Summary
마우스 뇌 피질에서 translationally 활성화, 손상 synaptoneurosomes (SNS)를 준비하는 방법을 설명합니다. 이 메서드는 활성화된 SNS의 빠른 준비를 위해 허용하는 불연속 Percoll - 자당 밀도 기울기를 사용합니다.
Abstract
Synaptoneurosomes (SNS)는 마우스 뇌 피질의 균질화 및 분별화 후 얻을 수 있습니다. 그들은 vesicles 또는 대뇌 피질의 조직이 균질 때 축삭 터미널에서 멀리 휴식 격리 터미널을 resealed 있습니다. SNS는 시냅스 전달의 연구에 유용하게하는, 사전과 postsynaptic 특성을 보유합니다. 그들의 연결 신호에 사용되는 분자 기계를 유지하고 이해, 스토리지 및 신경 전달 물질의 릴리스 할 수 있습니다.
적극적인 SNS의 생산과 격리 세포 독성하고 의한 SNS의 기계적 손상이 낮은 활동에 발생할 수 고밀도, 그리고 여과 및 원심 분리 방식에 의한 확장 원심 분리를 요구할 수 Ficoll 같은 문제를 사용하여 medias 수 있습니다. 그러나, SNS를 분리 불연속 Percoll - 자당 밀도 그라디언트의 사용 translationally 적극적인 SNS의 좋은 수율을 생산하는 빠른 방법을 제공합니다. 이 펠렛 SNS 그리고이 기계 고장의 원인이되는, isotonic 조건을 고용하고 적은 짧은 원심 분리를 돌면서을 보유하고 원심 분리 단계를 피할 수로 Percoll - 자당 기울기 방법은 신속하고 부드러운 있습니다.
Protocol
1. 준비 1-4
- 2.5 M의 자당 슬러리의 50 ML을 혼합하여 500 그라디언트 매체의 ML (GM) 버퍼를 준비, 1M 트리스 - HCL, pH7.5 주식 및 0.5 m EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 0.1 ML 2.5 ML, 산도와 8.0 주식 밀리 볼륨 Q 물. 솔루션 나누어지는 및 저장 냉동을 소독 필터.
- 밀리 Q H 2 O.에서 1 ㎜ 솔루션을 만들어 테트로도톡신 (TTX)의 1000x 재고를 준비 TTX의 Aliquots는 -20 ° C.에 저장할 수 있습니다
- 밀리 Q 물 100 MM 트리스 (산도 7.5), 5 솔루션 MM 나 2 HPO 4, 4 MM KH 2 PO 4, 40 MM NaHCO 3, 800 MM NaCl을 만들어 10X 자극 버퍼를 준비합니다. 주식은 4 저장할 수 있습니다 ° C.
- 사전 냉각 원심 분리기에 4 ° C.
- 밀리 Q 물 2.5 M의 자당 (2 ML) 1 볼륨에 Percoll (18 ML) 9 볼륨을 추가하여 Isosmotic Percoll (SIP)의 주식 솔루션을 준비하고 잘 섞는다.
- GM 버퍼 SIP의 각 금액을 추가하고 각각을 혼합하여 3, 10, 15, 23 %의 그라데이션 레이어를 준비 :
- P1000 Gilson Pipetman을 사용하여 대문자로 베크 만의 원심 튜브에 2 ML 23, 15, 10 각각 3 % isosmotic Percoll 솔루션을 pipetting하여 그라데이션 레이어를 붓고. 레이어 사이의 인터페이스는 레이어없이 혼합과 함께 명확하게 뚜렷한해야합니다. 사용하기 전에 적어도 20 분 4 ° C에서 그라디언트를 저장합니다. 당일 사용이 권장되지만 그라디언트 24까지 시간 동안 저장할 수 있습니다. [경험 실험실 인원은 레이어 인터페이스의 시각화를위한 isomotic Percoll 솔루션 파란색 염료를 추가하여 준비 그라디언트를 연습할 수 있습니다.]
2. 마우스 해부 1
- 모든 마우스 축산과 안락사 절차 NIH 대학 지침에 따라 수행되었는지 확인합니다. 이산화탄소 질식이나 동물 프로토콜의 승인하는 방법으로 새끼 (연령 P13로 P21)를 안락사.
- 해부 보드에 마우스를 핀과 에탄올과 목 및 머리의 뒤쪽을 스프레이. 두개골의 기지에서 척수를 통해자를 날카로운 가위를 사용하여, 두개골의 맨에서 피부를 제거 정수리 뼈 및 interparietal 뼈 사이에 또는의 꿈과 피질 영역 사이에 옆으로 두개골을 잘라. 그런 다음 기지에서 코 (sagital 봉합 따라)에 두개골을 잘라, 조심스럽게 옆으로 각 반구를 당겨 부드러운 정수리 뼈를 제거하고 주걱으로 피질을 제거합니다. 소뇌 위 두뇌에 주걱을 넣고 다음 피질을 꺼내서 얼음처럼 차가운 GM 버퍼에 넣습니다. 균질화 단계로 바로 진행합니다. cortices 이것이 부정적인 SNS의 형성에 영향을 미칩니다 매우 오랫동안 얼음처럼 차가운 버퍼에 앉히지 마십시오.
3. homogenate 및 SNS 1-4 준비
- 얼음처럼 차가운 GM 버퍼에 cortices을 씻어 차가운 GM 버퍼의 5 ML을 포함하는 유리 다운스 호모 지 나이저 두 cortices을 전송하기만하면됩니다.
- 부드럽게 풀어 유봉의 50-10 스트로크와 cortices를 균질 (유봉 "A"), 꽉 유봉 (유봉 "B")의 50-10 스트로크로 따라갔다. 뇌졸중은 신속한하지만 기포를 발생하지 않는 정도로 천천히해야합니다. 균질 후 homogenate의 사진이 계획 1입니다. 뇌졸중의 수는 각 균 질기와 함께 pestles에 따라 달라질 수 있습니다. 언제 그라디언트가 뇌졸중의 번호를하지 않을 경우 강력한 SN 밴드를 제공한다 조정 완료.
- 펠렛 셀룰러 파편과 핵 4시 15 ML 원뿔 10 분 1000xg에서 원심 ° 스윙 버킷 로터에서 C (Allegra 6KR 원심 분리기)에 homogenate을 전송합니다. 스펀 homogenate의 사진이 계획 1입니다.
- 4 5 분 32,500 XG에서 Percoll - 자당 기울기, 캡 튜브, 그리고 원심 당 뜨는의 레이어 2 ML ㆍ 고정 앵글 로터에서 C (베크 만 J2 - 21 원심 분리기, JA - 17 로터 ()는 적절한 어댑터를 사용 ) 시약 및 장비 표를 참조하십시오.
- 오프 피펫과 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 SN 밴드 위의 솔루션을 폐기. 23분의 15 %의 인터페이스에서 SN 밴드에서 피펫, 얼음에 원뿔과 가게에 전송할 수 있습니다. 각각의 기울기 또는 한 피질 SN의 0.9-1.1 ML을 생산합니다.
- 12 NM의 최종 농도 1000x CaCl 2를 추가하고 특이 현상이 여기을 억제 1 μm의의 최종 농도 1 MM TTX 주식을 추가 10X 자극 버퍼의 10 분의 1 볼륨을 추가하여 SNS의 소금 농도를 조정합니다. (이것은 다운 스트림 SN 응용 프로그램에 영향을 줍니까 경우 CaCl 2의 추가는 선택 사항입니다.)
- 마이크로 BCA 단백질 분석 키트를 사용하여 SNS의 단백질 농도를 결정합니다. (브래드 포드 단백질 분석이 때문에 Percoll에서 추론을 권장하지 않습니다.)
- SNS는 단백질 transla 직접 신속하게 사용할 수 있습니다기 연구. 다른 응용 프로그램에 대한 SN lysate는 청소 또는 피어스 SDS - PAGE 샘플 준비 키트를 사용하여 집중 수 있습니다.
4. 대표 결과 :
마우스 대뇌 피질이 불연속 Percoll - 자당의 그라디언트 (제도 1), 6 밴드 또는 분수에 균질하고 분리되었을 때 (그림 1) 볼 수 있었다. 그것은 이전에 높은 분자량 밴드의 성분이 멤브레인 및 myelin 상처와 pelleted 자료 (표 1) mitochondria 또는 organelles 포함된 것을 대뇌 피질 3,5 쥐에 대한 표시되었다. 23 % / 15 % 인터페이스 (밴드 5) 농축 SNS가 포함되어 있습니다.
그대로 SNS를 포함 23 % / 15 % 인터페이스에서 밴드는 등 이전에 설명한 전자 현미경 (EM)에 의해 제거되고 검사되었습니다. 2,6 그들이 그대로 시냅스 vesicles의 존재와 presynaptic 및 postsynaptic 요소의 보전 (그림을 보여주 2). 사전 및 postsynaptic 구획의 분리는 신호와 두 구획에서 발생 단백질 합성을 조사하는 것이 중요합니다. 7-13 Percoll - 자당 기울기 우리가 SN 분율의 작은 세포, 핵 및 organelle 오염을 보았다 그래서 원유 정제하지만 전체 분리 좋았어요.
서양 얼룩 검사를하면, Percoll의 분수는 SN 밴드 (그림 3, 표 2)에서 시냅스 순도 증가 예상 단백질 마커가 포함되어 있습니다. 시냅스의 연결과 마커는 풍부한 SN 밴드 (밴드 5) 유지했지만 다른 마커의 풍부한이 크게 감소되었다. 구조와 시냅스 마커가 유지 또는 개선하는 동안 특히, GFAP, glial 원산지 astrocyte와 종양 세포에 대한 표지 및 Lamin - B1, 핵 마커의 존재는 무시할 수 있었다. 또한, 단백질 합성에 역할을 같은 mitochondria와 잠돌군 Zz 등 organelles,에 대한 마커의 유지가 발생했습니다.
BCA 단백질 분석에 의해 결정으로 SN 밴드에 대한 일반적인 수율은 μL 당 단백질의 250-500 NG했다. SNS가 50 μm의 glutamate/10 μm의 글리신과 자극을 때 SNS의 활동이 드 노보 단백질 합성의 양에 의해 결정되었다 [35S] - 메트로의 설립 (그림 4)에 의해 같은 모니터링을 제시 2. 자연적으로 흐르는 것과, 반사적으로 흐르는 translational 활동은 1.56 배 증가했다 (GLU) 또는 Pin1 억제제의 juglone와 활성화 배 5.12. Pin1 억제는 [35S] - 메트로의 설립에있는 증가 드 노보 단백질 합성에 의한되었는지 확인하려면 증가의 단백질 합성 2. 초래하는 것으로 알려져 있습니다, 우리는 40 μm의의 anisomycin, 단백질 합성 억제제를 추가하고, 정관에 표시된 감소를 봤어요 기초 수준에 비해 GLU의 존재와 부재 인치 또한, 2 %는 SNS의 무결성을 방해 트리톤 - X 100의 추가에 따라, 기초 번역 75 % 감소했다. 2 또한, 대부분의 시냅스 마커 농축을 보여주 밴드 (B4 - B6) 검사 때, SNS 또는 밴드 5 드 노보 단백질 합성 (그림 5)에 대한 가장 큰 활동을했다. 따라서 불연속 Percoll - 자당의 그라디언트 신속하게 단백질 번역을 공부하는 데 사용할 수있는 매우 적극적이고 풍부한 SN 밴드를 생산하고 있습니다.
기계적 손상이 엄격한 조건에 의해 발생되기 때문에 불연속 Percoll - 자당 기울기 절차는 다른 방법보다 더 유리합니다. 대뇌 피질의 homogenate를 통과하는 여과 방식에 비해 크기 감소가 3,14-15 Percoll 방법이 큰 활동을 더 SNS를 형성되는 일련의 필터를 통해 전달됩니다. 로 여과 방법으로 준비 SNS의 나누어지는이 23분의 15 %의 인터페이스에서 훨씬 적은 SNS와 깨진 세포막의 큰 금액이있다 Percoll - 자당 기울기를 통해 전달되었다 그림 6에서 볼. 드 노보 단백질 합성이 S35 - 충족의 설립을 통해 측정되었을 때, 여과 방법으로 준비 SNS (그림 7) 훨씬 덜 활성화되었다. translational 활동을 극대화하기 위해 우리는 나이가 P14와 P18 사이 마우스를 사용합니다. SN은 성인 마우스에서 준비하지만, 우리는 청소년 생쥐 (그림 8)에서 준비 SN와 함께 크게 증가 translational 활동을 볼 수 있습니다.
표 1. 균질 마우스 피질의 불연속 Percoll - 기울기 fractionations에서 밴드의 성분. 3,5
표 2. 불연속 Percoll - 자당 기울기 밴드 성분 서양 볼트 분석 요약. 밴드 분수의 각각에 대해 상대 단백질 농도는 불연속 Percol를 사용하여 격리나 - 자당 기울기는 서양 얼룩에 의해 결정됩니다. 없음 단백질 선물 (-), 0 ≥ 0.2 (+), 0.2 ≥ 0.8 (++), 또는> 0.8 (+++) 접어 N의 뜨는 (S, 피질 homogenate를 centrifuged) 대표의 단백질 선물보다 큰 = 3.
계획 1 : 불연속 Percoll - 자당 밀도 구배를 사용하여 SN 준비의 도식 마우스 뇌 cortices가, 해부 균질, 비 균질 조직, 세포 등 핵 및 세포막과 같은 전체 organelles를 제거하는 낮은 속도로 centrifuged했다.. 불연속 기울기 명확하게 레이어를 정의해야합니다. 삽입 그림은 레이어를 시각화하기 위해 설명을 목적으로 파란 염색되어있는 레이어의 예제를 보여줍니다. 뜨는은 불연속 Percoll - 자당 기울기 위에 계층과 중간 속도 centrifuged입니다. SN 대역은 다음 그라디언트에서 검색하고 사용할 준비가됩니다.
그림 1. 불연속 Percoll - 자당 기울기에 Homogenate 분별화. 마우스 대뇌 피질은 균질 6 밴드 또는 분수로 상승을주는 불연속 Percoll - 자당 기울기에서 분리되었다. 정화, 활성 SNS는 (*) 밴드 5 발견되었습니다.
그림 2. SN의 준비는 presynaptic 및 postsynaptic 요소를 유지 SNS의 이종 혼합주세요. C57BL / 6 마우스 (연령 P13로 P21)에서 준비 SN 준비의 전자 현미경을 보존 presynaptic과 postsynaptic 요소와 이전에 설명하고 보여주는 SNS로 수행되었다 2. 6 빨간색 화살표 지점 포스트 시냅스 밀도 수 있습니다. 스케일 바는 1 μm의 수 있습니다.
그림 3. SN의 준비 서양 얼룩 분석 시냅스와의 연결 마커가 정화 SNS 유지다고했다 (밴드 5) 그러나 다른 마커의 풍부한이 크게 감소했습니다. 뜨는의 Immunoblots (S, 대뇌 피질의 homogenate를 centrifuged)과 불연속의 밴드 1-6은 Percoll - 자당 기울기는 (postsynaptic 밀도 β - 굴지 (구조,로드 컨트롤), GFAP (astrocytic), GP73 (잠돌군 Zz), HSC70 (세포질과 핵), Lamin - B1 (핵), Prohibitin (mitochondrial) PSD95에 대한 읽혔어요 ), SNAP25 (시냅스), Synaptophysin (시냅스)와 β3 - Tubulin (신경 세포 특정). 밴드는 N = 3 대표, 폭풍 860 Phosphorimager를 사용하여 시각되었습니다.
그림 4. SNS가 활성화되고 [35S] - 메트로 정관을 통해 드 노보 단백질 합성을 나타냅니다. SNS는 ° C 10 분 37 미리 equilibrated되었습니다. 그렇다면 SNS 37 40 μm의의 anisomycin 또는 1 μm의의 juglone로 15 분에 대한 치료 또는 pretreated되었습니다 ° C 번 만났고, 20 μl 익스프레스 프로 라벨 플러스 또는 마이너스 GLU 37, S35 쉬운 태그 믹스 [35S]의 또한 다음 ° C 30 분. 샘플은, 피어스 SDS - PAGE 샘플 준비 키트를 사용하여 준비 15 % polyacrylamide 젤에서 실행, 건조 및 분자 역학 스톰 860 phosphorimager, N = 3 대표, ± SEM을 사용하여 quantitated되었습니다.
그림 5. 불연속 Percoll - 자당 기울기에서 밴드 5 드 노보 단백질 합성의 최고 수준이 포함되어 있습니다. 밴드 4, 5 및 6 뜨는 (S, 대뇌 피질의 homogenate를 centrifuged가) 37 미리 equilibrated되었습니다 ° C 10 분. 그런 다음, [35S] - 만났고, 익스프레스 프로 라벨 믹스 S35 쉬운 태그가 추가, 플러스, 마이너스 37 GLU ° C 30 분했습니다. 샘플은, 피어스 SDS - PAGE 샘플 준비 키트를 사용하여 준비 15 % polyacrylamide 젤에서 실행, 건조 및 분자 역학 스톰 860 phosphorimager, N = 3 대표, ± SEM을 사용하여 quantitated되었습니다.
그림 6. 여과 방법에서 준비 SNS는 불연속 Percoll - 자당 기울기 방법에서 준비 SNS 이상 깨진 세포막 이하 모든 SNS가 포함되어 있습니다. SNS는 이전에 설명한대로 기공 크기를 감소로 필터 일련의를 통해 균질 피질을 전달하여 준비되었습니다. 여과 방법으로 준비 SNS의 3,14-15 나누어지는가 불연속 Percoll - 자당 기울기를 통해 centrifuged과 이에 상응하는 금액에 비해되었습니다 불연속 Percoll - 자당 기울기 방법을 사용하여 소재.
그림 7. 여과 방법에서 준비 SNS는 SNS가 서있 준비 미만 드 노보 단백질 합성 활동을 포함m 불연속 Percoll - 자당 기울기 방법. SNS는 이전에 설명한대로 감소 기공 크기로 필터 3,14-15 일련의를 통해 균질 피질을 통과하여하고 불연속 Percoll - 자당 기울기 방법에 의해 준비되었다. 모두 준비에서 SNS 37 미리 equilibrated되었습니다 ° C 10 분. 그런 다음, [35S] - 만났고, 익스프레스 프로 라벨 믹스 S35 쉬운 태그가 추가, 플러스, 마이너스 37 GLU ° C 30 분했습니다. 샘플은, 피어스 SDS - PAGE 샘플 준비 키트를 사용하여 준비 15 % polyacrylamide 젤에서 실행, 건조 및 분자 역학 스톰 860 phosphorimager, N = 3 대표, ± SEM을 사용하여 quantitated되었습니다.
그림 8. 젊은 마우스 (P14)에서 SNS는 나이가 생쥐 (P85)보다 큰 translational 활동을했습니다. SNS가에 GLU와 함께 10 분 37 preequilibrated 불연속 Percoll - 자당 기울기 방법, ° C를 사용하여 서로 다른 세 생쥐의 준비를 취급 또는 치료했다 [35S]의 존재 - 메트로, 스냅 냉동, 30 분 (특급 프로 라벨 S35 쉬운 태그 믹스)와 나중에 피어스 SDS - PAGE 샘플 준비 키트와 청소. SNS는 다음 12% SDS - polyacrylamide 겔에서 실행 말린 N = 3, ± SEM의 분자 역학 스톰 860 phosphorimager, 대표에 몇 군데 있었다. P14 생쥐에서 SNS는 P85 생쥐보다 적어도 3 배 이상 활성화되었습니다.
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Discussion
여기에 설명된 불연속 Percoll - 자당 기울기 준비는 시냅스 전송 실험의 다양한 사용할 수 있습니다 적극적인 SNS를 분리하기 위해 빠르고 안정적인 방법입니다. Dunkley 외., 3,4가 개발한 방법을 기반으로 그라데이션이 방법은 서로 관련된 두 - 사전 및 postsynaptic 멤브레인 - 파생 vesicles를 분리 subcellular 두뇌 분획화 절차입니다. 더 정화 않고 이러한 SNS가 immunoprecipitation, 서부 blotting, 유동세포계측법 [35S]를 통해 - 메트로 정관, 전자 현미경, 그리고 효소 활동 assays 다양한 아이 소 머라 아제 포함하여 모니터링 드 노보 단백질 합성과를 포함한 분자 생물학 기법, 다양한와 호환됩니다 키나제 활동 assays.
불연속 Percoll - 자당 기울기 절차는 비교적 정직하고 있으나, 그것은 4 솔루션과 두뇌 자료를 유지하는 열쇠입니다 ° C 준비를 통해 미리 재미 그라디언트 수 있습니다. homogenate가 큰 활동으로 더 나은 수익률을 위해 그것은 cortices이 너무 오래 전에 균질화 GM 버퍼 얼음위에 앉아 있도록하지 않는 것이 좋습니다이며, proteolysis을 최소화하기 위해 항상 얼음처럼 차가운 보관지만. cortices는 씻어서하고 신속하게 균질 때 SNS의 형성이 가장 적합합니다. homogenate 그러나, 부정적인 영향을하지 않고 초기 원심 분리하기 전에 얼음을 보관하실 수 있습니다. cortices이 수확되고 나면 속도가 문제입니다, SNS의 분리가 가능 한한 빨리 완료해야한다. SNS 1-2 시간 동안 높은 활동을 유지할 수 있지만, 단계 사이의 시간 연장 기간은 감소 활동에 발생합니다. SN 준비에 사용되는 생쥐의 나이도 중요한 문제입니다. 그것은 설치류 동물의 시냅스 소성에서 연령 관련 거절합니다. 16-19 우리는 SNS에서 동일한 효과를 보았이있다는 것을 이전에 표시되었습니다. 이전 생쥐가 translationally 활성 SNS를 만들기 위해 사용될 수 있지만, 우리는 젊은 생쥐 (P14)는 다음 세 생쥐 (P85)를 큰 translational 활동 않은 것으로 나타났습니다.
SNS를 준비하는 데 사용하고 각 자체 장점과 단점을 가지고있다 몇 가지 조합과 조합 여과의 5,14-15,20-23 원심 분리, 24-27 및 그라데이션 방법 26-29이 있습니다. 여과 및 원심 분리 방법은 SNS에 기계적 손상을 일으킬 수 있습니다. 다양한 기공 크기의 필터를 이용하신 방법은 깨진 세포막의 큰 비율로 발생하고 훨씬 적은 SNS를 얻을 수 있습니다. 우리는 감소 기공 크기와 필터의 일련을 통해 homogenate를 통과 필터 방법 5,14-15을 시도하고 여과 방법으로 준비 SNS가 훨씬 적은 활성화는 사실을 발견했습니다. 원심 분리 방법도 resuspension를 필요로 튜브의 하단에있는 펠렛 또는 압축 SNS와 높은 속도로 연장 돌지에 의한 기계적 손상. Percoll 필터링이나 SNS를 부술하거나 lyse 수있는 SNS를 pelleting 방지 milder 조건을 고용합니다. Ficoll 28,30-32 또는 또한 자당 4,31 손상 이하의 적극적인 SNS의 결과 높은 molarities를 활용 SN 절차, 장애가 생물 학적 기능과 형태학의 변경. 31-32 Ficoll은 생리적 산도에서 원치 않는 세포 집합을 원인과 삼투 그라디언트를 제공 할 수 증가 농도와. isoosmotic 조건을 유지하려면 31-32, 그라디언트가 소금 그라디언트와 함께 보상해야합니다. 31 SNS는 자당의 높은 농도 (1.4-0.8 M) 작고 덜 적극적인 SNS의 결과와 준비 4.
불연속 Percoll - 자당 방법은 다른 medias 및 원심 분리 과정과 관련된 문제 중 많은 것들을 극복. 이 방법의 가장 큰 장점은 따라서 대안보다 밀도 구배 실험을 위해 더 적합하고, 낮은 점도, 낮은 osmolarity 및 세포와 그 성분을 향해 비교적없이 독성을 가지고 Percoll의 사용이다.뿐만 아니라 4,29, Percoll 수 osmolarity가 SN 무결성을 유지하는 데 필요한. 불연속 Percoll - 자당의 그라디언트를 사용하여 4 30-45 분 5 분에서 원심 분리 시간을 줄여, 따라서 활동에 제한 수명을 가진 SNS의 유용 수명을 연장 유지하는 자당과 준비 . 필터 SNS를 형성하기 위해 활용 방법에 비해 Percoll 그라디언트의 또 다른 이점은 SNS의 높은 수율 및 활동입니다. 우리는 Percoll - 자당 기울기를 통해 필터 방법으로 SNS을 조회. 우리는 간신히 뚜렷한 SN 밴드와 그라디언트에서 높은 분자량 깨진 세포막의 풍부한 발견했습니다. 또한, Percoll 방법으로 준비 SNS의 translational 활동 필터 방식보다 상당히 높은되었습니다. 그것은 SNS resultin를 필터링 및 pelleting 방지 milder 조건을 채용하기 때문에 전반적으로, Percoll 다른 방법 바람직합니다시냅스 활동의 더 나은 보존 및 소포 형성에 g. Dunkley, 외, 3,4를 통해 우리의 방법의 장점은 유리, 유리 다운스 호모 지 나이저가 postsynaptic 요소에 피해를 가장 postsynaptic 터미널 첨부 파일과 리드가 노출되는 것을 본대로 모터 구동 테플론, 유리 균질 화기에 반대 사용된 것입니다 미디어와 거의가 그대로 세포막으로 둘러싸인되고.
중요한 작품은 포스트 시냅스 밀도 11-13에서 단백질 합성에 초점을 갖고 있지만, 작은 작품은 presynaptic 구획의 단백질 합성을 연구하기 위해 수행되었습니다. 그러나, 단백질 합성의 presynaptic 터미널에서 발생하는 증거가있다. 7-10은 SNS의 전자 현미경, 사전 및 postsynaptic 첨부 파일에서 볼 수 있듯이 것은 그들 translational 활동의 미래 연구를위한 이상적인 시스템을 만들어 SN 준비에 존재 두 구획 인치
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 전자 현미경에 대한 위스콘신 매디슨 전자 현미경 시설의 대학에서 BK 8 월 감사드립니다. 이 작품은 NIH 보조금 R01 - DA026067 및 P30 - HD03352 (JSM)을 지원했다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Micro BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23235 | |
| CaCl2 | Fisher | C79-500 | |
| CO2 gas | Airgas (UW-MDS) | CD 50 | |
| EDTA | RPI | E57020 | |
| EtOH | Fisher | A407SK-4 | |
| HCl | Fisher | A142-212 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| KH2PO4 | Fisher | P285-500 | |
| PierceSDS-PAGE Sample Prep Kit | Pierce | 89888 | |
| NaCl | RPI | S23020 | |
| NaHCO3 | Fisher | BP328-500 | |
| Na2PHO4 | Fisher | S381-500 | |
| Sucrose | RPI | S24060 | |
| Tris Base | RPI | T60040 | |
| Tetrodotoxin | Sigma | T5651 | |
| Express Pro Label Mix S35 Easy Tag | Perkin Elmer | NEG772 | |
| Equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Dissection tools | |||
| Dounce homogenizer, 7 mL (comes with two glass pestles labled " A" and "B") | Wheaton | ||
| P1000 Gilson Pipetman | Gilson | F123602 | |
| Allegra 6KR Centrifuge | Beckman Coulter | 366830 | |
| GH 3.8 Rotor, Swinging bucket rotor | Beckman Coulter | 360581 | |
| Beckman J2-21 Centrifuge | Beckman | ||
| Beckman tubes with caps | Beckman | 355672 | |
| White walled adapters | Beckman | 342327 | |
| Blue walled adapters | Beckman | ||
| JA-17 Rotor, Fixed-angle rotor | Beckman | 369691 | |
Table of antibodies used for western blots: |
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| Name of Antibody | Company | Catalogue number | Host Species |
| β-Actin | Sigma | A5441 | mouse |
| GFAP | Santa Cruz | sc-65343 | mouse |
| GP73 | Santa Cruz | Sc-134509 | rabbit |
| HSC70 | Santa Cruz | sc-7298 | mouse |
| Laminβ | Santa Cruz | Sc-6261 | goat |
| Prohibitin | Santa Cruz | sc-28259 | rabbit |
| PSD95 | Millipore | MAB1596 | mouse |
| SNAP25 | AbCam | ab5666-100 | rabbit |
| Synaptophysin | Millipore | MAB368 | mouse |
| β-3-Tubulin | Santa Cruz | sc-80016 | mouse |
|
|||
References
- Westmark, C. J., Malter, J. S. FMRP mediates mGluR5-dependent translation of amyloid precursor protein. PLoS Biol. 5, e52-e52 (2007).
- Westmark, P. R., Westmark, C. J., Wang, S., Levenson, J., O'Riordan, K. J., Burger, C., Malter, J. S. Pin1 and PKMzeta sequentially control dendritic protein synthesis. Sci Signal. 3, ra18-ra18 (2010).
- Dunkley, P. R., Heath, J. W., Harrison, S. M., Jarvie, P. E., Glenfield, P. J., Rostas, J. A. A rapid Percoll gradient procedure for isolation of synaptosomes directly from an S1 fraction: Homogeneity and morphology of subcellular fractions. Brain Res. 441, 59-71 (1988).
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