La cuantificación de la actividad agonista en el G receptores acoplados a proteínas
Summary
Un método para estimar la constante de afinidad de un agonista para el estado activo (<em> K<sub> B</sub</em>) De una proteína G-receptor acoplado se describe. El análisis proporciona medidas absolutas o relativas de<em> K<sub> B</sub</em> Dependiendo de si la activación del receptor constitutiva se puede medir. Nuestro método se aplica a abajo varias respuestas de activación de los receptores.
Abstract
Cuando un agonista activa una población de G receptores acoplados a proteínas (GPCRs), que provoca una vía de señalización que culmina en la respuesta de la célula o tejido. Este proceso puede ser analizado a nivel de un solo receptor, con una población de receptores, o una respuesta abajo. A continuación se describe la forma de analizar la respuesta de abajo para obtener una estimación de la afinidad agonista constante para el estado activo de los receptores individuales.
Receptores se comportan como interruptores cuánticos que se alternan entre los estados activos e inactivos (Figura 1). El estado activo interacciona con las proteínas G específica u otros socios de señalización. En ausencia de ligandos, el estado inactivo predomina. La unión de agonistas aumenta la probabilidad de que el receptor pasará al estado activo, porque su constante de afinidad para el estado activo (K b) es mucho mayor que para el estado inactivo (K a). La suma de lossalidas al azar de todos los receptores en la población de los rendimientos de un nivel constante de activación de los receptores en el tiempo. El recíproco de la concentración del agonista de la mitad de la máxima provocar la activación del receptor es equivalente a la constante de afinidad observada (K obs), y la fracción de los complejos agonista de los receptores en el estado activo se define como la eficacia (ε) (Figura 2).
Métodos para el análisis de las respuestas aguas abajo de GPCRs han sido desarrollados, que permiten la estimación de la K obs y la eficacia relativa de un 1,2 agonista. En este informe, se muestra cómo modificar este análisis para estimar el valor de b agonistas K respecto a la de otro agonista. Para los ensayos que muestran actividad constitutiva, se muestra cómo estimar K b en unidades absolutas de M-1.
Nuestro método de análisis de agonista curvas concentración-respuesta consiste en 3,4de regresión no lineal utilizando mundial el modelo de operación 5. Se describe un procedimiento a través de la aplicación de software, Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA). El análisis se obtiene una estimación del producto de K obs y un parámetro proporcional a la eficacia (τ). La estimación de τK obs de un agonista, dividido por el de otro, es una medida relativa de K b (AR I) 6. Para cualquier receptor exhiben una actividad constitutiva, es posible estimar un parámetro proporcional a la eficacia del complejo de receptores libres (τ sistema). En este caso, el valor de K b de un agonista es equivalente a τK obs / τ sistema 3.
Nuestro método es útil para determinar la selectividad de un agonista de los subtipos de receptores y para cuantificar el agonista del receptor de señalización a través de diferentes proteínas G.
Protocol
Discussion
Debido a que nuestro método de estimación de la AR I (relativo valor de K b) sólo se requiere la medición de los agonistas de curvas concentración-respuesta, nuestro análisis se puede hacer en cualquier momento estas curvas se miden.
Si el día a día, la variación en la respuesta de la preparación experimental (por ejemplo, las células o tejido) es grande, las medidas de respuesta de cada curva concentración-respuesta puede ser normalizada con respec…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud Grant GM 69829.
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