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Neuroscience

अलगाव और तंत्रिका शिखा मानव बालों के रोम से स्टेम सेल के संस्कृति

doi: 10.3791/3194 Published: April 6, 2013

Summary

इस अनुच्छेद के अलगाव और मानव बालों के रोम से तंत्रिका शिखा स्टेम कोशिकाओं की संस्कृति के लिए एक मजबूत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है.

Protocol

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1. टिशू कल्चर प्लेट्स की तैयारी

  1. कोट के साथ एक अच्छी तरह से पाली-D-Lysine (PDL) अच्छी तरह से नीचे को कवर करने के लिए पर्याप्त है. प्लेटें हुड में शुष्क करने की अनुमति दें.
  2. बाद कुओं सूख रहे हैं, बाँझ पानी से कुल्ला, और aspirate. प्लेटें हुड में शुष्क करने की अनुमति दें.
  3. जब fibronectin साथ सूखी कोट (कि biowhittaker पानी में भंग कर दिया गया था रातोंरात 6 मिलीलीटर में 1 मिलीग्राम की एक एकाग्रता में 37 डिग्री सेल्सियस).
  4. जोड़ें NCSC मध्यम [95 मिलीलीटर DMEM/F12, 1 मिलीग्राम पेन / Strep (पी / एस), 1 मिलीग्राम N2, 2 B27 मिलीग्राम, 100 μl mercaptoethanol (2ME, 50 मिमी स्टॉक), bFGF (20 मध्यम एनजी / एमएल), IGF -1 (20 एनजी / मध्यम मिलीलीटर) और EGF (20 एनजी / मध्यम मिलीलीटर)] प्लेटों में पहले सूखा fibronectin,

2. मानव खोपड़ी से बाल कूप सेल निकालने के

  1. अलग NCSCs की प्रक्रिया शुरू करने से पहले, एक संबंधित medias अभिकर्मकों और तैयार (1 टेबल देखें) की जरूरत है.
  2. ताजा नया रूप प्रक्रियाओं या फ़े से वयस्क मानव खोपड़ी त्वचाताल खोपड़ी के ऊतकों एकत्र, पीबीएस पेनिसिलिन - स्ट्रेप्टोमाइसिन युक्त धोया.
  3. त्वचा तो 50 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित कर रहा है और रातोंरात Dispase (10 मिग्रा / मिली) के साथ DMEM में 4 डिग्री सेल्सियस पर incubated 2-4 घंटे के लिए 37 में ऊष्मायन सेल्सियस भी प्रभावी है. त्वचा टुकड़े 1 सेमी की एक अधिकतम चौड़ाई घुसना करने के लिए एंजाइम के लिए अनुमति देने के लिए किया जाना चाहिए.
  4. स्थानांतरण एक निष्फल पेट्री डिश में त्वचा, त्वचा से त्वचा की सतह के पास बाल शाफ्ट लोभी और मजबूती से और आसानी से खींच द्वारा प्रत्येक बाल खींच. बालों के रोम या तो (चित्रा 1 ए) ऐनाजेन या टेलोजन (चित्रा 1 बी) के morphology दिखा.
  5. 0.05% trypsin EDTA (Invitrogen) में 15-20 मिनट के लिए समय - समय पर झटकों के साथ कमरे के तापमान पर सेते पृथक कूप टुकड़े, 4 मिलीलीटर DMEM 10% FBS के साथ जोड़ने के लिए प्रतिक्रिया बंद करो. कूपिक उपकला trypsinized और 40 फिल्टर सुक्ष्ममापी के माध्यम से फ़िल्टर करने के लिए एक एकल कोशिका अलग आकार और आकार की कोशिकाओं से युक्त निलंबन प्राप्त कर रहे हैं.
  6. चक्रण5 मिनट के लिए 200 XG में, ध्यान से सतह पर तैरनेवाला त्यागें, 1 मिलीग्राम PBS 2% सीरम (FBS) को नियंत्रित करने में फिर से को निलंबित.
  7. वैकल्पिक रूप से, बालों के रोम plucked trypsin पाचन के बिना संस्कृति में रखा जा सकता है स्वस्थानी में बाल क्षेत्रों को विकसित करने के लिए.

3. बाल कूप फ्लो cytometric सेल छँटाई का उपयोग NCSCs का अलगाव

  1. बाल कूप एकल कोशिका निलंबन trypsin पाचन द्वारा प्राप्त किया गया और CD271 (APC संयुग्मित) / HNK1 (FITC संयुग्मित) या CD271 / अंधेरे में बर्फ पर 40 मिनट के लिए alpha4 Integrin (पीई संयुग्मित) के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ लेबल.
  2. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 200 XG पर अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला aspirate.
  3. PBS 2% सीरम (FBS) युक्त Resuspend कोशिकाओं, और सॉर्ट करने से पहले, पीआई मृत कोशिकाओं को बाहर फाटक के लिए जोड़ा गया है.
  4. सेल छँटाई प्रवाह cytometry (FACS) द्वारा निष्पादित करें. CD271 लीजिए + HNK1 + डबल सकारात्मक कोशिकाओं या CD271 +, alpha4 Integrin + डबल सकारात्मक कोशिकाओं (2 चित्रा).
  5. बाद तरहआईएनजी, CD271 + HNK1 + डबल सकारात्मक कोशिकाओं या CD271 +, alpha4 Integrin + डबल पॉजिटिव कोशिकाओं अल्ट्रा कम लगाव प्लेटों में NCSC मध्यम में संवर्धित कर रहे हैं

4. प्राथमिक NCSCs की संस्कृति

  1. संस्कृति disassociated पुटकीय कोशिकाएं या FACS अल्ट्रा कम NCSC माध्यम में अनुलग्नक प्लेटों में कोशिकाओं क्रमबद्ध मध्यम हर दिन बदल जाते हैं.
  2. खुर्दबीन के नीचे सेल संस्कृति हर दिन की जाँच करें. NCSCs कई दिनों और संस्कृति में 2-5 सप्ताह दाताओं (चित्रा 3A) के उम्र के आधार पर में अच्छी तरह से बनाई क्षेत्रों के बाद चल छोटे समुच्चय के रूप में शुरू कर देंगे. परिणाम उभाड़ना क्षेत्र और कई हफ्तों में स्वस्थानी में अच्छी तरह से बनाई क्षेत्रों (3B चित्रा) जब पूरे बालों के रोम NCSC मध्यम में संवर्धित कर रहे हैं पर कुछ ही दिनों में दिखाई देगा.

5. NCSCs का विस्तार

  1. पीबीएस के साथ कोशिकाओं को एक बार से धो लें.
  2. पूर्व गर्म जोड़ें (37 ° सी, महत्वपूर्ण) और 37 पर accutase सेते ° सी 5-10 के लिएमिलाते हुए समय - समय पर यकीन है कि तंत्रिका स्टेम सेल क्षेत्रों एकल कोशिका dissociated में बनाने के साथ मिनट (लगाव सुसंस्कृत NCSC, 37 पर accutase साथ सेते कोशिकाओं के लिए ° 5 मिनट के लिए बनाने के लिए यकीन है कि बाल कूप स्टेम कोशिकाओं को अलग सी).
  3. धो और कोशिकाओं अपकेंद्रित्र माध्यम DMEM/F12 में कमरे के तापमान पर 200 XG पर 5 मिनट के लिए दो बार के लिए किसी भी शेष accutase समाधान निकालने के.
  4. NCSC संस्कृति के माध्यम से कोशिकाओं को स्थगित कर देते हैं.
  5. अस्थायी संस्कृति के लिए, अल्ट्रा कम लगाव प्लेटों में कोशिकाओं डाला. लगाव संस्कृति के लिए, pretreated टिशू कल्चर प्लेट में कोशिकाओं डाला.

6. प्रतिनिधि परिणाम

NCSC संस्कृति के माध्यम फीडर कोशिकाओं के लिए आवश्यकता के बिना एक undifferentiated राज्य में hNCSCs को बनाए रखने के लिए पर्याप्त है. केरेटिनकोशिकाएं नहीं पैदा करना और धीरे धीरे मध्यम में मृत्यु हो गई. कुछ छोटे गोल कोशिकाओं पैदा करना और 3 से 5 दिनों के बाद निलंबन में छोटे समुच्चय के रूप में होगा. इन अस्थायी समुच्चय धीरे मैं वृद्धि हुईn आकार, उत्पन्न तीन आयामी क्षेत्र संरचनाओं की तरह है, जो हम बाल क्षेत्रों (चित्रा 3A) करार दिया. यदि लेपित प्लेटों में सुसंस्कृत NCSCs सतह के लिए देते हैं और किसी भी क्षेत्रों फार्म नहीं होगा. संलग्न NCSCs के निलंबन की तुलना में तेजी से बढ़ता है. क्षेत्र के गठन या संलग्न स्टेम कोशिकाओं NCSCs मार्करों व्यक्त करते हैं. जब पूरे बालों के रोम संस्कृतियों, क्षेत्रों उभाड़ना क्षेत्र (3B चित्रा) के लिए इसी क्षेत्र में बनते हैं.

चित्रा 1
चित्रा 1. (A) ऐनाजेन और टेलोजेन (बी) बालों के रोम plucked.

चित्रा 2
चित्रा 2. FACS विश्लेषण की NCSCs के प्रतिनिधि बाएं पैनल छवियों कोशिकाओं gated विरोधी CD271 और विरोधी alphe 4 Integrin एंटीबॉडी का उपयोग कर रहे हैं. सही पैनल: कोशिकाओं gated विरोधी CD271 और विरोधी HNK1 एंटीबॉडी का उपयोग कर रहे हैं.

चित्रा 3
चित्रा 3. बाल क्षेत्रों के अस्थायी बाल क्षेत्रों, बाएं पैनल के आकृति विज्ञान आकृति विज्ञान (ए): कम शक्ति, सही पैनल: उच्च शक्ति (बी) में स्वस्थानी बाल क्षेत्र के उभाड़ क्षेत्र, बाएं पैनल में आकृति विज्ञान: टेलोजन उभाड़ना में एक बाल क्षेत्र, सही पैनल: एक ऐनाजेन बाल कूप के उभाड़ क्षेत्र में एक बाल क्षेत्र.

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Discussion

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सेल अलगाव और संस्कृति वर्णित विधियों प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और मजबूत कर रहे हैं. हम एक व्यापक आयु सीमा के पार व्यक्तियों के दर्जनों से NCSCs उत्पन्न किया है. हालांकि यह सबसे अच्छा है ऊतक फसल के बाद सही ऊतक प्रक्रिया, हमने पाया है कि खोपड़ी के ऊतकों सुरक्षित सेल व्यवहार्यता पर न्यूनतम प्रभाव के साथ किया जा सकता है रातोंरात परिवहन के लिए बर्फ पर मीडिया में संग्रहीत.

यह महत्वपूर्ण है कि एंटीबायोटिक दवाओं के साथ खोपड़ी के ऊतकों के इलाज के है और बाल कूप अलगाव दौरान सड़न रोकनेवाला तकनीक का उपयोग करने के लिए संभावित सूक्ष्मजीव संक्रमण से बचने के. त्याग नया रूप त्वचा या भ्रूण व्यवहार्य के रोम की खोपड़ी के ऊतकों की पैदावार और आमतौर पर सैकड़ों FACS या केवल कुछ ही दिनों में छंटनी आगे के प्रयोगों के लिए पर्याप्त ऊतक उत्पन्न करते हैं. खोपड़ी के ऊतकों के पंच बायोप्सी आमतौर पर कोशिकाओं की सीमित संख्या उत्पन्न करता है और अतिरिक्त संस्कृति के ऊतकों की आवश्यकता है आगे के प्रयोगों के लिए पर्याप्त कोशिकाओं का उत्पादन.

भ्रूण NCSCs अलग से एक भीड़ को जन्म दे11 शरीर में सेल प्रकार, यह प्रतीत होता है है कि बाल व्युत्पन्न NCSCs भी कूप भेदभाव क्षमता का एक व्यापक स्पेक्ट्रम है. बाल उभाड़ना स्टेम कोशिकाओं 3,12 के विभिन्न प्रकार के लिए जगह है. Lyle और उनके सहयोगियों ने बाल उभाड़ना से मानव उपकला स्टेम कोशिकाओं के अलगाव में दिखाया गया है और इन कोशिकाओं उपकला 13 प्रजातियों के साथ कई शक्तिशाली हैं. मेलानोसाइट व्यापारियों को भी बाल उभाड़ना 3 में रहते हैं. इसलिए यह संभव है के लिए एक साथ संवर्धन बाल कूप व्युत्पन्न कोशिकाओं द्वारा वृद्धि कारकों के विभिन्न प्रकार के साथ माध्यमों में स्टेम कोशिकाओं के विभिन्न आबादी को अलग. बाल कूप व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं सेल पुनर्योजी चिकित्सा के लिए एक आशाजनक स्रोत हैं.

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Disclosures

हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

यह काम NIH अनुदान R01AR054593 और Xu के R01AR054593-S1 द्वारा समर्थित है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Invitrogen 11965-092
DMEM/F12 Invitrogen 11330-32
Heat-inactivated FBS Hyclone SH30071.03
B27 supplement Invitrogen 17504044
N2 supplement Invitrogen 17502048
bFGF Invitrogen PHG0026
EGF R&D system 236-EG-01M
IGF-I R&D system 291-G1-050
0.05% Trypsin/EDTA Invitrogen 25300-054
Dispase Invitrogen 17105041
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15070063

Table 1.

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References

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