Aislamiento y cultivo de células troncales de la cresta neural de los folículos del cabello humano

Summary

En este artículo se presenta un robusto protocolo para el aislamiento y cultivo de células de la cresta neural madre de folículos pilosos humanos.

Abstract

Los folículos pilosos experimentan un crecimiento durante toda la vida y el ciclo del cabello es un proceso bien controlado que implica proliferación de células madre y la quiescencia. Bulto del pelo es un nicho bien caracterizado para las células madre adultas ^1. Este segmento de la vaina radicular externa contiene un número de tipos diferentes de células madre, incluyendo células madre epiteliales, células melanocitos ² madre ³ y de la cresta neural como las células madre ^4-7. Los folículos pilosos son una fuente rica y accesible para los diferentes tipos de células madre humanas. Nosotros y otros han aislado células madre de la cresta neural (CTCN) de folículos pilosos humanos fetales y adultos ^4,5. Estas células madre humanas son la etiqueta de retención de células y son capaces de auto-renovación a través de la división celular asimétrica in vitro. Ellos expresan marcadores neuronales inmaduras de células de la cresta, pero no marcadores de diferenciación. Nuestro estudio demostró que la expresión de perfiles que comparten un patrón de expresión génica similar con murino piel inmadura CRE neuralcélulas ST. Exhiben multipotencia clonal que puede dar lugar a linajes de células miogénicas, melanocíticos, y después neuronal en clonal in vitro de cultivo celular solo. Las células diferenciadas no sólo adquirir linaje marcadores específicos, sino también demostrar las funciones adecuadas en condiciones ex vivo. Además, estos CTCN mostrar potencial de diferenciación hacia linajes mesenquimales. Células neuronales diferenciadas pueden persistir en cerebro de ratón y retener marcadores neuronales de diferenciación. Se ha demostrado que el pelo del folículo derivado CTCN puede ayudar a la regeneración del nervio, y mejorar la función motora en los ratones trasplantados con estas células madre después de una lesión transección de la médula espinal ^8. Además, los nervios periféricos han sido reparados con injertos de células madre ^9, y la implantación de las células precursoras derivadas de la piel adyacentes a aplastadas nervios ciáticos se ha traducido en la remielinización ^10. Por lo tanto, los folículos pilosos / piel CTCN derivados ya han mostrado resultados prometedores para regenerative terapia en modelos preclínicos.

Reprogramación de células somáticas a madre pluripotentes inducidas (iPS) de células ha demostrado un enorme potencial para la medicina regenerativa. Sin embargo, existen todavía muchos problemas con las células iPS, en particular el efecto a largo plazo de la integración oncogén / virus y tumorigenicidad potencial de las células madre pluripotentes no han sido adecuadamente tratadas. Todavía hay muchos obstáculos que superar antes de que las células iPS pueden utilizarse para la medicina regenerativa. Mientras que las células madre adultas se sabe que son seguros y que se han usado clínicamente durante muchos años, tales como trasplante de médula ósea. Muchos pacientes se han beneficiado ya del tratamiento. Autólogo de células madre adultas son todavía células preferidas para el trasplante. Por lo tanto, las células adultas y de fácil acceso expandible madre en la piel humana / folículos pilosos son una valiosa fuente para la medicina regenerativa.

Protocol

1. Preparación de placas de cultivo tisular Escudo cada pocillo con suficiente poli-D-lisina (PDL) para cubrir el fondo del pozo. Dejar que las placas secar en la campana. Después de que los pozos están secos, enjuague con agua estéril y aspirar. Dejar que las placas secar en la campana. Cuando capa seca, con fibronectina (que se disolvió en agua BioWhittaker noche a 37 º C a una concentración de 1 mg en 6 ml). Añadir medio NCSC [95 ml de DMEM/F12, 1 ml Penn / Strep (P / …

Discussion

Los métodos de aislamiento de células y cultivo descritos son reproducible y robusto. Hemos generado CTCN de docenas de individuos a través de un amplio rango de edades. Aunque es mejor para procesar el tejido justo después de la cosecha de tejidos, se encontró que los tejidos del cuero cabelludo puede ser almacenado de forma segura en los medios de comunicación sobre hielo para el transporte durante la noche con un impacto mínimo sobre la viabilidad celular.

Es importante tratar el t…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
DMEM	Invitrogen	11965-092
DMEM/F12	Invitrogen	11330-32
Heat-inactivated FBS	Hyclone	SH30071.03
B27 supplement	Invitrogen	17504044
N2 supplement	Invitrogen	17502048
bFGF	Invitrogen	PHG0026
EGF	R&D system	236-EG-01M
IGF-I	R&D system	291-G1-050
0.05% Trypsin/EDTA	Invitrogen	25300-054
Dispase	Invitrogen	17105041
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15070063

Table 1.