21-55 (1966).
  3. Ehlert, F. J., Suga, H., Griffin, M. T. Analysis of agonism and inverse agonism in functional assays with constitutive activity: Estimation of orthosteric ligand affinity constants for active and inactive receptor states. J. Pharmacol. Exp. Ther. 33, 671-686 (2011).
  4. Griffin, M. T., Figueroa, K. W., Liller, S., Ehlert, F. J. Estimation of Agonist Activity at G Protein-Coupled Receptors: Analysis of M2 Muscarinic Receptor Signaling through Gi/o,Gs, and G15. J. Pharmacol. Exp. Ther. 321, 1193-1207 (2007).
  5. Black, J. W., Leff, P. Operational models of pharmacological agonism. Proceedings of the Royal Society of LondonSeries B: Biological Sciences. 220, 141-162 (1983).
  6. Tran, J. A., Chang, A., Matsui, M., Ehlert, F. J. Estimation of relative microscopic affinity constants of agonists for the active state of the receptor in functional studies on M2 and M3 muscarinic receptors. Mol. Pharmacol. 75, 381-396 (2009).
  7. Schultz, J., Hamprecht, B., Daly, J. W. Accumulation of adenosine 3':5'-cyclic monophosphate in clonal glial cells: labeling of intracellular adenine nucleotides with radioactive adenine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 69, 1266-1270 (1972).
  8. Berridge, M. J., Downes, C. P., Hanley, M. R. Lithium amplifies agonist-dependent phosphatidylinositol responses in brain and salivary glands. Biochemical Journal. 206, 587-595 (1982).
  9. Kendall, D. A., Hill, S. J. Methods in Neurotransmitter Receptor Analysis. Raven Press. Yamamura, H.I. 68-87 (1990).
  10. Pulido-Rios, M. Vitro Isolated Tissue Functional Muscarinic Receptor Assays. Current Protocols in Pharmacology. 48, 4-15 (2010).
  11. Kenakin, T. Current Protocols in Pharmacology. Enna, S. J. John Wiley & Sons. (2001).
  12. Ehlert, F. J., Griffin, M. T., Sawyer, G. W., Bailon, R. A. simple method for estimation of agonist activity at receptor subtypes: comparison of native and cloned M3 muscarinic receptors in guinea pig ileum and transfected cells. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 289, 981-992 (1999).
  13. Burstein, E. S., Spalding, T. A., Brann, M. R. Pharmacology of muscarinic receptor subtypes constitutively activated by G proteins. Mol. Pharmacol. 51, 312-319 (1997).
Quantificare attività agonista a G recettori accoppiati alla proteina
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Ehlert, F. J., Suga, H., Griffin, M. T. Quantifying Agonist Activity at G Protein-coupled Receptors. J. Vis. Exp. (58), e3179, doi:10.3791/3179 (2011).More

Ehlert, F. J., Suga, H., Griffin, M. T. Quantifying Agonist Activity at G Protein-coupled Receptors. J. Vis. Exp. (58), e3179, doi:10.3791/3179 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter