Summary
En enkel og praktisk metode for å fastslå omfanget av gap junction tracer kopling mellom netthinnens nerveceller er beskrevet. Denne teknikken gjør det mulig å undersøke funksjonen av elektriske synapser mellom nevroner i intakt netthinnen under forskjellige lys forhold og til forskjellige tider av dagen og natten.
Abstract
I tillegg til kjemiske synaptisk overføring, kan nevroner som er koblet sammen med gap veikryss også kommunisere raskt via elektriske synaptisk overføring. Økende bevis indikerer at gap veikryss ikke bare tillater elektrisk strøm og synkrone aktivitet mellom sammenkoblede eller sammen celler, men at styrken eller effektiviteten av elektrisk kommunikasjon mellom kombinert celler kan moduleres i stor grad 1,2. I tillegg tillater den store indre diameter (~ 1,2 nm) av mange gap junction kanaler ikke bare elektrisk strøm, men også spredningen av intracellulære signalmolekyler og små metabolitter mellom sammenkoblede celler, slik at gapet veikryss kan også megle metabolske og kjemiske kommunikasjon . Styrken i gapet junctional kommunikasjon mellom nevroner og dens modulering av nevrotransmittere og andre faktorer kan studeres ved å samtidig elektrisk opptak fra kombinert celler og ved å bestemme than omfanget av spredningen av sporstoff molekyler, som er gap junction gjennomtrengelig, men ikke membran gjennomtrengelig, etter iontophoretic injeksjon i enkeltceller. Imidlertid kan disse prosedyrene være svært vanskelig å utføre på nervecellene med små somata i intakt nevrale vev.
Tallrike studier på elektriske synapser og modulering av elektrisk kommunikasjon har vært gjennomført i virveldyr netthinnen, siden hver av de fem retinal nervecellen typer er elektrisk koblet med gap veikryss 3,4. Økende bevis har vist at circadian (24-timers) klokke i netthinnen og endringer i lys stimulering regulere gap junction kopling 3-8. For eksempel har nyere arbeid vist at retinal biologiske klokke minsker gap junction kopling mellom stang og kjegle fotoreseptoren celler i løpet av dagen ved å øke dopamin D2 receptor aktivering, og dramatisk øker rod-kjegle kopling om natten ved å redusere D2 receptor aktivering Her presenterer vi en enkel metode for å fastslå omfanget av gap junction tracer kopling mellom netthinnens nerveceller under forskjellige lys forhold og til forskjellige tider av dagen og natten. Dette cut-lasting teknikken er en modifikasjon av skrape lasting 9-12, som er basert på fargestoff lasting og diffusjon gjennom åpne gap junction kanaler. Skrap lasting fungerer godt i dyrkede celler, men ikke i tykke skiver som intakt netthinne. Cut-lasting teknikken har blitt brukt til å studere fotoreseptoren kobling i intakt fisk og pattedyr 7 netthinne, 8,13, og kan brukes til å studere kobling mellomandre retinal nevroner, som beskrevet her.
Protocol
1. Intakt nevrale netthinnen forberedelser for gullfisk, mus og kaniner
- Utføre alle følgende trinn, inkludert de som er beskrevet i "2) Cut-lasting," under konstant ambient (bakgrunn) belysning. Vær oppmerksom på at i forbindelse med denne protokollen, er prosedyrene beskrevet som utføres i konstant mørke (dvs. under veldig mørke (dvs. "scotopic") tilstander ≤ 0,0001 lux) ved hjelp nattsyn infrarøde briller, men andre høyere intensitet nivåer av konstant ambient belysning kan brukes i stedet for å bestemme effekten av andre nivåer av ambient belysning på gap junction tracer kobling.
- Dark-tilpasse forsøksdyr (gullfisker, mus eller kanin) i minst 1 time før operasjonen.
- Som beskrevet tidligere 7, dypt anesthetize gullfisk ved å plassere dem i Tricaine methanesulfonate (MS222, 150 mg / L av buffered (natriumbikarbonat-holdig) fisken tank vann), og dypt anesthetize mus med ketamin (100 mg/ Kg, ip) og rompun (10 mg / kg, ip). Dypt anesthetize kaniner med uretan (startdose: 2,0 g / kg, ip), og bruker også lokale intraorbital anestesi (2% Xylocaine), som beskrevet tidligere åtte. Alle eksperimentelle prosedyrer som innebærer stell og bruk av dyr bør utføres i overensstemmelse med føderale retningslinjer og gjennomgås og godkjennes av lokale universitetet dyr omsorg og bruk komiteer. (Merk:. I forsøkene som beskrives her, alle eksperimentelle prosedyrer som involverer omsorg og bruk av fisk, var mus og kaniner utført i samsvar med NIH retningslinjer og ble gjennomgått og godkjent av Ohio State University Institusjonelle Animal Care og bruk Committee)
- For fisk, mus og kaniner, etter enucleation, fjerner fremre del av hver øyeeplet. Deretter plasserer et stykke filter papir på toppen av den bakre delen av øyet og snu filteret papir og øye, slik at filteret papiret er under den bakre delen av øyet. Deretter bruker bottang dissekere intakt nevrale netthinnen fra bakre delen av øyet ved å forsiktig peeling bort pigment epitelet / årehinnen / sklera, som er festet til hverandre, fra nevrale netthinnen, som er festet til filteret papir. Da dette er gjort, kutte synsnerven bruker fin fjærbelastede saks. Den nevrale netthinnen, orientert fotoreseptoren-side opp, skal nå være festet til filteret papir og atskilt fra resten av øyet.
2. Cut-lasting
- Senk netthinne i oxygenated Ringers løsning (Tabell 1) i en 6-brønns plate (~ 5 ml / brønn) for 30 min under konstant ambient (bakgrunn) belysning (f.eks under veldig mørke (dvs. "scotopic") tilstander) med eller uten en test stoffet. Oppretthold fisk netthinne i oxygenated (5% CO 2 / 95% O 2) bikarbonat-baserte Ringer ved 22 ° C ved å forsegle den 6-brønnen plate med Parafilm og vedlikeholde mus og kanin netthinne ved 36 ° C i 5% CO 2 / 95% O
- Klargjør tracer løsningen (vanligvis 100 mL) ved å løse opp neurobiotin (0,5%), en biotinylert molekyl, i Ringer løsning umiddelbart før skjære gjennom netthinnen. Merk at 0,5% rhodamine dekstran (høy (> 10 000) MW) kan legges til løsningen. På grunn av sin høye molekylvekt, ikke rhodamine dekstran ikke krysse gap veikryss og bare etiketter celler som har blitt skadet av kuttet. Som vist i fig. 3, er dette en nyttig måte å skille celler som har akkumulert neurobiotin fordi de har blitt skadet, fra de som har akkumulert tracer ved diffusjon gjennom gap veikryss.
- Plasser neurobiotin løsningen på et glass (eller plast) petriskål, trykk filteret papir, som netthinnen er festet på et tørkepapir for å fjerne overflødig Ringer, dip et barberblad (eller andre skarpe blad) i neurobiotin løsning og denn lage en radial skjære gjennom retina og filter papir. Hvis foretrukket, kan avstandsstykker brukes slik at kuttet er gjort gjennom netthinnen, men ikke filter papir. Kuttet bør være orientert vinkelrett på retinal overflaten. Dypp barberblad i neurobiotin løsningen igjen og kuttet netthinnen en gang. Gjenta dette inntil 4 kutt per netthinnen (se fig. 1). Bruk en dissecting mikroskop når du gjør barberblad skjærer gjennom mus og andre små netthinner.
- Som vist i fig. 1, senk netthinnen igjen i frisk Ringer-medium, med eller uten teste narkotika, med en 6-plate vel (5 ml Ringer / brønn). Inkuber netthinnen i 15 min for å tillate lasting og diffusjon.
- Vask tre ganger for 5 min hver med ferske Ringer medium med eller uten teste narkotika.
- Fix netthinnen med 4% Paraformaldehyde i 0,1 M fosfat buffer (PBS, 7,4 pH) i 1 time ved RT.
- Vask med 0,1 M PBS over natten ved 4 ° C.
- Dagen etter, reagerer wed 2% streptavidin-Alexa 488 (endelig konsentrasjon 10 mg / ml) i 0.1m PBS + 0,3% Triton X-100, og holde over natten ved 4 ° C.
- Vask tre ganger i 10 min hver med 0.1m PBS ved RT
- I PBS, løsne netthinnen fra filteret papir og deretter, med en fin pensel, sted netthinnen, orienterte fotoreseptoren-siden opp, på et lysbilde.
- Forsiktig montere med Vectashield montering medium (Vector Laboratories, Burlingame, CA).
- Ta bilder med en laser scanning confocal mikroskop (f.eks Zeiss 510 META) på samme forstørrelse, oppløsning og innstillinger for alle eksperimentelle forhold, slik at du kan sammenligne effekten av ulike eksperimentelle forhold (for eksempel teste narkotika, belysning forhold) om omfanget av gap junction tracer kobling (Fig. 2A-C og fig. 4A-C). Selv om en enkelt bilde kan inneholde alle de merkede cellene, anbefales det at du samler en z-stack av området av interesse og kollaps det i en enkeltimage.
3. Kvantifisering av tracer kobling bruke ImageJ
- I LSM blavisningen, åpne bildet, klikk EXPORT og lagre bildet som en TIF-16 bit IKKE komprimert fil. Scale bar bør inkluderes i dette TIF bildet.
- Ved hjelp av NIH ImageJ programvare, måle fluorescens intensitet av Alexa-488-merket neurobiotin fra lav forstørrelse bilder av hel-mount netthinner. Åpne TIF filen ved hjelp ImageJ programvare og deretter trekke en rett linje som tilsvarer skalaen bar. Gå til ANALYSE, SET SCALE og angi kjent distanse og enhet for lengde, klikk deretter på OK. Nå måleresultatene kan presenteres i kalibrerte enheter, som f.eks millimeter.
- Velg det området av interesse å bruke rektangulær markering verktøyet. Toppen av fluorescens bør plasseres på venstre kant av ditt valg. Kontroller at det ikke er fluorescens signal nær høyre kant. Hvis ikke, roterer det aktive bildet (IMAGE, deretter rotere).
- KlikkANALYSE og PLOT PROFIL. Du burde se en kurve med en eksponensiell fra venstre til høyre.
- Klikk COPY i pop-up vindu og lim den inn i Excel. Nå ser du to kolonner som viser avstanden fra cut (venstre kolonne) og fluorescens intensiteten som funksjon av avstanden fra cut (høyre kolonne).
- Divide hver rå fluorescens verdien av den maksimale fluorescens verdi å få relative fluorescens intensitet.
- Kopier to kolonner som tilsvarer avstanden fra cut (X) og den relative fluorescensintensitet (Y), og deretter lime dem inn Origin programvare.
- Passe med eksponensiell # 1 funksjon (fig. 2D og Fig 4D.), Som er i form:
Y = Y 0 + Y max * exp (-x / λ)
hvor Y er den relative fluorescensintensitet, er Y o bakgrunnen fluorescens, er Y max den maksimale relative fluorescens, er λ SPACE (lengde) konstant, og x er avstanden fra kuttet. - Sammenlign plassen konstant (λ) verdier ved ulike eksperimentelle forhold hjelp av t-test eller ANOVA (Fig. 2E og fig. 4E). Merk at alternative teknikker for kvantifisering har blitt beskrevet av andre 13,14.
Fire. Representant Resultater
Representative eksempler på fotoreseptoren celle tracer kopling som bestemmes av cut-lasting er presentert i figur 2 og 3 (fisk) og figur 4 (kanin). Confocal bildene ble tatt med de samme innstillingene for sammenligning (Fig. 2A-C og fig. 4A-C) og fluorescens intensiteten var plottet som en funksjon av avstanden fra kuttet og monteres av den eksponentielle funksjonen som er vist i nr. 3.8 ovenfor (fig. 2D og fig. 4D). Space konstante verdier for hver tilstander vist i figur 2E og 4E, illustrerer at omfanget av gap junction tracer koplingen kan kvantifiseres ved hjelp av cut-lasting teknikk. I tillegg er resultatene svært reproduserbare. Bruk av cut-lasting teknikken som et middel til å kvantifisere omfanget av gap junction tracer koblingen er også validert av det faktum at fluorescens intensiteten avtar eksponentielt som funksjon av avstand fra kutt i alle tilfeller undersøkt 7,8 (se også fig. 2D og 4D her), som indikerer at neurobiotin gikk inn fotoreseptorene via høvelen kuttet og ikke fra andre retinal nettsteder. Videre kvalitativt lignende dag / natt forskjell i fotoreseptoren celle tracer kopling observert gullfisk med sporstoff injeksjoner i singel kjegler og med cut-lasting 7 sannsynliggjør cut-lasting som en relativt presis måte å måle omfanget av fotoreseptoren kopling.
Cut-loading teknikken kan også brukes til å undersøke andre typer elektriske synapser i netthinnen. For eksempel viser figur 5 at kanin A-type (Fig. 5A) og B-type (Fig. 5B) horisontale celler viser homologe tracer kobling følgende cut-lasting og spredning av neurobiotin under mørke tilpasset forholdene.
| Compound | Fisk | Mus | Kanin |
| NaCl | 130 | 120 | 117 |
| NaHCO 3 | 20 | 25 | 30 |
| NaH 2 PO 4 | - | 1 | 0.5 |
| KCL | 2.5 | 5 | 3.1 |
| Glukose | 10 | 10 | 10 |
| MgCl 2 | 1 | - | - |
| MgSO 4-7H 2 O | - | 1 | 1.2 |
| Glutamin | - | 0.1 | 0.1 |
| CaCl 2 | 0.7 | 2 | 2 |
Tabell 1: Sammensetning av Ringer-løsninger for gullfisk, mus og kanin netthinner. Konsentrasjonene er presentert i mM. The Ringer-løsninger er bobler med 5% CO 2 / 95% O 2 og vedlikeholdt ved 22 ° C (fisk) eller 36 ° C (pattedyr). "-": Ikke inkludert i Ringer for denne arten.
Figur 1:. Flytskjema viser cut-lasting prosedyre. Etter isolasjon of intakt nevrale netthinnen, ble flere radial kutt laget av et blad som først ble dyppet i 0,5% neurobiotin løsning. Netthinnen ble inkubert for tracer lasting og diffusjon, og deretter vaskes før fiksering med 4% Paraformaldehyde (PFA) i 0.1m fosfat buffer (PB). Tracer kobling ble undersøkt ved hjelp streptavidin-konjugert Alexa-488.
Figur 2. Day-night forskjell i fotoreseptoren tracer kobling i gullfisk er åpenbart av cut-lasting teknikk. Fotoreseptoren celle gap junction neurobiotin tracer kopling var omfattende på kvelden (B) og dagen etter påføring av spiperone (10 mm), en selektiv dopamin D 2 reseptor antagonist (C), men ikke i dag under kontroll forhold (A). D) Normalisert relative fluorescerende intensitet som funksjon av avstanden fra kutt (angitt med piler i AC). E) Space konstant valUES hentet fra data i D og andre eksperimenter (n = 4). *** P <0,001.
Figur 3. Et representativt eksempel som viser fluorescens i fotoreseptoren celle laget av en mørk tilpasset gullfisk netthinnen natten følgende cut-lasting med en løsning av både neurobiotin og rhodamine dekstran. Rhodamine dekstran (vist i rødt), som ikke diffuse ikke gjennom åpne gap junction kanaler på grunn av høy molekylvekt (> 10 000 MW), kun merket celler nær kuttet. I kontrast kan neurobiotin (vist i grønt) diffust gjennom gap veikryss og sees i fotoreseptoren celler langt fra kuttet. Plasseringen av kuttet er indikert med pilen i hvert panel. Scale bar: 200 mikrometer.
Figur 4. Day-natt avvikeence i fotoreseptoren tracer kopling i kanin retina er åpenbart av cut-lasting teknikk. Fotoreseptoren celle gap junction neurobiotin tracer kopling var omfattende på kvelden (B) og dagen etter påføring av spiperone (10 mm) (C), men ikke i dag under kontroll forhold (A). I AC, er vinkelrett visninger av 3D-rekonstruksjon av kanin fotoreseptorene nær snittet vist. D) Normalisert relative fluorescerende intensitet som funksjon av avstanden fra kutt. E) Space konstante verdier hentet fra dataene i D og andre eksperimenter (n = 3). *** P <0,001.
Figur 5. Cut-lasting avslører at mørk-tilpasset kanin horisontale celler er tracer kombinert. Både A-type (A) og B-type (B) horisontale celler i mørk-tilpasset kanin netthinne utstilt homologe neurobiotin tracer kobling.
Discussion
Cut-lasting metoden som beskrives her er et nyttig og grei teknikk for å fastslå omfanget av gap junction tracer kopling mellom netthinnens nerveceller under forskjellige lys forhold og til forskjellige tider av dagen og natten. Fordeler med denne teknikken inkluderer muligheten til å kvantifisere omfanget av gap junction tracer kopling mellom nevroner i intakt retinal vevet under en rekke belysning forholdene i løpet av dagen og natten og til å gjøre det for kombinert nevroner som har liten diameter somata. Begrensninger av teknikken i studiet av gap veikryss i intakt vev faller i to generelle kategorier. Først kan tracer diffusjon gjennom åpne gap veikryss være relativt vanskelig å observere på grunn av a) den lille diameteren eller belaste forbundet med åpne kanaler og b) den relative mengder kombinert cellene 1,14,15. Det vil si, tracer diffusjon fra en liten celle til en større celle eller gruppe av sammen celler, compared til tracer diffusjon fra en større celle til en mindre celle, kan være vanskeligere å oppdage på grunn av tracer fortynning. Second, under visse fysiologiske forhold kan omfanget av tracer diffusjon gjennom gap veikryss i intakt vev ikke nøyaktig gjenspeile styrken av gapet junctional konduktans grunn av forskjeller i ledningsevne av små elektrisk strømførende ioner, i forhold til permeabilitet av relativt store tracer molekyler 1,14,15. Generelt tyder bevis på sporstoff kopling sterkt nærvær av funksjon, åpne gap junction-kanaler, men under visse fysiologiske forhold, kan tracer diffusjon ikke oppstå eller bli observert selv om elektrofysiologiske opptak tyder på tilstedeværelsen av fungerende, åpent gap veikryss.
Det virker sannsynlig at cut-lasting teknikken kan også brukes til å undersøke omfanget av gap junction tracer kopling mellom nevroner i intakt vev fra andre regioner av sentralnervesystemet system.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av NIH tilskudd EY005102 til SCM og EY018640 til HLR
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tricaine methane sulfonate (MS222) | Sigma-Aldrich | A5040 | 150 mg/L of buffered fish tank water |
| Urethane | Sigma-Aldrich | U2500 | 2 g/kgloading dose |
| Dual Tube Night Vision Goggle | Night Optics USA | D-221 | |
| Filter Paper, Grade No. 4 | Whatman, GE Healthcare | 1004-090 | |
| Fine Forceps, Dumont No. 5, Biologie, 11 cm long | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| Fine Scissors, spring-loaded, 8 mm blade, straight | Fine Science Tools | 15025-10 | |
| Neurobiotin | Vector Laboratories | SP-1120 | 0.5% |
| Streptavidin-conjugated Alexa 488 | Invitrogen | S11223 | 2% |
| Dextran rhodamine(high (> 10,000) MW) | Invitrogen | D1817 | 0.5% |
| Vectashield mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Zeiss 510 META Laser Scanning Confocal Microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| LSM-5 Image Browser 3,2,0,115 | Carl Zeiss, Inc. | ||
| ImageJ Software | National Institutes of Health | ||
| OriginPro 8.0 | OriginLab |
References
- Bennett, M. V. L., Zukin, R. S. Electrical coupling and neuronal synchronization in the mammalian brain. Neuron. 41, 495-511 (2004).
- Connors, B. W., Long, M. A. Electrical synapses in the mammalian brain. Annu. Rev. Neurosci. 27, 393-418 (2004).
- Vaney, D. I. Many diverse types of retinal neurons show tracer coupling when injected with biocytin or Neurobiotin. Neurosci. Lett. 125, 187-190 (1991).
- Bloomfield, S. A., Völgyi, B. The diverse functional roles and regulation of neuronal gap junctions in the retina. Nat. Rev. Neurosci. 10, 495-506 (2009).
- Weiler, R., Pottek, M., He, S., Vaney, D. I. Modulation of coupling between retinal horizontal cells by retinoic acid and endogenous dopamine. Brain. Res. Brain. Res. Rev. 32, 121-129 (2000).
- Xin, D., Bloomfield, S. A. Effects of nitric oxide on horizontal cells in the rabbit retina. Vis. Neurosci. 17, 799-811 (2000).
- Ribelayga, C., Cao, Y., Mangel, S. C. The circadian clock in the retina controls rod-cone coupling. Neuron. 59, 790-801 (2008).
- Ribelayga, C., Mangel, S. C. Identification of a circadian clock-controlled neural pathway in the rabbit retina. PLoS One. 5, e11020-e11020 (2010).
- Ouyang, X., Winbow, V. M., Patel, L. S., Burr, G. S., Mitchell, C. K., O'Brien, J. Protein Kinase A mediates regulation of gap junctions containing connexin35 through a complex pathway. Brain. Res. Mol. Brain. Res. 135, 1-11 (2005).
- Patel, L. S., Mitchell, C. K., Dubinsky, W. P., O'Brien, J. Regulation of gap junction coupling through the neuronal connexin Cx35 by nitric oxide and cGMP. Cell. Commun. Adhes. 13, 41-54 (2006).
- Peters, J. L., Cassone, V. M., Zoran, M. J. Melatonin modulates intercellular communication among cultured chick astrocytes. Brain. Res. 1031, 10-19 (2005).
- Cusato, K., Bosco, A., Rozental, R., Guimarães, C. A., Reese, B. E., Linden, R., Spray, D. C. Gap junctions mediate bystander cell death in developing retina. J. Neurosci. 23, 6413-6422 (2003).
- Li, H., Chuang, A. Z., O'Brien, J. Photoreceptor coupling is controlled by connexin 35 phosphorylation in zebrafish retina. J. Neurosci. 29, 15178-15186 (2009).
- Mills, S. L., Massey, S. C. The kinetics of tracer movement through homologous gap junctions in the rabbit retina. Vis. Neurosci. 15, 765-777 (1998).
- Mills, S. L., Massey, S. C. A series of biotinylated tracers distinguishes three types of gap junction in retina. J. Neurosci. 20, 8629-8636 (2000).
