Summary
यहाँ, हम अत्यधिक सक्रिय Hsp104, hexameric + खमीर, जो जोड़ों एटीपी प्रोटीन disaggregation hydrolysis से एएए प्रोटीन की शुद्धि के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन. इस योजना के कारनामे His6 टैग से आत्मीयता शुद्धि के लिए का निर्माण
Protocol
1. Hsp104 की अभिव्यक्ति
- प्लाज्मिड ई. में शुद्धि के लिए नियोजित कोलाई, pPROEX HTB-Hsp104 Hsp104 TRC 26 प्रमोटर के inducible नियंत्रण के तहत खुले पढ़ने फ्रेम शामिल हैं . प्लाज्मिड एन टर्मिनल उनकी 6 टैग कि TEV protease दरार द्वारा हटाया जा सकता है है के साथ Hsp104 उत्पादन. Codon - अनुकूलित ई. में pPROEX HTB-Hsp104 रूपांतरण कोलाई BL21 CodonPlus - आरआईएल (Stratagene, Agilent टेक्नोलॉजीज) कोशिकाओं को एक विशिष्ट जीवाणु परिवर्तन की प्रक्रिया का उपयोग कर (जैसे निर्माता के निर्देशों के अनुसार). यह एक codon अनुकूलित ई. का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है कोलाई तनाव है क्योंकि Hsp104 एक असामान्य codon पूर्वाग्रह है .
- 100μg/mL एम्पीसिलीन और ताजा transformants के साथ 34μg/mL chloramphenicol के साथ पूरक एक 100ml 2XYT संस्कृति को टीका लगाना (USB. नुस्खा: 16g / एल कैसिइन peptone, 10g / एल खमीर निकालने, 5g / एल NaCl, पीएच 7.0) और 37 पर रातोंरात बढ़ने ° 200rpm में झटकों के साथ सी.
- 6 एक्स 1L 2L बोतल में 100μg/mL एम्पीसिलीन और 34μg/mL chloramphenicol साथ 2XYT में रातोंरात संस्कृति के 10ml टीका लगाना. 37 600 ° सी आयुध डिपो जब तक 0.4-0.6 = 250rpm में हिलाओ. मिलाते हुए बंद करो और 15 से कम तापमान डिग्री सेल्सियस कोशिकाओं को इनक्यूबेटर में 30min के लिए unagitated संतुलित करना जब तक यह 15 डिग्री सेल्सियस तक पहुँच की अनुमति दें 15 एक बार ° सी 1mm की एक अंतिम एकाग्रता के लिए IPTG जोड़कर तक पहुँच जाता है प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रेरित. 250rpm पर रातोंरात मिलाते (12-16 घंटे) पुनरारंभ.
2. सेल हार्वेस्ट और lysis
- Centrifugation द्वारा हार्वेस्ट कोशिकाओं (एक precooled रोटर में) 4 में 20min के लिए 4000 rpm पर डिग्री सेल्सियस (हम एक Sorvall आर.सी. 3BP + अपकेंद्रित्र का उपयोग करें). बाद के चरणों का तुरंत निष्पादित किया जाना चाहिए, क्योंकि Hsp104 गतिविधि कम है जब ई. कोलाई कोशिकाओं जमे हुए हैं. इसके अलावा, बाद के सभी चरणों बर्फ पर या डिग्री सेल्सियस 4 में प्रदर्शन किया जाना चाहिए
- Prechilled में Resuspend सेल छर्रों (बर्फ पर) 10ml lysis बफर (40mm HEPES - KOH 7.4 पीएच, KCl 500mm, 20mm 2 MgCl, 2.5% (w / v) ग्लिसरॉल, 20mm imidazole, 5μM pepstatin, पूरा protease अवरोध करनेवाला (कॉकटेल 1 EDTA मुक्त) tablet/50mL, और β-mercaptoethanol 2mm).
- एक फ्रांसीसी प्रेस (Emulsiflex) homogenizer है कि एक गर्मी बर्फ के पानी में डूबे एक्सचेंजर का उपयोग करता है के साथ कोशिकाओं lyse. उपयोग के पहले, सुनिश्चित करें कि सभी सेल clumps solubilized किया गया है. Lysis बफर के साथ homogenizer equilibrating के बाद, 15,000-18,000 साई के एक दबाव के साथ सिलेंडर के माध्यम से दो गुजरता पूर्ण lysis के लिए पर्याप्त है. अगर एक फ्रांसीसी प्रेस उपलब्ध नहीं है, lysozyme साथ ऊष्मायन sonication द्वारा पीछा (चर्चा देखें) इस्तेमाल किया जा सकता है. एसडीएस - PAGE (1μL) विश्लेषण (छवि में lysate 2.) के लिए lysed कोशिकाओं की एक छोटा सा नमूना सहेजें.
- Centrifugation द्वारा 4 १६००० rpm पर सेल मलबे निकालें 20min के लिए डिग्री सेल्सियस (हम + centifuge Sorvall RC5C का उपयोग करें). अगले कदम के लिए सतह पर तैरनेवाला बनाए रखने और एसडीएस पृष्ठ विश्लेषण के लिए सतह पर तैरनेवाला का एक छोटा सा नमूना (1μL) को बचाने के (चित्र में नी लोड 2.)
3. Hsp104 शोधन
- 12mL lysis बफर equilibrated नी Sepharose मोती (जीई) का 50% घोल (2ml कोशिकाओं की 1L प्रति मोती नी Sepharose) के साथ 2.4 कदम से सतह पर तैरनेवाला मिक्स.
- नमूना धीरे धीरे 4 में 3 घंटे के लिए घुमाएँ डिग्री सेल्सियस ऐसी है कि नी Sepharose समान रूप से निलंबित कर दिया और frothing कम से कम है रहता है. छोटा ऊष्मायन बार संभव हो रहे हैं, लेकिन उपज कम हो जाएगा. 4 बजे ° सी protease inhibitors की उपस्थिति में, थोड़ा गिरावट होती है, और एक 3 घंटे ऊष्मायन नी Sepharose समय अंतिम उत्पाद की गतिविधि कमी नहीं है. 2 मिनट के लिए centrifugation द्वारा 4 नी Sepharose लीजिए ° सी 2000 पर rpm (Eppendorf 5810R अपकेंद्रित्र). एसडीएस PAGE विश्लेषण (1μL) के लिए सतह पर तैरनेवाला का एक छोटा सा नमूना सहेजें और बाकी त्यागें (नी के माध्यम से चित्र में फ्लो (एफटी) 2.).
- धोने (40mm HEPES - KOH 7.4 पीएच, KCl 150mm, 20mm 2 MgCl, 2.5% (w / v) ग्लिसरॉल, 20mm imidazole, 2mm β-mercaptoethanol) बफर, 5 के स्तंभ मात्रा के 25 कॉलम संस्करणों के साथ पुनः प्राप्त नी-Sepharose धो 1M KCl Hsp104 करने के लिए बाध्य electrostatically contaminants के, और धोने बफर के 25 कॉलम संस्करणों को हटाने के साथ बफर धोने. 2 मिनट के लिए centrifugation द्वारा प्रत्येक धोने के बाद 4 बजे नी Sepharose लीजिए ° सी +२००० पर rpm (Eppendorf 5810R अपकेंद्रित्र). प्रत्येक धोने और centrifugation चक्र के बाद, आकांक्षा से बफर हटा दें.
- 1ml नी Sepharose 1ml प्रति क्षालन (40mm HEPES - KOH 7.4 पीएच, KCl 150mm, 20mm 2 MgCl, 2.5% (w / v) ग्लिसरॉल, 350mm imidazole, 2mm β-mercaptoethanol) बफर और साथ elute Hsp104, नी - Sepharose मिश्रण 4 बजे ° 20 मिनट के लिए सी घुमाएगी. उच्च imidazole एकाग्रता नी मनका - उनकी 6 बातचीत बाधित. खाली centrifugation द्वारा 1.2 एमएल स्पिन (जैव रेड) में 4 पर 2 मिनट के लिए ° स्तंभों 2000 rpm (Eppendorf 5810R अपकेंद्रित्र) सी के साथ नी Sepharose निकालें. एसडीएस पृष्ठ विश्लेषण के लिए eluate के 1μL सहेजें (चित्र में नी eluate 2.). कक्षों के हर लीटर के लिए, ~ 15mg Hsp104 के इस कदम पर प्राप्त की है.
- बफर बफर क्यू (20mm Tris - एचसीएल 8 पीएच, 0.5mm EDTA, 5mm 2 MgCl, 50mm NaCl) में विनिमय eluate MWCO 30,000 Amicon अल्ट्रा (मिल का उपयोगlipore) 15ml केन्द्रापसारक concentrator इकाइयों. सबसे पहले, 1.5mL ~ प्रोटीन तो ध्यान केंद्रित करने के लिए प्रोटीन 10 गुना पतला बफर क्यू के 14.5mL जोड़ने. बफर आदान - प्रदान के लिए 3 बार दोहराएँ. बढ़ पीएच और कम नमक सुनिश्चित करता है कि Hsp104 एक उच्च नकारात्मक चार्ज है.
- Hsp104 आयनों विनिमय क्रोमैटोग्राफी एक बफर क्यू equilibrated संसाधन क्यू 6mL स्तंभ (जीई) का उपयोग के माध्यम से शुद्ध. इंजेक्शन से पहले, प्रोटीन कम प्रोटीन बाध्यकारी Millex जीपी PES झिल्ली 0.22μM सिरिंज फिल्टर (Millipore) के माध्यम से फ़िल्टर्ड है. हम 1mL/min की एक प्रवाह दर को रोजगार. दूर धो कमजोर बंधनकारी प्रोटीन 20% बफर के एक स्तंभ की मात्रा के साथ क्यू + (20mm Tris - एचसीएल 8 पीएच, 0.5mm EDTA, 5mm MgCl 2, 1M NaCl). रैखिक ढाल के साथ Elute Hsp104 (20% -50% बफर क्यू +) 5 स्तंभ मात्रा से अधिक (3 छवि). 1ml भिन्न लीजिए. Hsp104 और सबसे वेरिएंट आम तौर पर ~ 400mm NaCl (31mS/cm) में elute. एसडीएस PAGE विश्लेषण (3 छवि, इनसेट) के लिए पीक भिन्न (1μL) के नमूने सहेजें.
- उनकी छह टैग हटाने के लिए, विनिमय Amicon केन्द्रापसारक concentrator का उपयोग प्रोटीन के रूप में ऊपर दरार बफर (20mm HEPES - KOH 7.4 पीएच, KCl 140mm, और 10mm 2 MgCl) में (3.5 कदम देखें ) का वर्णन है. निर्माता के निर्देशों के अनुसार proTEV (Promega) protease या AcTEV protease (Invitrogen) का उपयोग करें. Hsp104 के लिए, हमने पाया है कि TEV protease के उच्च अनुपात: Hsp104 पूर्ण दरार के लिए आवश्यक हैं. हम 1 12μg Hsp104 प्रति protease इकाई के अनुपात का उपयोग करें. विखंडन 30 ° C पर 2-4 घंटे के लिए प्रदर्शन किया जाना चाहिए, उसके बाद 4 बजे एक 16 घंटे ऊष्मायन डिग्री सेल्सियस से अंतिम Hsp104 एकाग्रता 20-75μM monomer के बीच होना चाहिए. अतिरिक्त में दरार प्रतिक्रिया में Hsp104 की राशि (लगता है मोती पैक राल के एमएल प्रति प्रोटीन के 15mg बाध्य कर सकते हैं) नी Sepharose जोड़कर किसी भी शेष His6 टैग Hsp104 और नी Sepharose (जीई) के साथ TEV protease चूस लेना. खाली स्पिन कॉलम (जैव रेड) के साथ मोती 4 में 2,000 rpm पर 2min के लिए centrifuging ° सी. निकालें एसडीएस पृष्ठ के विश्लेषण के लिए दरार (1μL) के पहले और बाद में नमूने एकत्र करने के लिए दरार, और uncleaved प्रोटीन के हटाने (4 छवि) सुनिश्चित करने के लिए.
- आकार अपवर्जन (20mm HEPES - KOH 7.4 पीएच, 140mm KCl, 10mm 2 MgCl, 0.1mm EDTA, 1mm डीटीटी) बफर MWCO 30,000 Amicon अल्ट्रा (Millipore) का उपयोग कर के रूप में 3.5 चरण में वर्णित में विनिमय.
- इसके अलावा आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी के माध्यम से Hsp104 शुद्ध. आकार अपवर्जन बफर equilibrated Superose 6 या Superdex 200 स्तंभ (जीई से दोनों) (छवि 5) का प्रयोग करें. इंजेक्शन से पहले, प्रोटीन कम प्रोटीन बाध्यकारी Millex जीपी PES झिल्ली 0.22μM सिरिंज फिल्टर (Millipore) के माध्यम से फ़िल्टर्ड है. कम से कम प्रोटीन के 10mg के लिए, 10/300 आकार कॉलम (24mL) और इस्तेमाल किया जा सकता है 0.5ml भिन्न एकत्र कर रहे हैं. 10mg से अधिक नमूनों के लिए, 12/60 आकार स्तंभ (120ml) और प्रयोग किया जाना चाहिए 1 मिलीलीटर भिन्न एकत्र कर रहे हैं. प्रवाह दरों और नमूना मात्रा के लिए लोड किया जा के लिए निर्माता के निर्देशों का संदर्भ लें. शुद्धि के बाद, Hsp104 भिन्न जमा कर रहे हैं के रूप में छवि में दिखाया गया है. 5 और Amicon केन्द्रापसारक Concentrator इकाइयों (Millipore) में केंद्रित है. Hsp104 नीचे वर्णित के रूप में संग्रहीत किया जाता है. सामग्री के Hsp104 गिरावट उत्पादों और contaminants शुद्ध पूर्ण लंबाई Hsp104 के अंतिम उपज ~ 1 3mg संस्कृति शुरू की प्रति लीटर है अलग करने में नुकसान के कारण.
4. Hsp104 Disaggregase गतिविधि
- शुद्धि के बाद, यह अच्छा अभ्यास है एक disaggregation परख में Hsp104 गतिविधि का आकलन. आमतौर पर, हम एक luciferase पुनर्सक्रियन 2 परख (छवि 6) रोजगार. इस परख में, Hsp104 HSP70 निगरानी प्रणाली (HSP70 और Hsp40) यूरिया - विकृत जुगनू luciferase समुच्चय 2 disaggregates के साथ संयोजन के रूप में. घुलनशील luciferase oxyluciferin, एक प्रतिक्रिया है कि प्रकाश विज्ञप्ति luciferin के ऑक्सीकरण catalyzes. निगरानी luminescence, रिश्तेदार पुनर्सक्रियन, और disaggregation इसलिए, luciferase का निर्धारित किया जा सकता है. Hsp104 synergistically HSP70 सह निगरानी प्रणाली के साथ सहयोग करने में सक्षम होना चाहिए. बरामद luminescence की राशि सटीक HSP70 पर निर्भर करता है: Hsp40 जोड़ी का उपयोग किया. हम नियमित Hsp72 और Hsp40 (परख डिजाइन) रोजगार. Hsp40 अकेले (छवि 6): कम से कम, सक्रिय Hsp104 luciferase के पुनर्सक्रियन में 5 गुना वृद्धि हुई है जब Hsp72 द्वारा पुनर्सक्रियन की तुलना में उत्पादन करना चाहिए. Hsp104 तैयारी है कि गतिविधि के इस स्तर तक पहुंचने में विफल खारिज कर रहे हैं.
5. Hsp104 संग्रहण
- अल्पकालिक भंडारण के लिए, Hsp104 4 डिग्री सेल्सियस आकार अपवर्जन बफर में रखा जा सकता है. हालांकि, गतिविधि 2-3 दिनों के बाद 4 में 4 डिग्री सेल्सियस और तेजी से एक सप्ताह के बाद ° गिरावट आई है सी. Disaggregation assays के लिए हम अनुशंसा करते हैं कि Hsp104 शुद्धि के बाद जितनी जल्दी हो सके किया जाना चाहिए. आदर्श रूप में, Hsp104 amyloid disaggregation assays के लिए तत्काल किया जाना चाहिए.
- अगर लंबी अवधि के प्रोटीन संग्रहीत किया जाना चाहिए, Hsp104 भंडारण बफर (20mm HEPES - KOH 7.4 पीएच, 140mm KCl, 10mm 2 MgCl, 0.1mm EDTA, 1mm डीटीटी, 10% ग्लिसरॉल (w / v)) में बदल जाता है. 100μl aliquots तरल नाइट्रोजन में जमे हुए है और -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत तस्वीर रुक - पिघलना चक्र काफी Hsp104 गतिविधि को कम करनेऔर बचा जाना चाहिए. हम धीरे धीरे बर्फ पर Hsp104 विगलन की सलाह देते हैं. Amyloid-disaggregase गतिविधि में तेजी -80 में 1 महीने के बाद गिरावट आई है डिग्री सेल्सियस
6. प्रतिनिधि परिणाम और आंकड़े:
चित्रा 1. Hsp104 Bifunctional disaggregase है. बेक़ायदा समुच्चय (बाईं तरफ दिखाया गया है) के Disaggregation HSP70 निगरानी प्रणाली (HSP70 और Hsp40) 2 के सहयोग की आवश्यकता है. Hsp104 remodels HSP70 और Hsp40 की सहायता के बिना इन विट्रो में amyloid समुच्चय (सही पर दिखाया गया है) का आदेश दिया, लेकिन HSP70 और Hsp40 26,28 amyloid के खिलाफ Hsp104 गतिविधि में सुधार कर सकते हैं. एकत्रित संरचनाओं, Hsp104 जोड़े एटीपी अपने disaggregation को बढ़ावा देने के लिए केंद्रीय चैनल के माध्यम से सब्सट्रेट स्थानान्तरण करने के लिए hydrolysis के दोनों प्रकार के लिए. Tyrosine असर ताकना छोरों संलग्न और चैनल के माध्यम से केंद्रीय 49-52 शटल सब्सट्रेट.
चित्रा 2. नी sepharose आत्मीयता शुद्धि कदम का विश्लेषण एसडीएस पृष्ठ. Lysate, नी लोड, नी एफटी और नी eluate नमूने 4-20% Tris - एचसीएल 1.0mm मानदंड (जैव रेड) जेल और Coomassie दाग का उपयोग एसडीएस PAGE द्वारा fractionated थे . ध्यान दें कि नहीं Hsp104 सभी नी sepharose के लिए बाध्य करने में सक्षम है. ब्रॉड रेंज आणविक भार मार्कर (जैव रेड) (लेन बाएं) दिखाए जाते हैं.
चित्रा 3. संसाधन नी sepharose eluate के क्यू शुद्धि ब्लू ट्रेस 280nm और हरे रंग का पता लगाने में absorbance का प्रतिनिधित्व करता है.% बफर + क्यू (अधिकतम 50% पर) का प्रतिनिधित्व करता है. पहली चोटी है, जो 20% से कम elutes क्यू + दोष गिरावट उत्पादों और अनुचित तरीके से मुड़ा Hsp104 हैं. दूसरा और प्रमुख चोटी ठीक से मुड़ा और सक्रिय Hsp104 शामिल हैं. प्रवाह दर 1ml/min था. 20-50% क्यू + से ढाल 30 मिनट या 5 स्तंभ मात्रा है. इनसेट: पीक भिन्न एसडीएस पृष्ठ 4-20% Tris - एचसीएल 1.0mm मानदंड जेल (जैव रेड) और Coomassie दाग का उपयोग विश्लेषण द्वारा हल कर रहे हैं. ब्रॉड रेंज आणविक भार मार्कर (जैव रेड) (बाएं) दिखाए जाते हैं.
चित्रा 4. ProTEV protease दरार कदम के एसडीएस पृष्ठ संसाधन क्यू शुद्धि से. विश्लेषण उनकी 6-Hsp104 4 घंटे के लिए proTEV protease के साथ 30 डिग्री सेल्सियस और फिर 4 बजे 16 घंटे डिग्री सेल्सियस पर इलाज किया गया था नमूने एसडीएस PAGE द्वारा fractionated 4-20% Tris - एचसीएल 1.0mm मानदंड जेल (जैव रेड) और Coomassie दाग का उपयोग थे. ध्यान दें कि proTEV cleaved Hsp104 और अधिक तेजी से migrates. TEV protease और uncleaved Hsp104 नी Sepharose के साथ समाप्त हो गया है 3.7 चरण में वर्णित के रूप में. ब्रॉड रेंज आणविक भार मार्कर (जैव रेड) (बाएं) दिखाए जाते हैं.
चित्रा 5. Hsp104 की शुद्धि आकार अपवर्जन. Cleaved Hsp104 आगे Superose 6 जेल निस्पंदन स्तंभ (10/300, जीई) के माध्यम से शुद्ध किया गया था. प्रवाह दर = 0.4ml/min. धराशायी लाइनों के बीच शिखर जमा भिन्न प्रतिनिधित्व करता है. इनसेट: पीक भिन्न एसडीएस पृष्ठ 4-20% Tris - एचसीएल 1.0mm मानदंड जेल (जैव रेड) और Coomassie दाग का उपयोग विश्लेषण द्वारा हल कर रहे हैं. ब्रॉड रेंज आणविक भार मार्कर (जैव रेड) (बाएं) दिखाए जाते हैं.
चित्रा 6. Luciferase पुनर्सक्रियन परख. विकृत जुगनू luciferase समुच्चय (50nm) के साथ 25 डिग्री सेल्सियस पर या तो Hsp72 और Hsp40 (1μM) (दोनों परख डिजाइन से), Hsp104 (6μM monomer) या Hsp104, Hsp72 और Hsp40 90min के लिए incubated रहे थे विकृत luciferase केवल पूरी तरह से दोनों Hsp104 और Hsp40/Hsp72 की उपस्थिति में फिर सक्रिय है. बरामद luminescence एक अनंत M1000 प्लेट रीडर (Tecan) पर मापा जाता है. मान ± SEM (n = 3) का मतलब है प्रतिनिधित्व करते हैं.
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Discussion
समयरेखा: हम अधिक से अधिक Hsp104 गतिविधि के लिए सुझाव है कि पूरे शुद्धि योजना के रूप में तेजी से संभव के रूप में पूरा किया जाना. हालांकि, शुद्धि चरणों की संख्या एक मांग अनुसूची है कि हमेशा व्यावहारिक नहीं हो सकता है बनाता है. यदि शुद्धि कदम बाहर किया जाता है के रूप में जल्दी संभव के रूप में, 30 में 2-4 घंटे ऊष्मायन के माध्यम से रातोंरात अभिव्यक्ति के अंत से समय ° सी के साथ TEV protease लगभग 9-11 घंटे है. एक को थामने के लिए संभावित जगह TEV दरार कदम पीछा कर रहा है. अगर बिल्कुल आवश्यक Hsp104 इस कदम के बाद जमे हुए रूप में ऊपर वर्णित (5.2 चरण) स्नैप किया जा सकता है. आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी (3.9 चरण) तो तुरंत किया जाता है के बाद विगलन और शुद्ध Hsp104 तो जैव रासायनिक assays के लिए तुरंत इस्तेमाल किया जाना चाहिए. इसके अतिरिक्त प्रेरण कदम भी 37 पर 2 घंटे के लिए सुव्यवस्थित किया जा सकता है सी ° हालांकि यह कम कर देता है कुल उपज.
संभावित जटिलताओं: यह शुद्धि योजना सीधे आगे है. हालांकि, कुछ महत्वपूर्ण कदम और प्रक्रियाओं वैकल्पिक नीचे चर्चा कर रहे हैं.
वैकल्पिक सेल lysis: यदि एक फ्रांसीसी प्रेस उपलब्ध नहीं है, तो lysozyme sonication द्वारा पीछा उपचार एक प्रभावी सेल lysis विधि है. Lysis बफर resuspended कोशिकाओं 2mg/ml lysozyme की अंतिम एकाग्रता के लिए बर्फ पर 30 मिनट के लिए 1L सेल गोली प्रति मुर्गी अंडा lysozyme (सिग्मा) के 20mg के साथ incubated हैं. कोशिकाओं तो 9 स्तर पर दो 30 सेकंड फटना एक microtip के साथ एक 3000 MisonixSonicator का उपयोग के लिए sonicated हैं. सेल निलंबन sonication फटने के बीच में 1min के लिए बर्फ पर incubated है. Lysis जब निलंबन चिपचिपापन और रंग में परिवर्तन हुआ है. सेल मलबे फिर जैसा कि उपरोक्त वर्णित (2.4 चरण) निकाल दिया जाता है. फ्रेंच प्रेस lysis sonication पसंद है क्योंकि यह कम से कम Hsp104 गिरावट और Hsp104 गतिविधि के नुकसान.
TEV Protease विखंडन: मजे की बात है, pPROEX HTB-Hsp104 उनकी 6 टैग TEV protease द्वारा विशेष रूप से दरार करने के लिए प्रतिरोधी है और लगभग दो बार TEV protease की राशि निर्माता द्वारा सिफारिश की आवश्यकता है. इस टैग हटाना pPROEX - HTB उनकी छह टैग Hsp104 disaggregase गतिविधि के साथ हस्तक्षेप के रूप में आवश्यक है अगर यह पूरी तरह हटाया नहीं है. अगर पूरी तरह कार्यात्मक उनकी 6-टैग Hsp104 आवश्यक है (जैसे रिक्तीकरण 26 प्रयोगों के लिए) हम का उपयोग करने की सलाह देते हैं उनके 6-टैग Hsp104 निर्माण Schirmer और 47 Lindquist, जहां उनकी 6 टैग disaggregase 26 गतिविधि को प्रभावित नहीं करता है द्वारा वर्णित है. यह प्रोटीन प्रोटोकॉल TEV दरार कदम छोड़ा जाता है के अलावा ऊपर वर्णित का उपयोग कर शुद्ध किया जा सकता है है.
प्रोटोकॉल हम ऊपर उल्लिखित है पिछले 26,47,48 दृष्टिकोण से अधिक सतही है. कदम की तेज़ी और कम संख्या कम प्रोटीन की गड़बड़ी के लिए अनुमति देता है और इसलिए उच्च शुद्ध और सक्रिय Hsp104 संरचनात्मक और यंत्रवत अध्ययनों के लिए उपयुक्त पैदावार.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
यह काम (5T32GM008275 22) NIH और एक अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन predoctoral फेलोशिप (ईएएस के लिए) से एक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया, रसायन विज्ञान जीवविज्ञान (2T32GM071339 06A1) NIH (मेड करने के लिए) से इंटरफ़ेस फैलोशिप, और से अनुदान (1DP2OD002177-01 और NS067354 - 0,110) एनआईएच, एलिसन मेडिकल फाउंडेशन, और बिल और मेलिंडा गेट्स फाउंडेशन (जे एस के लिए).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BL21-CodonPlus-RIL Competent Cells | Stratagene, Agilent Technologies | 230255 | |
| 2XYT broth | USB Corp., Affymetrix | 75864 | |
| Complete, mini, EDTA-free protease inhibitor tablets | Roche Group | 1836170 | |
| Pepstatin A | Sigma-Aldrich | P4265 | |
| Ni-Sepharose 6 Fast Flow | GE Healthcare | 17-5318-02 | |
| Amicon Ultra-15 centrifugal filter units (MWCO 30,000) | EMD Millipore | UFC903008 | |
| Resource Q - 6ml column | GE Healthcare | 17-1179-01 | |
| proTEV Protease | Promega Corp. | V6052 | |
| AcTEV Protease | Invitrogen | 12575015 | |
| Superose 6 10/300 GL | GE Healthcare | 17-5172-01 | |
| Hsp40 | Assay Designs | SPP-400 | |
| Hsp72 | Assay Designs | ADI-NSP-555 |
References
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