Här beskriver vi ett protokoll för rening av mycket aktiva Hsp104, en hexameric AAA + protein från jäst, vilket par ATP hydrolys till protein uppdelning. Detta system utnyttjar en His6-märkta bygga för affinitet rening från<em> E. coli</em> Följt av anjon-utbyte kromatografi, His6-tagg borttagning med TEV proteas, och storlek-utanförskap kromatografi.
Hsp104 är en hexameric AAA + protein 1 från jäst, vilket par ATP hydrolys till protein uppdelning 20-10 (bild 1). Denna verksamhet tillför två viktiga selektiva fördelar. Först ger Återställande av oordnade aggregat efter Hsp104 jäst överlevnaden efter olika protein-misfolding påkänningar, inbegripet heat shock 3,5,11,12. För det andra möjliggör ombyggnad av kors-beta amyloidfibrerna av Hsp104 jäst att utnyttja myriad prioner (smittsamma amyloid) som en reservoar av nyttiga och ärftlig fenotypisk variation 13-22. Anmärkningsvärt, remodels Hsp104 direkt preamyloid oligomerer och fibriller amyloid, inklusive de består av proteiner jäst prioner Sup35 och Ure2 23-30. Detta amyloid-remodeling funktionalitet är en specialiserad aspekt av jäst Hsp104. E. coli orthologue, ClpB, underlåter att oligomerer omskapa preamyloid eller fibriller amyloid 26,31,32.
Hsp104 orthologues finns i alla riken i livet utom perplexingly, djur. I själva verket, om djurceller har någon enzymatisk system som par protein uppdelning till Återställande (i stället för nedbrytning) är okänd 33-35. Därför har vi och andra föreslagit att Hsp104 kan utvecklas som ett terapeutiskt medel för olika neurodegenerativa sjukdomar i samband med misfolding av specifika proteiner i giftiga preamyloid oligomerer och fibriller amyloid 4,7,23,36-38. Det finns inga behandlingar som inriktas direkt på den aggregerade arter i samband med dessa sjukdomar. Ändå löser Hsp104 toxiska oligomerer och fibriller amyloid som består av alfa-synuklein, som har samband med Parkinsons sjukdom 23 liksom former amyloid av PrP 39. Viktigt minskar Hsp104 proteinaggregering och ameliorates neurodegeneration i gnagarmodeller av Parkinsons sjukdom 23 och Huntingtons sjukdom 38. Helst för att optimera behandlingen och minimera biverkningar, skulle Hsp104 vara konstruerad och förstärkas för att selektivt omforma särskilda aggregat central för sjukdomen i fråga 4,7. Men den begränsade strukturella och mekanistiska förståelsen för hur Hsp104 disaggregates en så mångfacetterad repertoar av aggregerade strukturer och oberoende proteiner hämmar dessa strävanden 30,40-42.
För att förstå struktur och mekanism Hsp104 är det viktigt att studera rent protein och rekonstruera dess disaggregase aktivitet med minimal komponenter. Hsp104 är en 102kDa protein med en PI på ~ 5,3, vilket hexamerizes i närvaro av ADP och ATP, eller vid hög proteinhalt koncentrationer i avsaknad av nukleotid 43-46. Här beskriver vi ett optimerat protokoll för rening av mycket aktiva, stabila Hsp104 från E. coli. Användningen av E. coli kan förenklas storskalig produktion och vår metod kan utföras snabbt och tillförlitligt för många Hsp104 varianter. Vår protokoll ökar Hsp104 renhet och förenklar Hans 6-tagg bort jämfört med en tidigare reningsmetod från E. coli 47. Dessutom är våra protokoll mer lättvindigt och bekvämt än två nyare protokollen 26,48.
Tidslinje: För maximal Hsp104 aktivitet rekommenderar vi att hela reningen systemet slutföras så snabbt som möjligt. Gör dock att antalet reningssteg ett krävande schema som inte alltid praktiskt. Om reningssteg genomförs så snabbt som möjligt, tiden från slutet av natten uttryck genom till 2-4 timmars inkubation vid 30 ° C med TEV proteas är cirka 9-11 timmar. En möjlig plats att pausa följer TEV klyvning steg. Om det är absolut nödvändigt kan Hsp104 vara knäppa frysas efter detta steg som besk…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av ett bidrag från NIH (5T32GM008275-22) och en American Heart Association predoctoral gemenskap (till EAS), en kemi-biologi Interface stipendium från NIH (2T32GM071339-06A1) (till MED), och bidrag från NIH (1DP2OD002177-01 och NS067354-0110), The Ellison Medical Foundation och Bill and Melinda Gates Foundation (till JS).
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
---|---|---|
BL21-CodonPlus-RIL Competent Cells | Stratagene, Agilent Technologies | 230255 |
2XYT broth | USB | 75864 |
Complete, mini, EDTA-free protease inhibitor tablets | Roche | 1836170 |
Pepstatin A | Sigma | P4265 |
Ni-Sepharose 6 Fast Flow | GE Healthcare | 17-5318-02 |
Amicon Ultra-15 centrifugal filter units (MWCO 30,000) | Millipore | UFC903008 |
Resource Q – 6ml column | GE Healthcare | 17-1179-01 |
proTEV Protease | Promega | V6052 |
AcTEV Protease | Invitrogen | 12575015 |
Superose 6 10/300 GL | GE Healthcare | 17-5172-01 |
Hsp40 | Assay Designs | SPP-400 |
Hsp72 | Assay Designs | ADI-NSP-555 |