Summary
En nem og bekvem metode til at bestemme omfanget af gap junction sporstof kobling mellem retinale neuroner er beskrevet. Denne teknik gør det muligt for en til at undersøge funktionen af de elektriske synapser mellem neuroner i den intakte nethinden under forskellige lys forhold og på forskellige tidspunkter af dagen og natten.
Abstract
Ud over kemisk synaptisk transmission, kan neuroner, der er forbundet med gap junctions også kommunikere hurtigt via elektriske synaptisk transmission. Stigende tyder på, at gap junctions ikke kun tillader elektrisk strøm og synkrone aktivitet mellem forbundne eller koblede celler, men at styrke eller effektivitet af elektrisk kommunikation mellem koblet celler kan afpasses i høj grad 1,2. Herudover giver det store indre diameter (~ 1,2 nm) af mange gap junction-kanaler ikke kun elektrisk strøm, men også udbredelsen af intracellulære signalstoffer og mindre metabolitter af indbyrdes forbundet celler, således at gap junctions kan også mægle metabolisk og kemisk kommunikation . Styrken af kløften Junctional kommunikation mellem neuroner og dets graduering af neurotransmittere og andre faktorer kan studeres ved samtidig elektrisk optagelse fra koblede celler og ved at bestemme than omfanget af spredning af tracer molekyler, som er gap junction gennemtrængelige, men ikke membran gennemtrængelige, efter Iontoforetisk injektion i enkelte celler. Dog kan disse procedurer være yderst vanskeligt at udføre på neuroner med små somata i intakte neurale væv.
Talrige undersøgelser af elektriske synapser og modulering af elektriske kommunikation er blevet gennemført i hvirveldyr nethinden, da hver af de fem retinale neuron typer elektrisk tilsluttes via gap junctions 3,4. Stigende beviser har vist, at døgnrytmen (24-timers) uret i nethinden og ændringer i lyset stimulation regulere gap junctions kobling 3-8. For eksempel har seneste arbejde vist, at retinale døgnrytmen ur falder gap junctions kobling mellem stang og kegle fotoreceptorceller i løbet af dagen ved at øge dopamin D2-receptor-aktivering, og dramatisk øger stang-kegle kobling natten ved at reducere D2 receptor aktivering Her præsenterer vi en simpel metode til bestemmelse af omfanget af gap junction sporstof kobling mellem nethinde neuroner under forskellige lys forhold og på forskellige tidspunkter af dagen og natten. Dette cut-loading teknik er en modifikation af skraber læsning 9-12, som er baseret på farve lastning og diffusion gennem åbne gap junctions kanaler. Skrab loading fungerer godt i dyrkede celler, men ikke i tykke skiver som intakt nethinder. Cut-loading teknik har været brugt til at studere fotoreceptorer kobling i intakte fisk og pattedyr nethinder 7, 8,13, og kan bruges til at undersøge koblingen mellemandre retinal neuroner, som beskrevet her.
Protocol
1. Intakt neurale nethinden forberedelserne til guldfisk, mus og kaniner
- Udfør alle de følgende trin, herunder dem, der er beskrevet i "2) Cut-loading", under konstant omgivende (baggrund) belysning. Bemærk, at med henblik på denne protokol, er de procedurer, der beskrives som udføres i konstant mørke (dvs. under meget mørke (dvs. "scotopic") vilkår ≤ 0,0001 lux) ved hjælp af nattesyn infrarøde briller, men andre højere intensitet niveauer af en konstant omgivende belysning kan anvendes i stedet til at bestemme virkningen af andre niveauer af omgivende belysning på gap junctions tracer kobling.
- Dark-tilpasse den eksperimentelle dyr (guldfisk, mus eller kanin) i mindst 1 time før operation.
- Som beskrevet tidligere 7, dybt bedøver guldfisk ved at placere dem i tricaine methanesulfonate (MS222, 150 mg / L af buffer (natrium bikarbonat-holdige) akvarium vand), og dybt bedøver mus med ketamin (100 mg/ Kg, ip) og rompun (10 mg / kg, ip). Dybt bedøver kaniner med urethan (loading dosis: 2,0 g / kg, ip) og også bruge de lokale intraorbital bedøvelse (2% Xylocain), som beskrevet tidligere 8. Alle eksperimentelle procedurer, der omfatter pleje og anvendelse af dyr bør udføres i overensstemmelse med føderale retningslinjer og skal revideres og godkendes af lokale universitet dyrs pasning og anvendelse udvalg. (Bemærk:. I forsøgene er beskrevet her, alle eksperimentelle procedurer, som omfatter behandling og brug af fisk, blev mus og kaniner udføres i overensstemmelse med NIH retningslinjer og blev gennemgået og godkendt af Ohio State University Institutional Animal Care og brug Udvalg)
- For fisk, mus og kaniner, efter enucleation fjerne den forreste del af hver øjeæblet. Derefter lægge et stykke filtrerpapir oven på den bageste del af øjet, og inverterer filtrerpapir og øjne, så at filteret papiret er under den bageste del af øjet. Så, med finpincet dissekere den intakte neurale nethinden fra den bageste del af øjet ved forsigtigt at skrælle væk pigment epitel / choroidea / sclera, der er knyttet til hinanden, fra de neurale nethinden, som er knyttet til filtrerpapir. Da dette er gjort, klippe synsnerven med fint fjederbelastet saks. Det neurale nethinde, orienterede fotoreceptor opad, bør nu fastgjort til filterpapir og adskilt fra resten af øjet.
2. Cut-loading
- Nedsænkes nethinder i iltet Ringers opløsning (tabel 1) i en 6-brønds plade (~ 5 ml / hul) i 30 min under konstant omgivende (baggrund) belysning (fx under meget mørke (dvs. "scotopic") forhold) med eller uden en test stof. Bevar fisk nethinder i iltet (5% CO 2 / 95% O 2) bikarbonat-baserede Ringers ved 22 ° C ved at forsegle den 6-brønds plade med parafilm og vedligeholde mus og kaniner nethinder ved 36 ° C i en 5% CO 2 / 95% O
- Forbered sporstof løsning (typisk 100 μL) ved at opløse neurobiotin (0,5%), en biotinyleret molekyle, i Ringers opløsning umiddelbart inden der skæres igennem nethinden. Bemærk, at 0,5% rhodamine dextran (høj (> 10.000) MW) kan tilføjes til løsningen. På grund af den høje molekylvægt, ikke rhodamine dextran ikke krydse gap junctions og kun mærker celler, der er blevet beskadiget ved snittet. Som vist i Fig. 3, dette er en nyttig måde at skelne mellem celler, der har akkumuleret neurobiotin fordi de er blevet såret, fra dem, der har opbygget den sporstof ved diffusion gennem gap junctions.
- Placer neurobiotin løsning på et glas (eller plast) petriskål, skal du trykke på filterpapir, som nethinden er fastgjort på et stykke køkkenrulle for at fjerne overskydende Ringer, dyppe et barberblad (eller en anden skarp kniv) i neurobiotin løsning og denn foretage en radial skære igennem nethinden og filtrerpapir. Hvis man foretrækker det, kan afstandsstykker kan anvendes, således at snit gennem nethinden, men ikke filtrerpapir. Snittet skal være orienteret vinkelret på retinal overfladen. Dyp barberblade i neurobiotin løsning igen og skar nethinden en anden gang. Gentag dette op til 4 snit pr nethinden (se fig. 1). Brug en dissektionsmikroskop, når de foretager barbermaskine skærer igennem mus og andre små nethinder.
- Som vist i Fig. 1, nedsænkes nethinden igen i frisk Ringers medium, med eller uden test stof ved hjælp af en 6-plade samt (5 ml Ringer / brønd). Inkubér nethinden i 15 min at give mulighed for lastning og udbredelse.
- Vask tre gange i 5 min hver med friske Ringers medie med eller uden test-stof.
- Fastgør nethinden med 4% paraformaldehyd i 0,1 M fosfatbuffer (PBS, pH 7,4) til 1 time på RT.
- Vask med 0,1 M PBS natten over ved 4 ° C.
- Den følgende dag, reagerer wed 2% streptavidin-Alexa 488 (slutkoncentration 10 mikrog / ml) i 0,1 M PBS + 0,3% Triton X-100, og holder natten over ved 4 ° C.
- Vask tre gange for 10 min hver med 0,1 M PBS på RT
- I PBS, nethinden løsnes fra filteret papir og derefter ved hjælp af en fin pensel, sted nethinden, orienterede fotoreceptor opad, på et dias.
- Forsigtigt montere med Vectashield Mounting Medium (Vector Laboratories, Burlingame, CA).
- Tag billeder med en laser scanning konfokal mikroskop (f.eks Zeiss 510 META) på samme forstørrelse, opløsning og indstillinger for hver eksperimentelle tilstand, så du kan sammenligne effekten af forskellige eksperimentelle betingelser (f.eks test narkotika; belysning betingelser) om omfanget af gap junctions sporstof kobling (Fig. 2A-C og Fig. 4A-C). Selv om en enkelt billede kan indeholde alle de mærkede celler, anbefales det at du samler en z-stak af området med interesse og skjule den til en enkeltimage.
3. Kvantificering af tracer kobling hjælp ImageJ
- I LSM billedet browser, billede åbent, skal du klikke eksportere og gemme billedet som en TIF-16 bit IKKE komprimeret fil. Skala bar bør indgå i denne TIF billede.
- Brug af NIH ImageJ software, måle fluorescensintensitet af Alexa-488-mærket neurobiotin fra lav-forstørrelse billeder af hel-mount nethinder. Åbn TIF filen ved hjælp ImageJ software og derefter trække en lige linje, der svarer til omfanget bar. Gå til Analysere, SET SCALE og indtaste den kendte distance og enhed af længde, og klik derefter på OK. Nu måleresultater kan præsenteres i kalibrerede enheder, såsom millimeter.
- Vælg det område af interesse ved hjælp af den rektangulære markeringsværktøj. Toppen af fluorescens skal placeres på venstre kant af dit valg. Sørg for, at der ikke er fluorescens signal nær den højre kant. Hvis ikke, rotere aktivt billede (billedet, og drej).
- Klik påAnalysere og PLOT PROFIL. Du bør se en kurve med en eksponentiel henfald fra venstre til højre.
- Klik på Kopier i pop-up vindue og indsæt den i Excel. Nu kan du se to kolonner viser afstand fra de afskårne (venstre kolonne) og fluorescensintensitet som en funktion af afstanden fra de afskårne (højre kolonne).
- Opdel hver rå fluorescens værdi ved den maksimale fluorescens værdi for at få den relative fluorescensintensitet.
- Kopier to kolonner, der svarer til afstanden fra de afskårne (X) og den relative fluorescensintensitet (Y), og derefter indsætte dem i Origin software.
- Passer med den eksponentielle DECAY # 1 funktion (Fig. 2D og figur 4D.), Som er i form:
Y = y 0 + Y max * exp (-x / λ)
hvor Y er den relative fluorescensintensitet, Y o er baggrunden fluorescens, Y max er den maksimale relative fluorescens, λ er spACE (længde) konstant, og x er afstanden fra de afskårne. - Sammenlign rummet konstant (λ) værdier på forskellige eksperimentelle betingelser ved hjælp af t-test eller ANOVA (fig. 2E og Fig. 4E). Bemærk, at alternative teknikker til kvantificering er blevet beskrevet af andre 13,14.
4. Repræsentative resultater
Repræsentative eksempler på fotoreceptor celle sporstof kobling som bestemt ved cut-loading er præsenteret i figur 2 og 3 (fisk) og figur 4 (kanin). Konfokal billeder blev taget med de samme indstillinger til sammenligning (Fig. 2A-C og Fig. 4A-C) og fluorescensintensitet var plottet som funktion af afstanden fra de afskårne og monteret med den eksponentielle funktion er vist i Nr. 3,8 ovenstående (Fig. 2D og Fig. 4D). Plads konstante værdier for hver tilstander vist i figur 2E og 4E, hvilket illustrerer, at omfanget af gap junction sporstof koblingen kan kvantificeres ved hjælp af cut-loading teknik. Hertil kommer, er resultaterne meget reproducerbare. Anvendelse af cut-loading teknik som et middel til at kvantificere omfanget af gap junction sporstof kobling er også valideret af den konstatering, at fluorescensintensitet aftager eksponentielt som funktion af afstand fra skæres i alle undersøgte sager 7,8 (se også fig. 2D-og 4D her), hvilket indikerer, at neurobiotin ind i fotoreceptorer via barberkniv klippe og ikke fra andre nethinde-sites. Desuden kvalitativt lignende dag / nat forskel i fotoreceptor celle sporstof kobling observeret i guldfisk med sporstof injektioner i enkelt kegler og med cut-loading 7 underbygger cut-læsning som en forholdsvis præcis metode til at måle omfanget af fotoreceptor kobling.
Cut-loading teknik kan også bruges til at undersøge andre typer af elektriske synapser i nethinden. For eksempel illustrerer figur 5, at kanin A-type (fig. 5A) og B-typen (Fig. 5B) horisontale celler udviser homologe sporstof kobling følgende cut-loading og spredning af neurobiotin under mørke-tilpassede forhold.
| Compound | Fisk | Mus | Kanin |
| NaCl | 130 | 120 | 117 |
| NaHCO 3 | 20 | 25 | 30 |
| NaH 2 PO 4 | - | 1 | 0,5 |
| KCL | 2,5 | 5 | 3,1 |
| Glucose | 10 | 10 | 10 |
| MgCl 2 | 1 | - | - |
| MgSO 4-7H 2 O | - | 1 | 1,2 |
| Glutamin | - | 0,1 | 0,1 |
| CaCl 2 | 0,7 | 2 | 2 |
Tabel 1: Sammensætning af Ringers løsninger til guldfisk, mus og kanin nethinder. Koncentrationerne er angivet i mm. De Ringer løsninger er boblede med 5% CO 2 / 95% O 2 og blev opretholdt ved 22 ° C (fisk) eller 36 ° C (pattedyr). "-": Ikke medtaget i Ringer for denne art.
Figur 1:. Flowdiagram viser cut-loading procedure. Efter isolation of den intakte neurale nethinden, var flere radial nedskæringer, som en kniv, som først blev dyppet i 0,5% neurobiotin løsning. Nethinden blev inkuberet for tracer lastning og diffusion, og derefter vasket, før fiksering med 4% paraformaldehyd (PFA) i 0,1 M fosfatbuffer (PB). Tracer kobling blev undersøgt ved hjælp af streptavidin-konjugeret Alexa-488.
Figur 2. Dag-nat forskel i fotoreceptor sporstof koblingen i guldfisk er afsløret af de cut-loading teknik. Fotoreceptor celle gap junctions neurobiotin sporstof kobling var omfattende natten (B) og i dag efter anvendelse af spiperone (10 ìm), en selektiv dopamin D 2 receptor antagonist (C), men ikke i dag under kontrol betingelser (A). D) normaliseret relative fluorescensintensitet som en funktion af afstanden fra de nedskæringer (angivet med pile i AC). E) Space konstant valdier indsamlet hos den registrerede i D og andre eksperimenter (n = 4). *** P <0,001.
Figur 3. Et repræsentativt eksempel, der viser fluorescens i fotoreceptor cellelag i en mørk-tilpasset guldfisk nethinden natten følgende cut-loading med en opløsning af både neurobiotin og rhodamine dextran. Rhodamine dextran (vist i rødt), som ikke diffus gennem åbne gap junction-kanaler på grund af den høje molekylvægt (> 10.000 MW), kun er mærket celler tæt ved cut. I modsætning hertil kan neurobiotin (vist med grønt) spredt gennem gap junctions og blive set i fotoreceptorceller langt fra skåret. Placeringen af snittet er angivet med en pil i hver panel. Skala bar: 200 μm.
Figur 4. Dag-aften afvigerrencen i fotoreceptor sporstof koblingen i kanin nethinden er afsløret af de cut-loading teknik. Fotoreceptor celle gap junctions neurobiotin sporstof kobling var omfattende natten (B) og i dag efter anvendelse af spiperone (10 ìm) (C), men ikke i dag under kontrol betingelser (A). I AC er vinkelret visninger af 3D-rekonstruktion af kanin fotoreceptorer nær snittet vist. D) normaliseret relative fluorescensintensitet som en funktion af afstanden fra nedskæringer. E) Space konstante værdier indhentet hos den registrerede i D og andre eksperimenter (n = 3). *** P <0,001.
Figur 5. Cut-loading afslører, at dark-tilpassede kanin horisontal celler tracer koblet. Både A-typen (A) og B-typen (B) horisontale celler i mørke-tilpassede kanin nethinder udstillet homologe neurobiotin tracer kobling.
Discussion
Cut-loading-metoden beskrevet her er en nyttig og enkel teknik til at bestemme omfanget af gap junction sporstof kobling mellem retinale neuroner under forskellige lys forhold og på forskellige tidspunkter af dagen og natten. Fordele ved denne teknik omfatter muligheden for at kvantificere omfanget af gap junction sporstof kobling mellem neuroner i intakte retinal væv under en række af belysning betingelser i løbet af dagen og natten og til at gøre det til koblet neuroner, der har lille diameter somata. Begrænsninger af teknikken i studiet af gap junctions i intakt væv, falder i to overordnede kategorier. For det første kan sporstof diffusion gennem åbne gap junctions være forholdsvis vanskelige at observere på grund af a) den lille diameter eller afgift i forbindelse med de åbne kanaler og b) den relative mængder af koblede cellulære rum 1,14,15. Det vil sige, sporstof diffusion fra en lille celle til en større celle eller en gruppe af koblede celler, compared til tracer diffusion fra et større celle til en mindre celle, kan være mere vanskeligt at opdage på grund af tracer fortynding. For det andet, under visse fysiologiske forhold, kan omfanget af sporstof diffusion gennem gap junctions i intakt væv ikke præcist afspejler styrken af kløften Junctional ledningsevne på grund af forskelle i konduktans af små elektriske strømførende ioner, sammenlignet med permeabilitet af relativt store tracer molekyler 1,14,15. I almindelighed stærkt bevis på sporstof kobling tyder på tilstedeværelsen af velfungerende, åbne gap junction-kanaler, men under visse fysiologiske forhold, kan sporstof diffusion ikke forekomme eller observeres, selvom elektrofysiologiske optagelser tyder på tilstedeværelsen af velfungerende, åbne gap junctions.
Det virker sandsynligt, at cut-loading teknikken også kan bruges til at undersøge omfanget af gap junction sporstof kobling mellem neuroner i intakt væv fra andre dele af centralnervesystemet system.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af NIH give EY005102 til SCM og EY018640 til CPR
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tricaine methane sulfonate (MS222) | Sigma-Aldrich | A5040 | 150 mg/L of buffered fish tank water |
| Urethane | Sigma-Aldrich | U2500 | 2 g/kgloading dose |
| Dual Tube Night Vision Goggle | Night Optics USA | D-221 | |
| Filter Paper, Grade No. 4 | Whatman, GE Healthcare | 1004-090 | |
| Fine Forceps, Dumont No. 5, Biologie, 11 cm long | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| Fine Scissors, spring-loaded, 8 mm blade, straight | Fine Science Tools | 15025-10 | |
| Neurobiotin | Vector Laboratories | SP-1120 | 0.5% |
| Streptavidin-conjugated Alexa 488 | Invitrogen | S11223 | 2% |
| Dextran rhodamine(high (> 10,000) MW) | Invitrogen | D1817 | 0.5% |
| Vectashield mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Zeiss 510 META Laser Scanning Confocal Microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| LSM-5 Image Browser 3,2,0,115 | Carl Zeiss, Inc. | ||
| ImageJ Software | National Institutes of Health | ||
| OriginPro 8.0 | OriginLab |
References
- Bennett, M. V. L., Zukin, R. S. Electrical coupling and neuronal synchronization in the mammalian brain. Neuron. 41, 495-511 (2004).
- Connors, B. W., Long, M. A. Electrical synapses in the mammalian brain. Annu. Rev. Neurosci. 27, 393-418 (2004).
- Vaney, D. I. Many diverse types of retinal neurons show tracer coupling when injected with biocytin or Neurobiotin. Neurosci. Lett. 125, 187-190 (1991).
- Bloomfield, S. A., Völgyi, B. The diverse functional roles and regulation of neuronal gap junctions in the retina. Nat. Rev. Neurosci. 10, 495-506 (2009).
- Weiler, R., Pottek, M., He, S., Vaney, D. I. Modulation of coupling between retinal horizontal cells by retinoic acid and endogenous dopamine. Brain. Res. Brain. Res. Rev. 32, 121-129 (2000).
- Xin, D., Bloomfield, S. A. Effects of nitric oxide on horizontal cells in the rabbit retina. Vis. Neurosci. 17, 799-811 (2000).
- Ribelayga, C., Cao, Y., Mangel, S. C. The circadian clock in the retina controls rod-cone coupling. Neuron. 59, 790-801 (2008).
- Ribelayga, C., Mangel, S. C. Identification of a circadian clock-controlled neural pathway in the rabbit retina. PLoS One. 5, e11020-e11020 (2010).
- Ouyang, X., Winbow, V. M., Patel, L. S., Burr, G. S., Mitchell, C. K., O'Brien, J. Protein Kinase A mediates regulation of gap junctions containing connexin35 through a complex pathway. Brain. Res. Mol. Brain. Res. 135, 1-11 (2005).
- Patel, L. S., Mitchell, C. K., Dubinsky, W. P., O'Brien, J. Regulation of gap junction coupling through the neuronal connexin Cx35 by nitric oxide and cGMP. Cell. Commun. Adhes. 13, 41-54 (2006).
- Peters, J. L., Cassone, V. M., Zoran, M. J. Melatonin modulates intercellular communication among cultured chick astrocytes. Brain. Res. 1031, 10-19 (2005).
- Cusato, K., Bosco, A., Rozental, R., Guimarães, C. A., Reese, B. E., Linden, R., Spray, D. C. Gap junctions mediate bystander cell death in developing retina. J. Neurosci. 23, 6413-6422 (2003).
- Li, H., Chuang, A. Z., O'Brien, J. Photoreceptor coupling is controlled by connexin 35 phosphorylation in zebrafish retina. J. Neurosci. 29, 15178-15186 (2009).
- Mills, S. L., Massey, S. C. The kinetics of tracer movement through homologous gap junctions in the rabbit retina. Vis. Neurosci. 15, 765-777 (1998).
- Mills, S. L., Massey, S. C. A series of biotinylated tracers distinguishes three types of gap junction in retina. J. Neurosci. 20, 8629-8636 (2000).
