Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

إعداد Synaptoneurosomes من اللحاء باستخدام الماوس متقطع التدرج الكثافة Percoll - السكروز

Published: September 17, 2011 doi: 10.3791/3196
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Waisman Center for Developmental Disabilities, University of Wisconsin, 2Department of Biochemistry, Waisman Center for Developmental Disabilities, University of Wisconsin

Summary

تم وصف طريقة لإعداد نشطة translationally ، synaptoneurosomes سليمة (SNS) من قشرة دماغ الفأر. الأسلوب يستخدم متقطع التدرج الكثافة Percoll - السكروز السماح للتحضير السريع لSNS النشطة.

Abstract

ويتم الحصول على Synaptoneurosomes (SNS) بعد التجانس والتجزئة من قشرة الدماغ الماوس. وأعادت أنهم حويصلات أو المحطات المعزولة التي كسر بعيدا عن محطات محوار عند النسيج المتجانس القشرية. وتحتفظ SNS الخصائص قبل وبعد المشبكي ، مما يجعلها مفيدة في دراسة انتقال متشابك. أنها تحتفظ الآلية الجزيئية المستخدمة في الإشارة العصبية وتكون قادرة على امتصاص وتخزين ، وإطلاق النواقل العصبية.

ويمكن إنتاج وعزلة SNS النشطة يكون إشكاليا باستخدام الوسائط مثل Ficoll ، والتي يمكن السامة للخلايا ويتطلب الطرد المركزي طويلة بسبب كثافة عالية ، وطرق الترشيح والطرد المركزي ، والذي يمكن أن يؤدي إلى انخفاض النشاط بسبب الاضرار الميكانيكية للSNS. ومع ذلك ، فإن استخدام متقطع التدرجات كثافة Percoll - السكروز لعزل SNS يوفر طريقة سريعة لإنتاج غلة جيدة من SNS translationally النشطة. أسلوب التدرج Percoll - السكروز سريع ولطيف لأنها توظف الظروف متساوي التوتر ، ويدور الطرد المركزي أقل وأقصر ويتجنب الخطوات الطرد المركزي التي SNS بيليه وإلحاق أضرار الميكانيكية.

Protocol

1. الاستعدادات 1-4

  1. تحضير 500 مل متوسطة الانحدار (GM) العازلة عن طريق خلط 50 مل من الطين السكروز 2.5 م ، 2.5 مل من حمض الهيدروكلوريك ، تريس 1M ، منظر pH7.5 ، و 0.1 مل من EDTA 0.5 متر ، ودرجة الحموضة 8.0 ملي الأسهم مع س للحجم المياه. فلتر تعقيم الحل ، قسامة وتخزين المجمدة.
  2. يعد من الأسهم 1000x سم الأسماك الرباعية الأسنان (TTX) بجعل حل 1 ملم في ملي - Q O. 2 H ويمكن تخزين Aliquots من TTX في -20 درجة مئوية.
  3. إعداد 10X الاحتياطي تحفيز بجعل حل تريس 100 ملم (7.5 درجة الحموضة) ، 5 مم نا 2 هبو 4 ، 4 ملم KH 2 ص 4 ، 40 ملم NaHCO 3 ، و 800 ملي مول كلوريد الصوديوم في المياه ملي - Q. ويمكن تخزين المخزون في 4 درجات مئوية.
  4. قبل أجهزة الطرد المركزي لتبريد 4 درجات مئوية.
  5. يعد حل سهم Percoll Isosmotic (SIP) وذلك بإضافة 9 مجلدات من Percoll (18 مل) إلى 1 السكروز حجم M 2.5 (2 مل) في ملي - Q الماء ومزيج جيد.
  6. إعداد 3 ، 10 ، 15 ، وطبقات متدرجة 23 ٪ عن طريق إضافة كميات منها إلى SIP العازلة جنرال موتورز وخلط كل منها :

الجدول 0

  1. صب طبقات متدرجة من قبل pipetting 2 مل من كل 23 ، 10 ، 15 ، و 3 ٪ حلول Percoll isosmotic في أنابيب الطرد المركزي بيكمان مع القبعات باستخدام P1000 جيلسون Pipetman. وينبغي أن التفاعل بين الطبقات يكون ملحوظ بوضوح مع عدم وجود اختلاط الطبقات. تخزين التدرجات في 4 درجات مئوية على الأقل 20 دقيقة قبل الاستخدام. ويمكن تخزين التدرجات لمدة تصل إلى 24 ساعة على الرغم من المستحسن استخدام نفس اليوم. [يجوز لموظفي المختبر عديم الخبرة الممارسة التدرجات إعداد بإضافة صبغة زرقاء للحلول Percoll isomotic لتصور من واجهات الطبقة.]

2. تشريح الفأر 1

  1. ضمان أن يتم تنفيذ كافة تربية الماوس والقتل الرحيم الإجراءات وفقا للمبادئ التوجيهية المعاهد الوطنية للصحة وجامعة. الموت ببطء الجراء (العمر لP13 P21) خنقا غاز ثاني أكسيد الكربون أو أسلوب المعتمد في بروتوكول الحيوان.
  2. دبوس الماوس إلى لوحة التشريح ورذاذ الجزء الخلفي من الرقبة والرأس مع الايثانول. باستخدام مقص حاد يقطع الحبل الشوكي عند قاعدة الجمجمة ، وإزالة الجلد من الجزء العلوي من الجمجمة ، وقطع الجمجمة أفقيا بين العظم الجداري والعظم بين الجداري أو بين المخ ومناطق القشرة. ثم قطع الجمجمة من القاعدة إلى الأنف (على طول الدرز sagital) ، إزالة بعناية العظم الجداري الناعمة عن طريق سحب كل نصف الكرة الأرضية إلى جانب وإزالة القشرة مع ملعقة. تضاف ملعقة في المخ والمخيخ فوق مغرفة ثم إلى القشرة ووضعه في المخزن جنرال موتورز الجليد الباردة. الشروع فورا في خطوة التجانس. لا تدع قشرات الجلوس في الجليد الباردة العازلة لمدة طويلة جدا حيث ان هذا سوف يؤثر سلبا على تشكيل SNS.

3. إعداد وجناسة SNS 1-4

  1. شطف قشرات في الجليد الباردة العازلة جنرال موتورز ونقل اثنين قشرات إلى الزجاج الخالط Dounce تحتوي على 5 مل من جنرال موتورز العازلة الباردة.
  2. المتجانس بلطف مع القشور من السكتات الدماغية 50-10 مدقة فضفاضة (مدقة "أ") ، تليها الجلطات 50-10 من مدقة ضيقة (مدقة "ب"). وينبغي أن يكون سريعا ولكن ضربات بطيئة بما يكفي كي لا تسبب فقاعات الهواء. صورة من بعد جناسة التجانس في مخطط 1. سيقوم عدد من السكتات الدماغية تختلف يعتمد على الفردية والمطاحن الخالط المرافق له. عندما أنهى التدرجات ينبغي إعطاء الفرقة SN قوية ، إن لم يكن ، وضبط عدد من السكتات الدماغية.
  3. نقل جناسة إلى 15 مليلتر المخروطية والطرد المركزي في 1000xg لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية في الدوار الدلو المتأرجح (أليجرا 6KR الطرد المركزي) على الحطام الخلوية بيليه والنوى. صورة من نسج جناسة في مخطط 1.
  4. طبقة 2 مل من طاف في Percoll - السكروز كأب ، والتدرج في الأنابيب ، وأجهزة الطرد المركزي في 32500 x ج لمدة 5 دقائق على 4 درجات مئوية في الدوار الزاوية الثابتة (بيكمان J2 - 21 الطرد المركزي ، JA - 17 الدوار) باستخدام محولات المناسب ( انظر الجدول الكواشف والمعدات).
  5. ماصة الخروج وتجاهل حل فوق الفرقة SN باستخدام ماصة باستير الزجاج. ماصة قبالة الشريط في واجهة SN 15/23 ٪ ، ونقل إلى المخروطية وتخزينها على الجليد. وسوف تدرج كل قشرة أو إنتاج one 0،9-1،1 مل من SN.
  6. ضبط تركيز الملح من SNS بإضافة واحد على عشرة من حجم 10X التحفيز العازلة ، إضافة CaCl 1000x 2 إلى التركيز النهائي من 12 نانومتر ، وإضافة الأسهم TTX 1 ملم الى تركيز النهائي من 1 ميكرومتر لقمع الإثارة غير محدد. (إضافة اختيارية CaCl 2 اذا كان ذلك يتعارض مع تطبيقات SN المصب).
  7. تحديد تركيز البروتين من SNS باستخدام بروتين BCA مايكرو أدوات الفحص. (لا ينصح فحص البروتين برادفورد بسبب الاستدلال من Percoll).
  8. ويمكن استخدام SNS مباشرة وبسرعة لtransla البروتيندراسات نشوئها. لتطبيقات أخرى قد تكون تنظيف SN lysate تتركز أعلى أو باستخدام SDS - PAGE بيرس كيت نموذج الإعدادية.

4. ممثل النتائج :

عندما كان المتجانس الماوس القشرة والمنفصلين عن التدرجات Percoll - السكروز المتقطعة (مخطط 1) ، والعصابات 6 أو الكسور شوهدت (الشكل 1). وقد تبين في وقت سابق انها لقشرة المخ 3،5 الفئران التي تم تقسيم الفرق المكونة من الوزن الجزيئي عالية غشاء الميلين ووأن المواد الواردة مكعبات أو عضيات الميتوكوندريا (الجدول 1). يرد 23 ٪ / واجهة 15 ٪ (باند 5) وSNS المخصب.

تمت إزالة الفرقة في واجهة / 23 ٪ 15 ٪ ، وتحتوي على SNS سليمة ، وفحصها بواسطة المجهر الإلكتروني (EM) كما هو موضح سابقا. 2،6 م وأظهرت وجود حويصلات متشابك سليمة والحفاظ على العناصر قبل المشبكي وبعد المشبكي (الشكل 2). العزلة من المقصورات قبل وبعد المشبكي المهم لفحص الإشارات وتخليق البروتين ، والذي يحدث في كل من المقصورات. 7-13 التدرج Percoll - السكروز هو تنقية الخام حتى رأينا التعديلات الخلوية ، والتلوث النووي وعضية في الكسر ولكن SN وكان الانفصال الكلي جيدة.

يرد الكسور Percoll عندما درست لطخة غربية ، وعلامات البروتين المتوقع مع زيادة في نقاء متشابك في الفرقة SN (الشكل 3 ، الجدول 2). وبقيت علامات العصبية ومتشابك في الفرقة SN المخصب (باند 5) ولكن تم تخفيض كبير في وفرة من علامات أخرى. على وجه الخصوص ، كان وجود GFAP ، وهي علامة للحصول على خلايا نجمية والأورام الدبقية المنشأ ، وامين - B1 ، علامة النووي ، ضئيلة ، في حين حافظت علامات الهيكلي ومتشابك أو محسنة. بالإضافة إلى ذلك ، كانت هناك علامات للاحتفاظ عضيات مثل الميتوكوندريا وغولجي ، التي تلعب دورا في تخليق البروتين.

وكانت غلة نموذجي للفرقة SN 250-500 نانوغرام من البروتين لكل ميكرولتر ، على النحو الذي يحدده فحص البروتين BCA. تم تحديد نشاط SNS بمقدار توليف البروتين دي نوفو الحاضر كما رصدتها [35S] - الأرصاد التأسيس (الشكل 4) ، وكان النشاط 2 بصل متعدية زيادة 1.56 أضعاف عندما حفزت SNS مع 50 ميكرومتر ميكرومتر glutamate/10 جليكاين (حمض الغلوتاميك) أو 5.12 أضعاف عند تفعيله مع جغلون Pin1 المانع. واضاف نحن ويعرف Pin1 تثبيط أن يؤدي إلى زيادة تخليق البروتين. 2 لتأكيد أن الزيادة في [35S] - الأرصاد التأسيس كان من المقرر ان تركيب البروتين دي نوفو ، 40 ميكرومتر anisomycin ، مثبط تخليق البروتين ، وشهدت انخفاضا ملحوظا في التأسيس في حضور وغياب حمض الغلوتاميك بالمقارنة مع المستويات القاعدية. أيضا ، عند إضافة 2 ٪ تريتون - X 100 ، مما يعطل سلامة SNS ، فقد انخفض الترجمة القاعدية بنسبة 75 ٪. (2) وبالإضافة إلى ذلك ، عند النظر في نطاقات (B4 - B6) التي أظهرت أن معظم تخصيب علامة متشابك ، كان SNS أو باند (5) وأكبر نشاط لتخليق البروتين دي نوفو (الشكل 5). وبالتالي ، فإن متقطع Percoll - السكروز التدرجات تنتج بسرعة نشطة للغاية والفرقة SN المخصب الذي يمكن استخدامه لدراسة الترجمة البروتين.

والتدرج الداخلي المتقطع Percoll - السكروز هو أكثر فائدة من وسائل أخرى لأنه ألحق أضرارا الميكانيكية أقسى الظروف. بالمقارنة مع طريقة الترشيح ، والتي برأت جناسة القشرية يتم تمريرها من خلال سلسلة من الفلاتر التي تقلل من حيث الحجم والأسلوب 3،14-15 Percoll أشكال أكثر جوهريه بمزيد من النشاط. كما يرى في الشكل (6) ، عندما تم تمرير قسامة من SNS أعدتها طريقة الترشيح على مدى الانحدار Percoll - السكروز هناك SNS أقل بكثير في واجهة 15/23 ٪ ، وزيادة كمية الأغشية المكسورة. كانت SNS أعدتها طريقة الترشيح عندما تم قياس دي نوفو عن طريق تخليق البروتين S35 التقى التأسيس ، بقدر أقل نشاطا (الشكل 7). لزيادة النشاط متعدية نستخدم الفئران التي هي بين سن P14 وP18. يمكن إعداد SN من فئران بالغة ، ولكن لاحظنا زيادة كبيرة في النشاط متعدية مع SN المحضرة من الفئران الأحداث (الشكل 8).

الجدول 1
الجدول 1. المكونة من عصابات من fractionations Percoll - التدرج متقطع من القشرة الماوس المتجانس. 3،5

الجدول 2
الجدول 2. ملخص تحليل الترباس الغربية متقطع Percoll - السكروز الفرقة المكونة التدرج. معزولة تركيزات البروتين النسبية لكل من الفرقة الكسور باستخدام Percol متقطعوتم تحديد L - السكروز التدرج لطخة غربية. لم الحاضر البروتين (--) ، 0 ≥ ​​0.2 (+) ، 0.2 ≥ 0.8 (++)،أو> = 0.8 (+++)أضعاف أكبر من البروتين في الحاضر ممثل طاف (S ، طرد جناسة القشرة) ، ن 3.

مخطط 1
مخطط 1 : رسم تخطيطي لإعداد SN متقطع باستخدام التدرج الكثافة Percoll - السكروز تم تشريح الدماغ قشرات الفأر ، المتجانس ، وطرد على سرعة منخفضة لإزالة غير المتجانس الأنسجة والخلايا والعضيات كلها مثل النواة والأغشية. يجب أن تحدد بوضوح طبقات متدرجة متقطعة. يظهر في الصورة أقحم مثالا للطبقات ، والتي تم مصبوغة باللون الأزرق لأغراض توضيحية فقط من أجل رؤية طبقات. والطبقات وطاف على رأس التدرج Percoll - السكروز متقطع وطرد على سرعة متوسطة. ثم يتم استرداد الفرقة SN من الانحدار وجاهزة للاستخدام.

الشكل 1
الشكل 1. جناسة تجزيء على التدرج Percoll - السكروز متقطعا. وكان المتجانس الماوس القشرة والمنفصلين على التدرج Percoll - السكروز متقطع مما أدى إلى 6 نطاقات أو الكسور. تم العثور على ، تنقية نشط SNS (*) في باند 5.

الشكل 2
الشكل 2. الاستعدادات SN تعطي خليط غير متجانس من العناصر التي تحتفظ SNS قبل المشبكي وبعد المشبكي. أجري صورة مجهرية الإلكترون من إعداد SN المحضرة من C57BL / 6 الفئران (سن P13 P21 ل) كما هو موضح سابقا SNS ويظهر مع الحفاظ على العناصر قبل المشبكي وبعد المشبكي 2 ، 6 نقطة الأسهم الحمراء إلى آخر متشابك الكثافة. شريط النطاق هو 1 ميكرون.

الشكل 3
الشكل 3. وأظهرت تحليلات لطخة الغربي من الاستعدادات التي تم الحفاظ SN علامات العصبية ومتشابك في SNS المنقى (باند 5) ولكن تم تخفيض كبير في وفرة من علامات أخرى. Immunoblots من طاف (S ، طرد جناسة القشرية) وشرائح 1-6 لالمتقطعة وقد بحث Percoll - السكروز التدرج لأكتين - β (الهيكلي ، ومراقبة التحميل) ، GFAP (نجمي) ، GP73 (غولجي) ، HSC70 (الهيولى والنووية) ، لامين - B1 (النووية) ، Prohibitin (الميتوكوندريا) ، PSD95 (الكثافة بعد المشبكي ) ، SNAP25 (متشابك) ، Synaptophysin (متشابك) وβ3 - تويولين (الخلايا العصبية الخاصة). كانت العصابات تصور باستخدام العاصفة 860 Phosphorimager ، ممثل ن = 3.

الشكل 4
الشكل 4. SNS تنشط ويحمل دي نوفو عن طريق تخليق البروتين [35S] - الأرصاد التأسيس. SNS كانت قبل معايرتها إلى 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. ثم كانت SNS غير المعالجة أو سابقة التجهيز لمدة 15 دقيقة مع 40 ميكرومتر anisomycin أو 1 جغلون ميكرومتر في 37 درجة مئوية تليها إضافة [35S] - الأرصاد ، 20 ميكرولتر تسمية برو اكسبريس ميكس S35 العلامات سهلة ، زائد أو ناقص حمض الغلوتاميك عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. وقد أعدت هذه العينات باستخدام SDS - PAGE بيرس كيت نموذج الإعدادية ، تعمل على هلام بولي أكريلاميد 15 ٪ ، والمجففة وquantitated باستخدام العاصفة حيوية الجزيئية 860 phosphorimager ، ممثل ن = 3 ، ± SEM.

الشكل 5
الشكل 5. ترد الفرقة 5 من التدرج Percoll - السكروز متقطعة على أعلى مستويات البروتين التوليف دي نوفو. وكانت العصابات 4 و 5 و 6 ، وطاف (S ، طرد جناسة القشرية) قبل معايرتها إلى 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. ثم ، [35S] كان المضافة الأرصاد ، وعبر عن تسمية ميكس برو S35 العلامات سهلة ، زائد أو ناقص حمض الغلوتاميك عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. وقد أعدت هذه العينات باستخدام SDS - PAGE بيرس كيت نموذج الإعدادية ، تعمل على هلام بولي أكريلاميد 15 ٪ ، والمجففة وquantitated باستخدام العاصفة حيوية الجزيئية 860 phosphorimager ، ممثل ن = 3 ، ± SEM.

الشكل 6
الشكل 6. SNS أعدت من أسلوب الترشيح تحتوي الأغشية أكثر مكسورة وكلها أقل من SNS SNS أعدت من أسلوب التدرج متقطع Percoll - السكروز. وأعدت SNS بتمرير قشرة المتجانس من خلال سلسلة من الفلاتر مع تناقص حجم المسام كما هو موضح سابقا. 3،14-15 كان طرد أحد قسامة من SNS أعدتها طريقة الترشيح على مدى الانحدار Percoll - السكروز متقطع وبالمقارنة مع مبلغ معادل المواد باستخدام أسلوب الانحدار متقطع Percoll - السكروز.

الشكل 7
الشكل 7. SNS أعدت من أسلوب الترشيح تحتوي على أقل من البروتين نوفو دي النشاط التجميعي من SNS أعد جيئة وذهابام وأسلوب التدرج متقطع Percoll - السكروز. وأعدت SNS بتمرير قشرة المتجانس من خلال سلسلة من الفلاتر مع تناقص حجم المسام كما هو موضح سابقا ، 3،14-15 وأساليب التدرج متقطع Percoll - السكروز. وكانت الاستعدادات على حد سواء من SNS قبل معايرتها إلى 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. ثم ، [35S] كان المضافة الأرصاد ، وعبر عن تسمية ميكس برو S35 العلامات سهلة ، زائد أو ناقص حمض الغلوتاميك عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. وقد أعدت هذه العينات باستخدام SDS - PAGE بيرس كيت نموذج الإعدادية ، تعمل على هلام بولي أكريلاميد 15 ٪ ، والمجففة وquantitated باستخدام العاصفة حيوية الجزيئية 860 phosphorimager ، ممثل ن = 3 ، ± SEM.

الشكل 8
الشكل 8. SNS من الفئران الأصغر (P14) ونشاط أكبر من كبار السن متعدية الفئران (P85). أعدت SNS من الفئران الذين تتراوح أعمارهم بين مختلف باستخدام أسلوب الانحدار Percoll متقطع ، السكروز ، preequilibrated عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة ، مع معالجة أو غير معالجة في حمض الغلوتاميك بحضور [35S] - الأرصاد (ميكس برو اكسبريس تسمية S35 العلامات سهلة) لمدة 30 دقيقة ، والمفاجئة المجمدة ، وتنظيفها في وقت لاحق مع SDS - PAGE بيرس نموذج طقم الإعدادية. تم تشغيل ثم SNS على جل SDS - بولي أكريلاميد 12 ٪ ، والمجففة وتصويرها على العاصفة حيوية الجزيئية 860 ممثل ، phosphorimager ن = 3 ، ± SEM. وكان من SNS P14 الفئران على الأقل 3 مرات أكثر نشاطا من P85 الفئران.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

والمتقطعة إعداد التدرج Percoll - السكروز الموصوفة هنا هو وسيلة سريعة وسيلة يمكن التعويل عليها لعزل SNS النشطة ، والتي يمكن استخدامها في مجموعة متنوعة من التجارب انتقال متشابك. هذا الأسلوب التدرج ، الذي يستند على طريقة وضعها Dunkley وآخرون ، هو 3،4 تجزيء الدماغ التحت خلوية الإجراء الذي يعزل كلا قبل وبعد المشبكي غشاء الحويصلات المشتقة التي ترتبط مع بعضها البعض. دون مزيد من تنقية هذه SNS متوافقة مع مجموعة متنوعة من تقنيات البيولوجيا الجزيئية ، بما في ذلك مناعي ، غرب النشاف التدفق الخلوي ، ورصد بروتين نوفو دي التوليف عبر [35S] - الأرصاد التأسيس ، المجهر الإلكتروني ، ومجموعة متنوعة من المقايسات نشاط انزيم بما في ذلك ومصاوغة المقايسات كيناز النشاط.

والتدرج الداخلي المتقطع Percoll - السكروز نسبيا على التوالي إلى الأمام ، إلا أنه هو مفتاح الحلول للحفاظ على المواد والدماغ في 4 درجات مئوية خلال إعداد والتدرجات ما قبل البرد. على الرغم من أن يتم الاحتفاظ جناسة الجليد الباردة في جميع الأوقات للتقليل من التحلل البروتيني ، من أجل تحسين غلة مع زيادة النشاط فمن الأفضل عدم السماح للقشرات الجلوس على الجليد في المخزن وقتا طويلا قبل جنرال موتورز التجانس. تشكيل SNS هو أفضل عند القشور وتشطف ومتجانسة ثم وجه السرعة. وجناسة ، ومع ذلك ، يمكن أن تبقى على الجليد قبل الطرد المركزي الأولي دون آثار مناوئة. السرعة هي قضية بمجرد حصاد القشور ، ولذلك يجب الانتهاء من عزلة SNS بأسرع وقت ممكن. على الرغم من SNS يمكن الاحتفاظ عالية النشاط لمدة 1-2 ساعات ، وفترات طويلة من الزمن بين خطوات تؤدي إلى انخفاض النشاط. عمر الفئران المستخدمة في إعداد SN هي أيضا قضية أساسية. فقد تبين في وقت سابق ان هناك انخفاضا في سن المتصلة اللدونة متشابك في القوارض. 16-19 شهدنا نفس التأثير في SNS. على الرغم من أن كبار السن يمكن أن تستخدم لجعل الفئران SNS translationally نشطة ، فقد وجدنا أن الفئران الأصغر (P14) ونشاط أكبر متعدية ثم أقدم الفئران (P85).

هناك اختلافات عديدة ومجموعات من الترشيح ، والطرد المركزي 5،14-15،20-23 ، 24-27 26-29 وأساليب التدرج التي استخدمت لإعداد SNS ولكل منها مزاياه وعيوبه. يمكن طرق الترشيح والطرد المركزي تسبب أضرارا ميكانيكية للSNS. نتج عن الأساليب التي استخدمت مرشحات مختلفة الحجم المسام في نسبة أكبر من المحصول وكسر الأغشية SNS أقل بكثير. حاولنا أسلوب التصفية ، 5،14-15 التي يمر جناسة من خلال سلسلة من الفلاتر مع تقليل حجم المسام وجدت أن SNS أعدتها طريقة الترشيح كانوا أقل نشاطا. أساليب الطرد المركزي يؤدي أيضا إلى التلف الميكانيكي بسبب يدور بسرعات عالية لفترات طويلة والتي بيليه أو ضغط جوهريه في الجزء السفلي من الأنابيب ، وتتطلب إعادة تعليق. Percoll توظف أكثر اعتدالا الظروف التي تجنب التصفية أو التكوير وجوهريه ، والتي يمكن سحق أو ليز للSNS. SN الإجراءات التي تستخدم Ficoll 28،30-32 أو molarities عالية من السكروز أيضا نتيجة 4،31 في SNS التالفة أو أقل نشاطا ، وضعف الوظيفة البيولوجية تغيرات شكلية يمكن 31-32 Ficoll سبب غير المرغوب فيه تجميع الخلية عند pH الفيزيولوجية ويعطي التدرجات التناضحي مع زيادة تركيزات. 31-32 لإبقاء الأوضاع isoosmotic ، والتدرجات والحصول على تعويض عن الانحدار مع الملح (31). SNS أعدت مع تركيزات عالية من السكروز (1،4-0،8 م) نتيجة في SNS أصغر حجما وأقل نشاطا. 4

والمتقطعة Percoll - السكروز الطريقة يتغلب على كثير من القضايا المطروحة مع الوسائط الأخرى ، وإجراءات الطرد المركزي. والميزة الرئيسية لهذا الأسلوب هو استخدام Percoll ، التي لديها منخفضة اللزوجة ، الأسمولية منخفضة نسبيا وليس سمية تجاه الخلايا ومكوناتها ، مما يجعلها أكثر ملاءمة للتجارب متدرجة الكثافة من البدائل. 4،29 بالإضافة إلى ذلك ، يمكن Percoll تكون مستعدة مع السكروز للحفاظ على الأسمولية اللازمة للاحتفاظ SN النزاهة. 4 استخدام متقطع Percoll - السكروز التدرجات الطرد المركزي يقلل من الوقت 30-45 دقيقة إلى 5 دقائق ، وبالتالي تمديد عمر مفيدا للSNS ، التي لها عمر محدود للنشاط . ميزة أخرى من التدرجات Percoll هو عائد أعلى ونشاط SNS بالمقارنة مع الأساليب التي تستخدم المرشحات لتشكيل SNS. ركضنا في SNS من أسلوب التصفية على مدى الانحدار Percoll - السكروز. وجدنا الفرقة SN بالكاد يمكن تمييزه وفرة من ارتفاع الوزن الجزيئي كسر الأغشية على التدرج. أيضا ، كان النشاط متعدية من SNS أعدتها الأسلوب Percoll أعلى بكثير مع أسلوب التصفية. عموما ، من الأفضل Percoll إلى أساليب أخرى لأنها توظف أكثر اعتدالا الظروف التي تجنب التصفية والتكوير وresultin SNSز الاحتفاظ بمزيد من النشاط متشابك وأفضل تشكيل الحويصلة. ميزة لدينا أكثر من طريقة Dunkley ، وآخرون ، هو أن 3،4 الزجاج ، كان يستخدم الزجاج Dounce الخالط هنا على عكس بالمواتير التفلون ، والزجاج الخالط الذي يتعرض له معظم الأضرار التجهيزات الطرفية بعد المشبكي ويؤدي إلى العناصر بعد المشبكي إلى يجري المغلقة وسائل الإعلام وعدد قليل جدا من الأغشية سليمة.

وقد تركز عمل كبير على تخليق البروتين في كثافة بعد متشابك 11-13 ، ولكن تم القيام به القليل من العمل لدراسة تخليق البروتين في المقصورات قبل المشبكي. ومع ذلك ، هناك أدلة على أن تخليق البروتين يحدث في محطات قبل المشبكي. 70-10 وكما يتبين في صورة مجهرية الإلكترون من SNS ، التجهيزات قبل وبعد المشبكي موجود في إعداد SN جعلها نظاما مثاليا لدراسة مستقبل النشاط متعدية في كل من المقصورات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

نود أن نشكر BK أغسطس من جامعة ويسكونسن ماديسون مرفق المجهر الالكتروني للالمجهر الإلكتروني. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح R01 - DA026067 وP30 - HD03352 (للشبيبة).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
Micro BCA Protein Assay Kit Pierce 23235  
CaCl2 Fisher C79-500  
CO2 gas Airgas (UW-MDS) CD 50  
EDTA RPI E57020  
EtOH Fisher A407SK-4  
HCl Fisher A142-212  
Percoll GE Healthcare 17-0891-01  
KH2PO4 Fisher P285-500  
PierceSDS-PAGE Sample Prep Kit Pierce 89888  
NaCl RPI S23020  
NaHCO3 Fisher BP328-500  
Na2PHO4 Fisher S381-500  
Sucrose RPI S24060  
Tris Base RPI T60040  
Tetrodotoxin Sigma T5651  
Express Pro Label Mix S35 Easy Tag Perkin Elmer NEG772  
       
Equipment Company Catalogue number Comments (optional)
Dissection tools      
Dounce homogenizer, 7 mL (comes with two glass pestles labled " A" and "B") Wheaton    
P1000 Gilson Pipetman Gilson F123602  
Allegra 6KR Centrifuge Beckman Coulter 366830  
GH 3.8 Rotor, Swinging bucket rotor Beckman Coulter 360581  
Beckman J2-21 Centrifuge Beckman    
Beckman tubes with caps Beckman 355672  
White walled adapters Beckman 342327  
Blue walled adapters Beckman    
JA-17 Rotor, Fixed-angle rotor Beckman 369691  

Table of antibodies used for western blots:
Name of Antibody Company Catalogue number Host Species
β-Actin Sigma A5441 mouse
GFAP Santa Cruz sc-65343 mouse
GP73 Santa Cruz Sc-134509 rabbit
HSC70 Santa Cruz sc-7298 mouse
Laminβ Santa Cruz Sc-6261 goat
Prohibitin Santa Cruz sc-28259 rabbit
PSD95 Millipore MAB1596 mouse
SNAP25 AbCam ab5666-100 rabbit
Synaptophysin Millipore MAB368 mouse
β-3-Tubulin Santa Cruz sc-80016 mouse

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Westmark, C. J., Malter, J. S. FMRP mediates mGluR5-dependent translation of amyloid precursor protein. PLoS Biol. 5, e52-e52 (2007).
  2. Westmark, P. R., Westmark, C. J., Wang, S., Levenson, J., O'Riordan, K. J., Burger, C., Malter, J. S. Pin1 and PKMzeta sequentially control dendritic protein synthesis. Sci Signal. 3, ra18-ra18 (2010).
  3. Dunkley, P. R., Heath, J. W., Harrison, S. M., Jarvie, P. E., Glenfield, P. J., Rostas, J. A. A rapid Percoll gradient procedure for isolation of synaptosomes directly from an S1 fraction: Homogeneity and morphology of subcellular fractions. Brain Res. 441, 59-71 (1988).
  4. Dunkley, P. R., Jarvie, P. E., Robinson, P. J. A rapid Percoll gradient procedure for preparation of synaptosomes. Nat. Protoc. 3, 1718-1728 (2008).
  5. Hollingsworth, E. B., McNeal, E. T., Burton, J. L., Williams, R. J., Daly, J. W., Creveling, C. R. Biochemical characterization of a filtered synaptoneurosome preparation from guinea pig cerebral cortex: cyclic adenosine 3':5'-monophosphate-generating systems, receptors, and enzymes. J. Neurosci. 5, 2240-2253 (1985).
  6. Yi, H., Leunissen, J., Shi, G., Gutekunst, C., Hersch, S. A novel procedure for pre-embedding double immunogold-silver labeling at the ultrastructural level. J. Histochem. Cytochem. 49, 279-284 (2001).
  7. Akins, M. R., Berk-Rauch, H. E., Fallon, J. R. Presynaptic translation: stepping out of the postsynaptic shadow. Front. Neural Circuits. 3, (2009).
  8. Jin, I., Kandel, E. R., Hawkins, R. D. Whereas short-term facilitation is presynaptic, intermediate-term facilitation involves both presynaptic and postsynaptic protein kinases and protein synthesis. Learn. Mem. 18, 96-102 (2011).
  9. Lyles, V., Zhao, Y., Martin, K. C. Synapse formation and mRNA localization in cultured Aplysia neurons. Neuron. 49, 349-356 (2006).
  10. Wagatsuma, A., Azami, S., Sakura, M., Hatakeyama, D., Aonuma, H., Ito, E. De Novo synthesis of CREB in a presynaptic neuron is required for synaptic enhancement involved in memory consolidation. J. Neurosci. Res. 84, 954-9560 (2006).
  11. Sutton, M. A., Schuman, E. M. Local translational control in dendrites and its role in long-term synaptic plasticity. J. Neurobiol. 64, 116-131 (2005).
  12. Li, K. -W., Hornshaw, M. P., Van der Schors, R. C., Watson, R., Tate, S., Casetta, B., Jimenez, C. R. Proteomics analysis of rat brain postsynaptic density: implications of the diverse protein functional groups for the integration of synaptic physiology. J. Biol. Chem. 279, 987-1002 (2004).
  13. Peng, J., Kim, M. J., Cheng, D., Duong, D. M., Gygi, S. P., Sheng, M. Semi-quantitative proteomic analysis of rat forebrain postsynaptic density fractions by mass spectrometry. J. Biol. Chem. 279, 21003-21011 (2004).
  14. Kim, S. H., Fraser, P. E., Westaway, D., St. George-Hyslop, P. H. Group II metabotropic glutamate receptor stimulation triggers production and release of Alzheimer's amyloid β42 from isolated intact nerve terminals. J. Neurosci. 30, 3870-3875 (2010).
  15. Weiler, I. J., Greenough, W. T. Potassium ion stimulation triggers protein translation in synaptoneurosomal poiyribosomes. Mol. Cell. Neurosci. 2, 305-314 (1993).
  16. Billard, J. M. Ageing, hippocampal synaptic activity and magnesium. Magnes Res. 19, 199-215 (2006).
  17. Murphy, G. G., Fedorov, N. B., Giese, K. P., Ohno, M., Friedman, E., Chen, R., Silva, A. J. Increased neuronal excitability, synaptic plasticity, and learning in aged Kvbeta1.1 knockout mice. Curr. Biol. 14, 1907-1915 (2004).
  18. Norris, C. M., Halpain, S., Foster, T. C. Reversal of Age-Related Alterations in Synaptic Plasticity by Blockade of L-Type Ca21 Channels. J. Neurosci. 18, 3171-3179 (1998).
  19. Sallert, M., Malkki, H., Segersträlea, M., Tairaa, T., Lauri, S. E. Effects of the kainate receptor agonist ATPA on glutamatergic synaptic transmission and plasticity during early postnatal development. Neuropharm. 52, 1354-1365 (2007).
  20. Quinlan, E. M., Philpot, B. D., Huganir, R. L., Bear, M. F. Rapid, experience-dependent expression of synaptic NMDA receptors in visual cortex in vivo. Nat. Neurosci. 2, 357-35 (1999).
  21. Scheetz, A. J., Nairn, A. C., Constantine-Patton, M. NMDA receptor-mediated control of proteins synthesis at developing synapses. Nat. Neurosci. 3, 211-216 (2000).
  22. Villasana, L. E., Klann, E., Tejada-Simon, M. V. Rapid isolation of synaptoneurosomes and postsynaptic densities from adult mouse hippocampus. J. Neurosci. Methods. 158, 30-36 (2006).
  23. Weiler, I. J., Greenough, W. T. Metabotropic glutamate receptors trigger postsynaptic protein synthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 7168-7171 (1993).
  24. Gray, E. G., Whittaker, V. P. The isolation of nerve endings from brain: An electron microscopic study of cell fragments derived by homogenization and centrifugation. J. Anat. 96, 79-88 (1962).
  25. Gylys, K. H., Fein, J. A., Yang, F., Cole, G. M. Enrichment of Presynaptic and Postsynaptic Markers by Size-Based Gating Analysis of Synaptosome Preparations From Rat and Human Cortex. Cytometry A. 60, 90-96 (2004).
  26. Hajós, F. An improved method for the preparation of synaptosomal fractions in high purity. Brain Res. 93, 485-489 (1975).
  27. Bai, F., Witzmann, F. A. Synaptosome Proteomics. Subcell. Biochem. 43, 77-98 (2007).
  28. Rao, A., Steward, O. Evidence that protein constituents of postsynaptic membrane specializations are locally synthesized: analysis of proteins synthesized within synaptosomes. J Neurosci. 11, 2881-2895 (1991).
  29. Pertoft, H., Laurent, T. C. Isopycnic separation of cells and cell organelles by centrifugation and modified colloidal silica gradients. Methods of Cell Separation. Catsimpoolas, N. , Plenum Press. New York. 25-65 (1977).
  30. Ramarao, C. S., Acharya, S. R., Krishnan, K. S., Kenkare, U. W. High affinity uptake of L-glutamate and γ-aminobutyric acid in Drosophila melanogaster. J. Biosci. 11, 119-135 (1987).
  31. Munteanu, L. S., Dinu, A. Fractionation of granulocytes from whole human blood by centrifugation. Practical hints. Romanian J. Biophys. 14, 53-58 (2004).
  32. Cell separation composition, kit and method. US patent. Vlasselaer, P., Van Palathumpat, V. , 019713 (1997).

Tags

علم الأعصاب ، العدد 55 ، synaptoneurosomes ، synaptosomes ، Percoll - السكروز التدرجات ، الخلايا العصبية ، المشبك ، القشرة ، والماوس
إعداد Synaptoneurosomes من اللحاء باستخدام الماوس متقطع التدرج الكثافة Percoll - السكروز
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Westmark, P. R., Westmark, C. J.,… More

Westmark, P. R., Westmark, C. J., Jeevananthan, A., Malter, J. S. Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient. J. Vis. Exp. (55), e3196, doi:10.3791/3196 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter