Summary
在这里，我们描述一个高度活跃Hsp104，一个六聚AAA +从酵母中的蛋白质，其中夫妇ATP水解蛋白分解净化的协议。该计划利用从亲和纯化His6标签的构造
Abstract
Hsp104是一个六聚AAA +蛋白1，从酵母，这夫妇ATP水解蛋白质分解2-10（图1）。这个活动赋予了两个关键的选择性优势。首先，由Hsp104无序聚集复性酵母生存的授权后，各种蛋白质的错误折叠强调，包括热休克3,5,11,12。其次，Hsp104交叉β-淀粉样纤维的重塑使酵母利用无数的朊病 毒（感染性淀粉样）和水库作为一个有益的遗传表型变异13-22。值得注意的是，Hsp104直接重塑preamyloid低聚物和淀粉样纤维，包括酵母朊蛋白Sup35 和 Ure2 23-30组成的。这淀粉样蛋白重塑的功能是专业方面的酵母Hsp104。的大肠杆菌大肠杆菌同源，ClpB，无法改造preamyloid低聚物或淀粉样纤维26,31,32。
Hsp104同源除外，令人困惑，动物王国的生活。事实上，无论是动物细胞中拥有任何酶系统，夫妻蛋白复性（而不是退化）的分类仍然是未知 33-35 。因此，我们和其他人提出，Hsp104可能会被视为一个与特定的蛋白质错误折叠成有毒的preamyloid低聚物和淀粉样纤维 4,7,23,36-38有关的各种神经退行性疾病的治疗剂开发。有没有直接目标与这些疾病有关的汇总物种的治疗。然而，Hsp104溶解毒性低聚物和淀粉样纤维的α-突触核蛋白，这是帕金森氏病23以及39的PrP淀粉样蛋白形式相连组成。更重要的是，Hsp104减少蛋白质聚集和改善帕金森氏病23和亨廷顿氏病38的老鼠模型的神经退行性疾病。理想的情况下，优化治疗和减少副作用，Hsp104将设计和potentiated有选择性地改造的核心问题4,7的疾病的具体聚集。然而，有限的结构和机理的了解如何Hsp104分解聚合结构和不相关的蛋白质的这样一个多样化的剧目挫败这些努力30,40-42。
要了解Hsp104的结构和机制，它是用最少的元件必须研究的纯蛋白质和重组其disaggregase活动。 Hsp104是一个102kDa蛋白与PI〜5.3，ADP或ATP，或在高蛋白质浓度在43-46核苷酸的情况下hexamerizes。在这里，我们描述了一个优化的协议， 从 E的纯化高度活跃，稳定Hsp104 大肠杆菌 。 E.使用大肠杆菌可以简化大规模生产，我们的方法可以进行快速，可靠地为众多Hsp104变种。我们的协议，增加Hsp104的纯度和简化他的6个标签去除，相比以前的提纯方法从E. 大肠杆菌 47。此外，我们的协议是两个较近期的协议 26,48比更轻便和方便。
Protocol
1。对Hsp104的表达
- 质粒在大肠杆菌中聘用为净化大肠杆菌 ，pPROEX HTB - Hsp104，包含的trc启动子的诱导 26控制下Hsp104开放阅读框。质粒产生的N -端他的6个标签，可删除TEV蛋白酶裂解Hsp104。转换成密码子优化E. pPROEX HTB - Hsp104 大肠杆菌 BL21 CodonPlus的RIL细胞（Stratagene公司，安捷伦科技公司）使用一个典型的细菌转化过程（例如按照制造商的指示）。重要的是要使用一个密码子优化的E.菌株 ，因为Hsp104有一个不寻常的密码子的偏见。
- 接种（USB.方药：16克/ L，酪蛋白胨，10G / L酵母提取物，5克/ L的NaCl，pH值7.0），辅以新鲜转化100μg/mL氨苄青霉素和34μg/mL氯霉素一个100毫升2XYT文化和成长一夜之间在37 ° C在200rpm摇晃。
- 过夜培养，接种到6 X 1L100μg/mL氨苄青霉素和34μg/mL氯霉素2XYT在2L烧瓶10ML。在250rpm摇在37 ° C，直到OD 600 = 0.4-0.6。停止震动和降低温度至15 ° C。允许细胞以平衡为30min unagitated在孵化器，直到它到达15 ° C。一旦15 ° C时达到诱导蛋白的表达，加入IPTG至终浓度为1mm。继续晃动在250rpm过夜（12-16小时）。
2。细胞收获和裂解
- 为20分钟4000转离心收集细胞（在预冷转子）在4 ° C（我们使用一个Sorvall RC 3BP +离心机）。后续步骤必须立即执行，因为Hsp104活动减少时，大肠杆菌大肠杆菌细胞被冻结。此外，所有的后续步骤，应在冰上或4℃
- 在prechilled悬浮细胞球（冰）10毫升裂解液（40MM的HEPES - KOH pH值7.4，500mm的氯化钾，氯化镁20MM 2，2.5％（W / V）甘油，20MM咪唑，5μM胃酶抑素A，完整的蛋白酶抑制剂的鸡尾酒（1 EDTA的免费tablet/50mL），和2mm的β-巯基乙醇）。
- 一位法国记者（Emulsiflex）使用热交换器，浸泡在冰水中匀浆，裂解细胞。在使用之前，确保所有细胞团块已溶解。平衡与裂解缓冲液匀浆后，通过15,000-18,000 psi的压力缸的传递是足够充分溶解。如果一个法国媒体不可用，通过超声与溶菌酶的潜伏期可以使用（见讨论）。保存一个小样本的裂解细胞，SDS - PAGE分析（1μL）（图2中的裂解液）。
- 细胞碎片取出离心20分钟16,000转，4 ° C（我们使用一个Sorvall RC5C + centifuge）。保留上清液为下一步并保存为一个小样本的上清液（1μL）SDS - PAGE分析（镍负载图2）。
3。 Hsp104净化
- 从步骤2.4混合上清液12mL（2ML镍琼脂糖珠，每细胞1L）50％的裂解液平衡的镍琼脂糖凝胶珠（GE）的泥浆。
- 3个小时的样品慢慢旋转4 ° C，镍琼脂糖凝胶均匀悬浮发泡最小化。更短的孵育时间是可能的，但会减少产量。在4 ° C在蛋白酶抑制剂的存在，小的退化发生，和3个小时的镍琼脂糖凝胶孵化时间不会降低最终产品的活动。收集镍琼脂糖离心2分钟，在4 °在2000彗星RPM（的Eppendorf 5810R离心机）。保存一个小样本上清进行SDS - PAGE分析（1μL），并丢弃其余的（镍流经（FT）在图2）。
- 洗洗涤缓冲液（40MM HEPES - KOH pH值7.4，150mm的氯化钾，氯化镁2 20MM，2.5％（W / V）甘油，20MM咪唑，2mm的β-巯基乙醇），5倍柱体积的25倍柱体积的提取镍琼脂糖凝胶用1M KCl的缓冲，以消除静电绑定到Hsp104的污染物，25柱体积的缓冲液洗。镍琼脂糖收集每个离心洗2分钟后，4 °在2000彗星RPM（的Eppendorf 5810R离心机）。每个洗，离心循环后，吸删除缓冲区。
- 洗脱1ML洗脱缓冲液制成每1ml镍琼脂糖（40MM HEPES - KOH pH值7.4，150mm的氯化钾，氯化镁2 20MM，2.5％（W / V）甘油，350MM咪唑，2mm的β-巯基乙醇）和Hsp104，混合镍琼脂糖凝胶在4 ° C 20分钟旋转。咪唑浓度高破坏的倪珠他6互动。镍琼脂糖凝胶取出空的1.2毫升离心柱（BIO - RAD）离心2分钟4 °在2,000 RPM（的Eppendorf 5810R离心机）彗星。保存洗脱液SDS - PAGE分析1μL（倪洗脱液图2）。 〜15毫克的Hsp104是每公升的细胞，在这一步获得。
- 采用截留分子量为30,000 Amicon超（MIL缓冲区交换到缓冲区问（20MM的Tris - HCl pH值8，0.5mm的EDTA，MgCl 2的 5MM，50MM氯化钠）洗脱液lipore）15ML离心选矿单位。首先，集中〜1.5ml的蛋白质，再加入14.5mL缓冲Q来稀释10倍的蛋白质。缓冲交换，重复3次。增加的pH值和低盐，确保Hsp104具有较高的负电荷。
- 净化Hsp104通过阴离子交换色谱法，使用一个缓冲Q平衡资源Q 6ML列（GE）。注射前，蛋白质进行筛选，通过低蛋白具有约束力的Millex GP PES膜0.22μm的注射器过滤器（Millipore公司）。我们聘请的为1ml/min的流速。洗去弱结合蛋白1柱体积的20％，缓冲区Q +（20毫米的Tris - HCl pH值8，EDTA的0.5MM，5MM氯化镁2，1M氯化钠）。洗脱Hsp104超过5倍柱体积与线性渐变（20％-50％Q +缓冲）（图3）。收集1毫升分数。 Hsp104和大多数变种通常〜400mm的氯化钠（31mS/cm）洗脱。保存样品的SDS - PAGE分析（图3，插图）的最高分数为（1μL）。
- 为了消除他的6个标签，使用Amicon离心选矿机的交换蛋白上面描述（见第3.5步）进入裂解缓冲液（20MM的HEPES - KOH pH值7.4，140mm的氯化钾，和10mm氯化镁2 ）。根据制造商的说明使用proTEV蛋白酶（Promega公司）或AcTEV蛋白酶（Invitrogen公司）。 Hsp104，我们发现，比例较高的TEV蛋白酶：Hsp104充分裂解。我们使用了1％12μgHsp104蛋白酶单位的比例。应在30 ° C卵裂为2-4小时，16小时的潜伏期在4 ° C。最后Hsp104浓度应介于20 -75μm的单体。加入过量的镍琼脂糖凝胶的Hsp104在裂解反应量（假设珠可以绑定15毫克每毫升包装树脂的蛋白质）消耗任何His6标签的剩余Hsp104镍琼脂糖凝胶（GE）和TEV蛋白酶。删除珠空离心柱（BIO - RAD）在2分钟2,000转离心4 ° C。 SDS - PAGE分析裂解（1μL）之前和之后收集的样本，以确保乳沟，uncleaved蛋白质的去除（图4）。
- 兑换成体积排阻采用截留分子量为30,000 Amicon超（Millipore公司），在步骤3.5中所述的缓冲区（20MM的HEPES - KOH pH值7.4，氯化钾140MM，10MM氯化镁2，EDTA的0.1MM，1MM数码地面电视）。
- 进一步净化Hsp104通过体积排阻色谱。使用体积排阻缓冲平衡Superose 6或Superdex 200柱（均来自GE）（图5）。注射前，蛋白质进行筛选，通过低蛋白具有约束力的Millex GP PES膜0.22μm的注射器过滤器（Millipore公司）。 10/300大小列（24mL）小于10毫克的蛋白质，可用于0.5毫升馏分收集。 12/60大小列（120ML）超过10毫克的样品，应使用1毫升馏分收集。请参阅制造商的流动速率和样品装入卷指示。经纯化后，Hsp104分数汇总，如图所示。 5和集中Amicon离心浓缩装置（Millipore公司）。 Hsp104存储，如下所述。由于分离Hsp104降解产物和污染物的最终产量的纯化全长Hsp104〜1 - 3mg的每开始文化公升的物质损失。
4。 Hsp104 Disaggregase活动
- 净化后，它是很好的做法，在分类检测评估Hsp104活动。通常情况下，我们采用荧光素酶的激活检测（图6） 。在这个实验中，结合与HSP70的伴侣系统（Hsp70和Hsp40）分解尿素变性的萤火虫荧光素酶聚合2 Hsp104。可溶性的荧光素酶催化氧化荧光素oxyluciferin，反应，释放光。通过监测发光，相对激活，因此分类，荧光素酶才能确定。 Hsp104必须能够协同合作与HSP70的合作伴侣系统。恢复发光量取决于确切的热休克蛋白70：Hsp40对利用。我们经常聘请HSP72和Hsp40（分析设计）。至少，积极Hsp104应该产生在荧光素酶的激活增加5倍，相比HSP72激活：Hsp40（图6）。 Hsp104的筹备工作，没有达到这个水平的活动都将被丢弃。
5。 Hsp104存储
- 短期储存，Hsp104可以保持在4 ° C体积排阻缓冲区。然而，活动将下降2-3天之后，在4 ° C和1周后大幅4 ° C。对于分类分析，我们建议，Hsp104应采用净化后尽快。理想的情况下，Hsp104应立即使用淀粉样蛋白分解实验。
- 如果蛋白质必须长期存储，Hsp104交换到存储缓冲区（20MM的HEPES - KOH pH值7.4，氯化钾140MM，10MM氯化镁2，EDTA的0.1MM，1MM数码地面电视，10％甘油（W / V））。 100μL等分是液氮冷冻和储存在-80 ° C的管理单元冻融循环次数大大减少Hsp104活动应尽量避免。我们建议慢慢解冻冰Hsp104。 -淀粉样蛋白disaggregase的活性会大幅下降1个月后，在-80 ° C。
6。代表性的成果和数据：
图1。 Hsp104是一个双功能的disaggregase。无序聚集（左所示）进行分类，要求合作的HSP70的伴侣系统（Hsp70和Hsp40）2。 Hsp104重塑下令没有援助，Hsp70和Hsp40 在体外淀粉样蛋白聚合体（如右图所示），但Hsp70和Hsp40可以提高对淀粉样蛋白26,28 Hsp104活动。对于这两种类型的聚合结构，Hsp104夫妇ATP水解底物，通过其中央通道，以促进分类易位。从事酪氨酸轴承孔循环，并通过中央通道穿梭基板49-52。
图2。镍亲和纯化步骤的SDS - PAGE电泳分析 。裂解液，镍，镍负载FT和镍洗脱液样品使用4-20％的Tris - HCl1.0毫米标准胶（BIO - RAD）和考马斯染色的SDS - PAGE分割。请注意，并非所有的Hsp104是能够绑定到镍琼脂糖。广泛分子量标记（BIO - RAD）（左线）。
图3。资源Q净化镍琼脂糖洗脱液在280nm处和绿线，蓝线代表的吸光度代表％缓冲区Q +（最高50％ ）。的第一个高峰，其中20％洗脱Q +含有杂质，降解产物和不当折叠Hsp104的。第二和主要峰包含正确折叠和活跃Hsp104。流速为1ml/min。从20-50％Q +梯度是30分钟或5倍柱体积。插图：峰组分经SDS - PAGE分析使用4-20％的Tris - HCl1.0毫米标准胶（BIO - RAD）和考马斯染色解决。广泛分子量标记（BIO - RAD）（左）所示。
图4。 proTEV蛋白酶裂解步骤SDS - PAGE分析 ，从资源Q净化他的6 Hsp104治疗proTEV 4小时蛋白酶在30℃，然后16个小时，在4 ° C。样品经SDS - PAGE分次使用的4-20％的Tris - HCl1.0毫米标准胶（BIO - RAD）和考马斯染色。请注意，proTEV裂解Hsp104迁移更迅速。 TEV蛋白酶和uncleaved Hsp104已经所剩无几步骤3.7中所述的镍琼脂糖凝胶。广泛分子量标记（BIO - RAD）（左）所示。
图5。体积排阻Hsp104净化。劈开Hsp104是通过Superose 6凝胶过滤柱（10/300，GE）进一步纯化。流量= 0.4ml/min。峰之间的虚线代表汇集分数。插图：峰组分经SDS - PAGE分析使用4-20％的Tris - HCl1.0毫米标准胶（BIO - RAD）和考马斯染色解决。广泛分子量标记（BIO - RAD）（左）所示。
图6。荧光素酶的激活检测 。变性萤火虫荧光素酶聚合（50纳米）与HSP72和Hsp40（1μM）（含量设计），Hsp104（6μM单体）或Hsp104，HSP72和90分钟Hsp40在25 ° C孵育变性荧光素酶只有充分激活Hsp104和Hsp40/Hsp72存在。恢复发光，是衡量一个无限M1000酶标仪（TECAN）。价值观代表表示± SEM（N = 3）。
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Discussion
时间轴：最大的Hsp104活动中，我们建议尽可能迅速完成整个净化计 划。然而，纯化步骤，使一个苛刻的时间表，可能并不总是实际的。如果净化步骤是尽快地进行，时间从隔夜表达年底通过孵化2-4小时30 ° C是与TEV蛋白酶约9-11小时。一个潜在的地方，暂停以下TEV裂解步骤。如果绝对必要的，Hsp104可能会被冻结这一步后，上文所述（步骤5.2）的管理单元。解冻后和纯化Hsp104然后必须立即用于生化分析的体积排阻色谱法（步骤3.9），然后立即执行。此外，感应步骤也可以精简到2个小时，在37 ° C，尽管这会减少整体产量。
潜在的并发症：这净化计 划是直截了当的。然而，下面讨论几个关键步骤和替代程序。
替代细胞裂解液：如果法国媒体不可用，然后溶菌酶超声治疗是一种有效的细胞裂解方法。裂解液悬浮细胞孵育20毫克，鸡蛋溶菌酶（Sigma公司），每1L -细胞沉淀上冰的2mg/ml溶菌酶终浓度为30分钟。细胞，然后为两个30秒，在9级阵阵使用微尖MisonixSonicator 3000超声。细胞悬液，孵育1分钟超声阵阵之间的冰。裂解时发生暂停改变粘度和颜色。上文所述（步骤2.4），细胞碎片，然后删除。法国媒体裂解是首选超声，因为这最大限度地减小了Hsp104 Hsp104活动的退化和丧失。
TEV蛋白酶解理：奇怪的是，pPROEX - HTB - Hsp104他的6个标签，尤其是耐TEV蛋白酶裂解和需要大约两倍TEV蛋白酶的量，制造商推荐的。删除此标记是pPROEX - HTB Hsp104 disaggregase活动干扰他的6个标签必不可少的，如果它不完全删除。如果功能齐全的6标签Hsp104是必需的（例如枯竭实验26）我们建议使用他的6个标签Hsp104泪液分泌与Lindquist 47，他的6个标记不影响disaggregase活动的26所描述的概念。这种蛋白质可以净化使用的协议，上述除TEV裂解步骤省略。
我们上文所述的协议比 26,47,48以前的方法是比较浅显的。速度和数量减少的步骤可以减少蛋白质的扰动，并因此得到高度纯化和积极Hsp104合适的结构和机理研究。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是支持由来自美国国立卫生研究院（5T32GM008275 22）和美国心脏协会predoctoral的奖学金（EAS）的赠款;化学生物学界面从美国国立卫生研究院（2T32GM071339 06A1）（MED）奖学金;和赠款，从国立卫生研究院（1DP2OD002177 - 01和NS067354 - 0110），埃利森医学基金会，比尔和梅林达盖茨基金会（JS）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BL21-CodonPlus-RIL Competent Cells | Stratagene, Agilent Technologies | 230255 | |
| 2XYT broth | USB Corp., Affymetrix | 75864 | |
| Complete, mini, EDTA-free protease inhibitor tablets | Roche Group | 1836170 | |
| Pepstatin A | Sigma-Aldrich | P4265 | |
| Ni-Sepharose 6 Fast Flow | GE Healthcare | 17-5318-02 | |
| Amicon Ultra-15 centrifugal filter units (MWCO 30,000) | EMD Millipore | UFC903008 | |
| Resource Q - 6ml column | GE Healthcare | 17-1179-01 | |
| proTEV Protease | Promega Corp. | V6052 | |
| AcTEV Protease | Invitrogen | 12575015 | |
| Superose 6 10/300 GL | GE Healthcare | 17-5172-01 | |
| Hsp40 | Assay Designs | SPP-400 | |
| Hsp72 | Assay Designs | ADI-NSP-555 |
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