Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

הכנת Synaptoneurosomes מ - עכבר Cortex באמצעות צבע רציפה Percoll-סוכרוז צפיפות

Published: September 17, 2011 doi: 10.3791/3196
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Waisman Center for Developmental Disabilities, University of Wisconsin, 2Department of Biochemistry, Waisman Center for Developmental Disabilities, University of Wisconsin

Summary

שיטה להכין פעיל translationally, synaptoneurosomes שלם (SNS) של קליפת המוח עכבר מתואר. השיטה משתמשת שיפוע רציפה Percoll-סוכרוז צפיפות המאפשרת הכנה מהירה של פעיל SNS.

Abstract

Synaptoneurosomes (SNS) מתקבלים לאחר homogenization ועל חלוקה של קליפת המוח העכבר. הם resealed שלפוחית ​​או מסופי מבודדים להתנתק מסופי האקסון כאשר רקמת קליפת המוח הוא הומוגני. SNS לשמור על המאפיינים טרום postsynaptic, מה שהופך אותם שימושיים בחקר בשידור סינפטי. הם שומרים על מנגנון מולקולרי המשמש איתות עצבי ומסוגלים ספיגת, אחסון, שחרור של נוירוטרנסמיטורים.

ההפקה והבידוד של פעיל SNS יכול להיות בעייתי כמו שימוש במדיות Ficoll, אשר ניתן ציטוטוקסיות ודורשים צנטריפוגה המורחבת עקב צפיפות גבוהה, סינון ושיטות צנטריפוגה, אשר עלולה לגרום פעילות נמוכה עקב נזק מכני של SNS. עם זאת, השימוש Percoll-סוכרוז הדרגתיים רציפה צפיפות לבודד SNS מספק שיטה מהירה כדי לייצר תשואות טובות של SNS פעיל translationally. השיטה Percoll-סוכרוז שיפוע הוא מהיר ועדין כפי שהיא מעסיקה התנאים איזוטוני, יש ספינים צנטריפוגה פחות קצר נמנע צעדים צנטריפוגה כי גלולה SNS ולגרום נזק מכני.

Protocol

1. ההכנות 1-4

  1. הכן 500 מ"ל חיץ של שיפוע בינוני (GM) על ידי ערבוב 50 מ"ל של slurry M 2.5 סוכרוז, 2.5 מ"ל של 1M טריס-HCl, pH7.5 המניות, 0.1 מ"ל של 0.5 מ 'EDTA, pH 8.0 מניות עם מילי ש מים בנפח. סנן לעקר את הפתרון, aliquot ולאחסן קפוא.
  2. הכינו מלאי של tetrodotoxin 1000x (TTX) על ידי ביצוע פתרון 1 מ"מ מילי Q-H 2 O. Aliquots של TTX ניתן לאחסן ב -20 ° C.
  3. הכנת מאגר גירוי 10x ידי ביצוע פתרון של 100 מ"מ טריס (pH 7.5), 5 mM Na 2 HPO 4, 4 מ"מ KH 2 PO 4, 40 mM NaHCO 3, 800 mM NaCl במים אלפית-Q. במלאי ניתן לאחסן 4 ° C.
  4. טרום מגניב צנטריפוגות עד 4 ° C.
  5. הכן פתרון המניות של Percoll Isosmotic (SIP) על ידי הוספת 9 כרכים של Percoll (18 מ"ל) עד ​​נפח של 1 סוכרוז 2.5 M (2 מ"ל) מים אלפית-Q ומערבבים היטב.
  6. הכן את 3, 10, 15, שכבות צבע 23% על ידי הוספת כמויות בהתאמה של SIP ל GM חיץ ערבוב כל:

טבלה 0

  1. יוצקים שכבות צבע על ידי pipetting 2 מ"ל כל אחד 23, 15, 10, ו -3% פתרונות Percoll isosmotic לתוך צינורות צנטריפוגה Beckman עם כמוסות באמצעות P1000 Gilson Pipetman. ממשק בין השכבות יש להבחין בבירור ללא ערבוב של שכבות. חנות הדרגתיים על 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות לפחות לפני השימוש. מילויים ניתן לאחסן עד 24 שעות למרות השימוש באותו היום מומלץ. [אנשי המעבדה מנוסים יכולים להתאמן הדרגתיים הכנת ידי הוספת צבע כחול הפתרונות isomotic Percoll להדמיה של ממשקים השכבה.]

2. עכבר לנתיחה 1

  1. ודא שכל בעלי העכבר המתת חסד נהלים מבוצעות בהתאם להנחיות NIH ואוניברסיטת. להרדים גורים (גיל P13 ל p21) בחנק פחמן דו חמצני או בשיטה אושרה בפרוטוקול של בעלי חיים.
  2. הצמד את העכבר ללוח לנתיחה ולרסס את החלק האחורי של הצוואר והראש עם אתנול. בעזרת מספריים חדות לחתוך חוט השדרה בבסיס הגולגולת, להסיר את העור מהחלק העליון של הגולגולת, לחתוך את הגולגולת רוחבית בין העצם הקודקודית ואת עצם interparietal או בין המוח לבין אזורים בקליפת המוח. ואז לחתוך את הגולגולת מהבסיס אל האף (יחד תפר sagital), להסיר בזהירות את העצם הקודקודית רכים על ידי משיכת כל חצי הכדור בצד ולהסיר את הקליפה עם מרית. הכנס את מרית לתוך המוח מעל במוח הקטן ואז לגרוף את קליפת ולמקם אותו חיץ GM קר כקרח. המשך מיד לשלב homogenization. אל תתנו הקורטקס יושבים חיץ קר כקרח לאורך זמן כמו זה ישפיע לרעה על היווצרות של SNS.

3. הכנת homogenate ו SNS 1-4

  1. יש לשטוף את קליפת המוח ב קר כקרח חיץ GM ולהעביר two הקורטקס ל Dounce זכוכית homogenizer המכיל 5 מ"ל של חיץ GM קר.
  2. הומוגני בעדינות הקורטקס במשיכות 5-10 של העלי רופף (העלי "A"), ואחריו שבץ 5-10 של העלי צמודים (העלי "B"). הסטרוקס צריך להיות מהיר, אבל איטי מספיק כדי לא לגרום בועות אוויר. תמונה של homogenate לאחר homogenization הוא Scheme 1. מספר משיכות ישתנו תלוי homogenizer הפרט pestles הנלווים. בסיום הדרגתיים צריך לתת להקה חזקה SN, אם לא, להתאים את מספר משיכות.
  3. מעבירים את homogenate ל 15 מ"ל חרוטי ו צנטריפוגות ב 1000xg במשך 10 דקות על 4 מעלות צלזיוס הרוטור דלי מתנדנד (אלגרה 6KR צנטריפוגות) כדי פסולת הסלולר גלולה גרעינים. תמונה של homogenate סובב הוא Scheme 1.
  4. שכבה 2 מ"ל של supernatant לכל כובע Percoll-סוכרוז שיפוע, צינורות, ו צנטריפוגות ב XG 32,500 עבור 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס הרוטור קבוע זווית (Beckman J2-21 צנטריפוגות, JA-17 הרוטור) באמצעות מתאמים המתאים ( ראה ריאגנטים ולוח ציוד).
  5. פיפטה וישאירו את הפתרון הנ"ל הלהקה SN בעזרת פיפטה פסטר זכוכית. פיפטה את הלהקה SN בממשק% 15/23, להעביר ולאחסן חרוט על הקרח. כל צבע או קליפת תייצר 0.9-1.1 מ"ל של SN.
  6. התאם את ריכוז מלח של SNS ידי הוספת עשירית נפח המאגר גירוי 10x, להוסיף CaCl 2 1000x לריכוז סופי של 12 ננומטר, ולהוסיף 1 מניות TTX מ"מ עד ריכוז סופי של 1 מיקרומטר לדכא עירור ספציפי. (תוספת של CaCl 2 הוא אופציונלי אם זה יפריע יישומים במורד SN).
  7. קביעת ריכוז חלבון של SNS באמצעות BCA Assay מיקרו ערכת חלבון. (Assay חלבון ברדפורד אינה מומלצת בגלל היקש מן Percoll).
  8. SNS ניתן להשתמש ישירות ובמהירות לחלבון translaמחקרים tion. עבור יישומים אחרים SN lysate ניתן לנקות או מרוכז באמצעות SDS-PAGE פירס ערכת הכנה המדגם.

4. נציג התוצאות:

כאשר סמן העכבר קליפת היה הומוגני ומופרד על Percoll-סוכרוז הדרגתיים רציפה (תוכנית 1), 6 להקות או שברים נראו (איור 1). היא הוצגה בעבר עבור עכברוש בקליפת המוח 3,5 כי המרכיבים של להקות משקל מולקולרי גבוה נשברו הממברנה המיאלין, וכי החומר הכלול pelleted המיטוכונדריה או אברונים (טבלה 1). 23% / 15% ממשק (Band 5) הכילו את SNS מועשר.

הלהקה על ממשק / 23% 15%, המכיל SNS שלם, הוסר נבדק על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים (EM) כפי שתואר קודם לכן. EM 2,6 הראו נוכחות של שלפוחית ​​סינפטית שלם שימור אלמנטים presynaptic ו postsynaptic (איור 2). בידוד של תאים טרום postsynaptic חשוב לבחינת איתות סינתזת החלבון, אשר מתרחשת בתאים שניהם. 7-13 שיפוע Percoll-סוכרוז הוא טיהור גולמי כך ראינו קטין זיהום הסלולר, גרעיני אברון בשבריר SN אבל ההפרדה הכללית היתה טובה.

כאשר נבדק על ידי כתם המערבי, שברים Percoll הכיל את סמנים חלבון צפוי עם עלייה טוהר הסינפטי בלהקה SN (איור 3, לוח 2). סמנים Synaptic ואת עצבי נשמרו בלהקה מועשר SN (Band 5), אך שפע של סמנים אחרים צומצם משמעותית. בפרט, את נוכחותו של GFAP, סמן תאים astrocyte ו neoplastic ממוצא גליה, lamin ו-B1, סמן גרעיני, היו זניחות, תוך סמנים מבניים הסינפטי נשמרו או משופרת. בנוסף, היתה השמירה של סמנים עבור האברונים, כדוגמת מיטוכונדריה Golgi, אשר ממלאים תפקיד סינתזת החלבון.

התשואות אופיינית ללהקה SN היו 250-500 ננוגרם חלבון לכל μL, כפי שנקבע על ידי assay חלבון BCA. הפעילות של SNS נקבע על ידי כמות חלבון סינתזה דה נובו הנוכחי בפיקוח על ידי [35S]-Met ההתאגדות (איור 4). 2 פעילות בסל translational היה גדל פי 1.56, כאשר SNS היו מגורה עם מיקרומטר 50 מיקרומטר glutamate/10 גליצין (Glu) או 5.12 להתקפל כאשר מופעלים עם juglone מעכבי Pin1. עיכוב Pin1 ידוע לגרום סינתזת חלבון מוגברת. 2 כדי לאשר את הגידול [35S]-Met ההתאגדות נבע סינתזת חלבון דה נובו, הוספנו 40 anisomycin מיקרומטר, מעכב את סינתזת החלבון, וראיתי ירידה ניכרת ההתאגדות בנוכחות והיעדר Glu לעומת רמות הבסיס. על כן, עם תוספת של 2% טריטון X-100, אשר משבש את היושרה של SNS, התרגום היה הבסיס ירדו ב 75%. 2 כמו כן, כאשר בוחנים את הלהקות (B4-B6) שהראו את ההעשרה סמן הסינפטי ביותר, SNS או Band 5 היתה הפעילות הגדולה ביותר עבור סינתזה דה נובו חלבון (איור 5). לפיכך, רציפה Percoll-סוכרוז הדרגתיים לייצר במהירות פעיל מאוד מועשר הלהקה SN כי ניתן להשתמש כדי ללמוד תרגום חלבון.

ההליך רציפה Percoll-סוכרוז שיפוע יתרון יותר מאשר שיטות אחרות בגלל נזק מכני נגרמת על ידי תנאים קשים. כאשר לעומת שיטת סינון, שבו פינו homogenate קליפת המוח עובר דרך סדרה של מסננים ירידה בגודל, 3,14-15 השיטה Percoll צורות SNS יותר עם ​​פעילות גדולה יותר. כפי שניתן לראות באיור 6, כאשר aliquot של SNS שהוכן על ידי שיטת סינון עברה מעל שיפוע Percoll-סוכרוז יש SNS הרבה פחות על הממשק% 15/23 ו - כמות גדולה יותר של הקרומים שבור. כאשר דה נובו סינתזת החלבון נמדדה באמצעות שילוב-S35 נפגשו, SNS שהכין בשיטת הסינון היו הרבה פחות פעילים (איור 7). כדי למקסם את פעילות translational אנו משתמשים בעכברים, כי הם בין גיל P14 ו - p18. SN ניתן להכין מעכברים מבוגר, אבל צפינו בפעילות translational גדל באופן משמעותי עם SN מוכן מעכברים נעורים (איור 8).

טבלה 1
טבלה 1. המרכיבים של להקות מן Percoll-שיפוע fractionations רציפה של קליפת עכבר הומוגני. 3,5

טבלה 2
טבלה 2. סיכום של ניתוח הבריח המערבי רציפה Percoll-סוכרוז המרכיבים להקה הדרגתי. ריכוזי חלבון יחסית עבור כל אחד שברים הלהקה מבודדים באמצעות Percol רציפהl-סוכרוז שיפוע נקבעו על ידי כתם המערבי. אין להציג חלבון (-), 0 ≥ 0.2 (+), 0.2 ≥ 0.8 (++), או> 0.8 (+++) לקפל יותר מאשר בהווה חלבון נציג supernatant (S, centrifuged קליפת homogenate) של n = 3.

תוכנית 1
תוכנית 1: סכמטי של הכנה SN באמצעות שיפוע רציפה Percoll-סוכרוז צפיפות בקורטקס המוח עכבר נותחו, הומוגני, ו centrifuged במהירות נמוכה כדי להסיר אי - הומוגני רקמות, תאים, אברונים שלמים כגון גרעינים וממברנות.. שיפוע רציפה צריך מוגדרים בבירור שכבות. התמונה הבלעה מציג דוגמה של שכבות, אשר היה צבוע כחול לצורכי המחשה בלבד כדי להמחיש את השכבות. Supernatant היא על גבי שכבות של צבע Percoll-סוכרוז רציפה ו centrifuged במהירות בינונית. הלהקה SN מאוחזר אז מן השיפוע והוא מוכן לשימוש.

איור 1
באיור 1. חלוקה Homogenate על שיפוע Percoll-סוכרוז רציפה. עכבר קליפת היה הומוגני ומופרד על שיפוע Percoll-סוכרוז רציפה והוליד 6 להקות או שברים. , מטוהרים פעיל SNS (*) נמצאו בנד 5.

איור 2
איור 2. ההכנות SN לתת תערובת הטרוגנית של SNS כי לשמר אלמנטים presynaptic ו postsynaptic. מיקרוסקופ אלקטרונים של הכנה SN שהוכן C57BL / 6 עכברים (גיל P13 ל p21) בוצעה SNS כפי שתואר לעיל מראה עם אלמנטים presynaptic ו postsynaptic נשמר 2. , 6 נקודת חצים אדומים להודעה הסינפטי צפיפויות. בר סולם הוא 1 מיקרומטר.

איור 3
איור 3. מנתח כתם המערבי של ההכנות SN הראו כי סמנים הסינפטי ו העצבית נשמרו ב SNS מטוהרים (Band 5), אך שפע של סמנים אחרים צומצם משמעותית. Immunoblots של supernatant (S, centrifuged homogenate קליפת המוח) ו 1-6 להקות של רציפה Percoll-סוכרוז שיפוע נבדקו עבור β-אקטין (שליטה מבניים, העמסה), GFAP (astrocytic), GP73 (Golgi), HSC70 (cytoplasmic גרעינית), lamin-B1 (גרעינית), Prohibitin (המיטוכונדריה), PSD95 (צפיפות postsynaptic ), SNAP25 (הסינפטי), Synaptophysin (הסינפטי) ו-β3 טובולין (נוירון ספציפי). הלהקות היו דמיינו באמצעות Phosphorimager 860 סטורם, נציג של n = 3.

איור 4
איור 4. SNS פעילים ולהציג דה נובו סינתזת החלבון באמצעות [35S]-Met ההתאגדות. SNS היו מראש equilibrated על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. ואז SNS היו מטופלים או pretreated במשך 15 דקות עם anisomycin 40 מיקרומטר או 1 מיקרומטר juglone ב 37 ° C ואחריו תוספת של [35S]-Met, 20 μl לייבל Pro Express Mix S35 תג קל, פלוס מינוס Glu ב 37 ° C למשך 30 דקות. הדגימות נערכו באמצעות SDS-PAGE פירס ערכת הכנה המדגם, לרוץ על ג'ל polyacrylamide 15%, מיובשים ונרשמת באמצעות דינמיקה מולקולרית 860 סטורם phosphorimager, נציג של n = 3, ± SEM.

איור 5
איור 5. Band 5 מתוך השיפוע Percoll-סוכרוז רציפה הכיל את הרמות הגבוהות ביותר של סינתזת חלבון דה נובו. להקות 4, 5 ו 6 ואת supernatant (S, centrifuged homogenate קליפת המוח) היו מראש equilibrated על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. אז, [35S]-Met, Express Mix Pro לייבל S35 תג קל, נוספה, פלוס מינוס Glu ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. הדגימות נערכו באמצעות SDS-PAGE פירס ערכת הכנה המדגם, לרוץ על ג'ל polyacrylamide 15%, מיובשים ונרשמת באמצעות דינמיקה מולקולרית 860 סטורם phosphorimager, נציג של n = 3, ± SEM.

איור 6
איור 6. SNS שהוכן שיטת סינון מכילים ממברנות נשבר יותר SNS שלם פחות SNS שהוכן בשיטת Percoll-סוכרוז רציפה הדרגתי. SNS הוכנו על ידי העברת קליפת הומוגני דרך סדרה של מסננים עם הפחתת גודל הנקבוביות כפי שתואר לעיל. 3,14-15 aliquot של SNS שהוכן על ידי שיטת הסינון היתה centrifuged מעל מפל Percoll-סוכרוז רציפה ולעומת בסכום שווה ערך החומר בשיטה רציפה Percoll-סוכרוז הדרגתי.

איור 7
איור 7. SNS שהוכן שיטת סינון מכילים פחות דה נובו סינתזת חלבון פעילות מאשר SNS מוכן הלוך ושובמ 'שיטת רציפה Percoll-סוכרוז הדרגתי. SNS הוכנו על ידי העברת קליפת הומוגני דרך סדרה של מסננים עם הפחתת גודל הנקבוביות כפי שתואר לעיל, 3,14-15 ועל ידי Percoll-סוכרוז שיטות רציפה הדרגתי. SNS מן ההכנות הן היו מראש equilibrated על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. אז, [35S]-Met, Express Mix Pro לייבל S35 תג קל, נוספה, פלוס מינוס Glu ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. הדגימות נערכו באמצעות SDS-PAGE פירס ערכת הכנה המדגם, לרוץ על ג'ל polyacrylamide 15%, מיובשים ונרשמת באמצעות דינמיקה מולקולרית 860 סטורם phosphorimager, נציג של n = 3, ± SEM.

איור 8
איור 8. SNS מעכברים צעירים יותר (P14) יש פעילות translational יותר מאשר עכברים מבוגרים (P85). SNS הוכנו מעכברים בגילאים שונים בשיטת רציפה Percoll-סוכרוז שיפוע, preequilibrated על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, טיפול או מטופל עם Glu ב נוכחות [35S]-Met (לייבל Pro Express Mix S35 תג קל) למשך 30 דקות, הצמד קפוא, וניקה מאוחר יותר את ערכת SDS-PAGE הכנה פירס לדוגמה. SNS נוהלו אז על ג'ל SDS-polyacrylamide 12%, מיובשים הדמיה על דינמיקה מולקולרית 860 נציג סטורם, phosphorimager של n = 3, ± SEM. SNS מ P14 העכברים היו לפחות פי 3 יותר פעיל P85 עכברים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הכנה רציפה Percoll-סוכרוז שיפוע המתוארים כאן היא שיטה מהירה, אמינה לבודד SNS פעיל, אשר ניתן להשתמש במגוון של ניסויים בשידור סינפטי. שיטה זו שיפוע, אשר מבוססת על שיטה שפותחה על ידי Dunkley et al. 3,4 הוא המוח subcellular חלוקה הליך המבודדת הן טרום postsynaptic קרום הנגזרות שלפוחית ​​הקשורים זה לזה. ללא טיהור נוסף SNS אלה עולים בקנה אחד עם מגוון רחב של טכניקות הביולוגיה המולקולרית, כולל immunoprecipitation, המערבי סופג, cytometry זרימה, ניטור דה נובו סינתזת החלבון באמצעות [35S]-Met ההתאגדות, מיקרוסקופיה אלקטרונית, וכן מגוון של מבחני פעילות האנזים כולל isomerase ו פעילות קינאז מבחני.

ההליך רציפה Percoll-סוכרוז שיפוע יחסית ישר קדימה, אולם היא המפתח כדי לשמור על פתרונות חומר המוח על 4 מעלות צלזיוס במשך הכנה מראש הקור הדרגתיים. למרות homogenate נשמר קר כקרח בכל עת כדי למזער proteolysis, עבור התשואות טוב יותר עם פעילות גדולה יותר עדיף לא לתת הקורטקס יושבים על קרח חיץ GM זמן רב מדי לפני homogenization. היווצרות SNS היא הטובה ביותר כאשר קליפת המוח הם שטופים ואז הומוגני ובמהירות. Homogenate, לעומת זאת, יכולים להישמר על הקרח לפני צנטריפוגה הראשוני ללא תופעות לוואי משפיע. מהירות היא סוגיה אחת הקורטקס כבר נקצרו, כך הבידוד של SNS יש להשלים במהירות האפשרית. למרות SNS יכול לשמור על פעילות גבוהה של 1-2 שעות, תקופות ממושכות של זמן בין הצעדים יביא לירידה בפעילות. הגיל של עכברים המשמשים להכנת SN גם סוגיית מפתח. הוכח בעבר כי קיימת ירידה בגיל הקשורים הפלסטיות הסינפטית במכרסמים. 16-19 ראינו את אותו אפקט ב SNS. למרות עכברים מבוגרים יכולים לשמש להכנת SNS פעיל translationally, מצאנו כי עכברים צעירים (P14) יש פעילות גדולה יותר אז translational עכברים מבוגרים (P85).

יש כמה וריאציות ושילובים של סינון, צנטריפוגה 5,14-15,20-23, 24-27 ושיטות שיפוע 26-29 שנוצלו להכין SNS וכל אחד יש יתרונות וחסרונות משלה. שיטות סינון צנטריפוגה יכול לגרום נזק מכני SNS. השיטות אשר מנוצל מסננים שונים בגודל הנקבוביות הביא אחוז גדול יותר של הקרומים שבור תשואה SNS באופן משמעותי פחות. ניסינו את שיטת הסינון, 5,14-15 אשר מעביר את homogenate דרך סדרה של מסננים עם הפחתת גודל הנקבוביות ומצא כי SNS שהכין בשיטת הסינון היו משמעותית פחות פעילים. שיטות צנטריפוגה גם לגרום נזק מכני עקב הספינים ממושכת במהירויות גבוהות אשר גלולה או לדחוס את SNS בתחתית צינורות דורשים resuspension. Percoll מעסיקה תנאים קלים כי למנוע סינון או pelleting SNS, שיכול למחוץ או lyse SNS. נהלים SN לנצל Ficoll 28,30-32 או molarities גבוהה של סוכרוז 4,31 גם לגרום SNS פגום או פעיל פחות, הפונקציה הביולוגית לקויי שינויים מורפולוגיים. Ficoll 31-32 יכולים לגרום להצטברות תאים לא רצויים ב-pH הפיזיולוגי ונותן הדרגתיים אוסמוטי עם ריכוזים גוברת. 31-32 כדי לשמור על תנאים isoosmotic, מילויים צריכים יפוצו על שיפוע עם מלח. SNS 31 מוכן עם ריכוז גבוה של סוכרוז (1.4-0.8 מ ') לגרום SNS קטנים פחות פעילים. 4

השיטה רציפה Percoll-סוכרוז מתגבר רבים של בעיות מעורב עם במדיות אחרות ונהלים צנטריפוגה. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא השימוש Percoll, בעלת צמיגות נמוכה, osmolarity נמוכה יחסית לא רעילות כלפי תאים בוחריהם, ובכך מתאים יותר שיפוע ניסויים צפיפות מאשר חלופות. 4,29 בנוסף, ניתן Percoll להיות מוכנים עם סוכרוז לשמור osmolarity הדרוש כדי לשמור על שלמות SN. 4 שימוש רציפה Percoll-סוכרוז הדרגתיים מפחיתה את הזמן צנטריפוגה מ 30-45 דקות עד 5 דקות, ובכך מאריך את תוחלת החיים השימושיים של SNS, אשר יש אורך חיים מוגבל לפעילות . יתרון נוסף של הדרגתיים Percoll היא תשואה גבוהה יותר ואת הפעילות של SNS בהשוואה לשיטות לנצל את המסננים כדי ליצור SNS. רצנו SNS מן השיטה לסנן על שיפוע Percoll-סוכרוז. מצאנו להקה להבחין בקושי SN ושפע של ממברנות משקל מולקולרי גבוה שבור על השיפוע. כמו כן, פעילות translational של SNS שהוכן על ידי שיטת Percoll היה גבוה באופן משמעותי מאשר בשיטת הסינון. בסך הכל, Percoll עדיפה על שיטות אחרות משום שהיא מעסיקה תנאים קלים יותר, כי להימנע סינון pelleting resultin SNSg בשייר יותר של הפעילות הסינפטית היווצרות שלפוחית ​​טוב יותר. היתרון של השיטה שלנו על Dunkley, et al, 3,4 היא זכוכית, זכוכית Dounce homogenizer היה בשימוש במסמך להבדיל את המנוע מונע טפלון, זכוכית homogenizer כי הנזקים קצותיהן postsynaptic ביותר ומובילה את האלמנטים postsynaptic נחשפים התקשורת מעט מאוד להיות מוקפים קרומים שלמים.

עבודה משמעותית התמקדה סינתזת החלבון בצפיפות הפוסט סינפטי 11-13, אבל לעבוד קצת נעשה ללמוד סינתזת החלבון בתאי presynaptic. עם זאת, אין ראיות לכך סינתזת החלבון מתרחשת מסופי presynaptic. 7-10 כפי שניתן לראות ב מיקרוסקופ אלקטרונים של SNS, קבצים מצורפים טרום postsynaptic קיימת בהכנת SN שהופך אותם מערכת אידיאלית למחקר עתידי של פעילות translational בתאים שניהם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Acknowledgments

ברצוננו להודות BK אוגוסט מאוניברסיטת מתקן אלקטרונים וויסקונסין מיקרוסקופ עבור במיקרוסקופ אלקטרונים. עבודה זו נתמכה על ידי NIH מענקים R01-DA026067 ו-P30 HD03352 (עד JSM).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
Micro BCA Protein Assay Kit Pierce 23235  
CaCl2 Fisher C79-500  
CO2 gas Airgas (UW-MDS) CD 50  
EDTA RPI E57020  
EtOH Fisher A407SK-4  
HCl Fisher A142-212  
Percoll GE Healthcare 17-0891-01  
KH2PO4 Fisher P285-500  
PierceSDS-PAGE Sample Prep Kit Pierce 89888  
NaCl RPI S23020  
NaHCO3 Fisher BP328-500  
Na2PHO4 Fisher S381-500  
Sucrose RPI S24060  
Tris Base RPI T60040  
Tetrodotoxin Sigma T5651  
Express Pro Label Mix S35 Easy Tag Perkin Elmer NEG772  
       
Equipment Company Catalogue number Comments (optional)
Dissection tools      
Dounce homogenizer, 7 mL (comes with two glass pestles labled " A" and "B") Wheaton    
P1000 Gilson Pipetman Gilson F123602  
Allegra 6KR Centrifuge Beckman Coulter 366830  
GH 3.8 Rotor, Swinging bucket rotor Beckman Coulter 360581  
Beckman J2-21 Centrifuge Beckman    
Beckman tubes with caps Beckman 355672  
White walled adapters Beckman 342327  
Blue walled adapters Beckman    
JA-17 Rotor, Fixed-angle rotor Beckman 369691  

Table of antibodies used for western blots:
Name of Antibody Company Catalogue number Host Species
β-Actin Sigma A5441 mouse
GFAP Santa Cruz sc-65343 mouse
GP73 Santa Cruz Sc-134509 rabbit
HSC70 Santa Cruz sc-7298 mouse
Laminβ Santa Cruz Sc-6261 goat
Prohibitin Santa Cruz sc-28259 rabbit
PSD95 Millipore MAB1596 mouse
SNAP25 AbCam ab5666-100 rabbit
Synaptophysin Millipore MAB368 mouse
β-3-Tubulin Santa Cruz sc-80016 mouse

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Westmark, C. J., Malter, J. S. FMRP mediates mGluR5-dependent translation of amyloid precursor protein. PLoS Biol. 5, e52-e52 (2007).
  2. Westmark, P. R., Westmark, C. J., Wang, S., Levenson, J., O'Riordan, K. J., Burger, C., Malter, J. S. Pin1 and PKMzeta sequentially control dendritic protein synthesis. Sci Signal. 3, ra18-ra18 (2010).
  3. Dunkley, P. R., Heath, J. W., Harrison, S. M., Jarvie, P. E., Glenfield, P. J., Rostas, J. A. A rapid Percoll gradient procedure for isolation of synaptosomes directly from an S1 fraction: Homogeneity and morphology of subcellular fractions. Brain Res. 441, 59-71 (1988).
  4. Dunkley, P. R., Jarvie, P. E., Robinson, P. J. A rapid Percoll gradient procedure for preparation of synaptosomes. Nat. Protoc. 3, 1718-1728 (2008).
  5. Hollingsworth, E. B., McNeal, E. T., Burton, J. L., Williams, R. J., Daly, J. W., Creveling, C. R. Biochemical characterization of a filtered synaptoneurosome preparation from guinea pig cerebral cortex: cyclic adenosine 3':5'-monophosphate-generating systems, receptors, and enzymes. J. Neurosci. 5, 2240-2253 (1985).
  6. Yi, H., Leunissen, J., Shi, G., Gutekunst, C., Hersch, S. A novel procedure for pre-embedding double immunogold-silver labeling at the ultrastructural level. J. Histochem. Cytochem. 49, 279-284 (2001).
  7. Akins, M. R., Berk-Rauch, H. E., Fallon, J. R. Presynaptic translation: stepping out of the postsynaptic shadow. Front. Neural Circuits. 3, (2009).
  8. Jin, I., Kandel, E. R., Hawkins, R. D. Whereas short-term facilitation is presynaptic, intermediate-term facilitation involves both presynaptic and postsynaptic protein kinases and protein synthesis. Learn. Mem. 18, 96-102 (2011).
  9. Lyles, V., Zhao, Y., Martin, K. C. Synapse formation and mRNA localization in cultured Aplysia neurons. Neuron. 49, 349-356 (2006).
  10. Wagatsuma, A., Azami, S., Sakura, M., Hatakeyama, D., Aonuma, H., Ito, E. De Novo synthesis of CREB in a presynaptic neuron is required for synaptic enhancement involved in memory consolidation. J. Neurosci. Res. 84, 954-9560 (2006).
  11. Sutton, M. A., Schuman, E. M. Local translational control in dendrites and its role in long-term synaptic plasticity. J. Neurobiol. 64, 116-131 (2005).
  12. Li, K. -W., Hornshaw, M. P., Van der Schors, R. C., Watson, R., Tate, S., Casetta, B., Jimenez, C. R. Proteomics analysis of rat brain postsynaptic density: implications of the diverse protein functional groups for the integration of synaptic physiology. J. Biol. Chem. 279, 987-1002 (2004).
  13. Peng, J., Kim, M. J., Cheng, D., Duong, D. M., Gygi, S. P., Sheng, M. Semi-quantitative proteomic analysis of rat forebrain postsynaptic density fractions by mass spectrometry. J. Biol. Chem. 279, 21003-21011 (2004).
  14. Kim, S. H., Fraser, P. E., Westaway, D., St. George-Hyslop, P. H. Group II metabotropic glutamate receptor stimulation triggers production and release of Alzheimer's amyloid β42 from isolated intact nerve terminals. J. Neurosci. 30, 3870-3875 (2010).
  15. Weiler, I. J., Greenough, W. T. Potassium ion stimulation triggers protein translation in synaptoneurosomal poiyribosomes. Mol. Cell. Neurosci. 2, 305-314 (1993).
  16. Billard, J. M. Ageing, hippocampal synaptic activity and magnesium. Magnes Res. 19, 199-215 (2006).
  17. Murphy, G. G., Fedorov, N. B., Giese, K. P., Ohno, M., Friedman, E., Chen, R., Silva, A. J. Increased neuronal excitability, synaptic plasticity, and learning in aged Kvbeta1.1 knockout mice. Curr. Biol. 14, 1907-1915 (2004).
  18. Norris, C. M., Halpain, S., Foster, T. C. Reversal of Age-Related Alterations in Synaptic Plasticity by Blockade of L-Type Ca21 Channels. J. Neurosci. 18, 3171-3179 (1998).
  19. Sallert, M., Malkki, H., Segersträlea, M., Tairaa, T., Lauri, S. E. Effects of the kainate receptor agonist ATPA on glutamatergic synaptic transmission and plasticity during early postnatal development. Neuropharm. 52, 1354-1365 (2007).
  20. Quinlan, E. M., Philpot, B. D., Huganir, R. L., Bear, M. F. Rapid, experience-dependent expression of synaptic NMDA receptors in visual cortex in vivo. Nat. Neurosci. 2, 357-35 (1999).
  21. Scheetz, A. J., Nairn, A. C., Constantine-Patton, M. NMDA receptor-mediated control of proteins synthesis at developing synapses. Nat. Neurosci. 3, 211-216 (2000).
  22. Villasana, L. E., Klann, E., Tejada-Simon, M. V. Rapid isolation of synaptoneurosomes and postsynaptic densities from adult mouse hippocampus. J. Neurosci. Methods. 158, 30-36 (2006).
  23. Weiler, I. J., Greenough, W. T. Metabotropic glutamate receptors trigger postsynaptic protein synthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 7168-7171 (1993).
  24. Gray, E. G., Whittaker, V. P. The isolation of nerve endings from brain: An electron microscopic study of cell fragments derived by homogenization and centrifugation. J. Anat. 96, 79-88 (1962).
  25. Gylys, K. H., Fein, J. A., Yang, F., Cole, G. M. Enrichment of Presynaptic and Postsynaptic Markers by Size-Based Gating Analysis of Synaptosome Preparations From Rat and Human Cortex. Cytometry A. 60, 90-96 (2004).
  26. Hajós, F. An improved method for the preparation of synaptosomal fractions in high purity. Brain Res. 93, 485-489 (1975).
  27. Bai, F., Witzmann, F. A. Synaptosome Proteomics. Subcell. Biochem. 43, 77-98 (2007).
  28. Rao, A., Steward, O. Evidence that protein constituents of postsynaptic membrane specializations are locally synthesized: analysis of proteins synthesized within synaptosomes. J Neurosci. 11, 2881-2895 (1991).
  29. Pertoft, H., Laurent, T. C. Isopycnic separation of cells and cell organelles by centrifugation and modified colloidal silica gradients. Methods of Cell Separation. Catsimpoolas, N. , Plenum Press. New York. 25-65 (1977).
  30. Ramarao, C. S., Acharya, S. R., Krishnan, K. S., Kenkare, U. W. High affinity uptake of L-glutamate and γ-aminobutyric acid in Drosophila melanogaster. J. Biosci. 11, 119-135 (1987).
  31. Munteanu, L. S., Dinu, A. Fractionation of granulocytes from whole human blood by centrifugation. Practical hints. Romanian J. Biophys. 14, 53-58 (2004).
  32. Cell separation composition, kit and method. US patent. Vlasselaer, P., Van Palathumpat, V. , 019713 (1997).

Tags

Neuroscience גיליון 55 synaptoneurosomes synaptosomes Percoll-סוכרוז הדרגתיים נוירונים סינפסה קליפה עכבר
הכנת Synaptoneurosomes מ - עכבר Cortex באמצעות צבע רציפה Percoll-סוכרוז צפיפות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Westmark, P. R., Westmark, C. J.,… More

Westmark, P. R., Westmark, C. J., Jeevananthan, A., Malter, J. S. Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient. J. Vis. Exp. (55), e3196, doi:10.3791/3196 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter