Summary
En metod för att förbereda translationally aktiv, intakt synaptoneurosomes (SNS) från mus hjärnbarken beskrivs. Metoden använder en diskontinuerlig Percoll-sackaros densitetsgradient möjliggör en snabb beredning av aktiva SNS.
Abstract
Synaptoneurosomes (SNS) erhålls efter homogenisering och fraktionering av musen hjärnbarken. De är återförslutas blåsor eller isolerade terminaler bryta sig loss från axon terminaler när kortikala vävnad homogeniserad. SNS behålla pre-och postsynaptiska egenskaper, vilket gör dem användbara i studiet av synaptisk transmission. De behåller de molekylära maskiner som används i neuronala signalering och kan upptag, lagring och frisättning av signalsubstanser.
Produktionen och isolering av aktiva SNS kan vara problematiskt att använda medier som Ficoll, som kan vara cytotoxiska och kräva förlängd centrifugering på grund av hög densitet, och filtrering och metoder centrifugering, vilket kan resultera i låg aktivitet på grund av mekaniska skador på SNS. Ger dock användning av diskontinuerliga Percoll-sackaros densitetsgradienter att isolera SNS en snabb metod för att producera bra skördar av translationally aktiva SNS. Den Percoll-sackaros gradientmetoden är snabb och skonsam som sysselsätter isoton förhållanden, har färre och kortare centrifugering snurrar och undviker centrifugering steg som pellets SNS och orsaka mekaniska skador.
Protocol
1. Förberedelser 1-4
- Förbered 500 ml gradient medium (GM) buffert genom att blanda 50 ml av en 2,5 M sackaros flytgödsel, 2,5 ml av en 1M Tris-HCl, pH7.5 lager, och 0,1 ml av en 0,5 m EDTA, pH 8,0 lager med milli- Q-vatten till volym. Filtrera sterilisera lösningen, alikvot och förvara fryst.
- Förbered en 1000x lager av tetrodotoxin (TTX) genom att göra en 1 mM lösning i Milli-Q H 2 O. Alikvoter av TTX kan lagras vid -20 ° C.
- Förbered 10x Stimulering buffert genom att göra en lösning av 100 mM Tris (pH 7,5), 5 mm Na 2 HPO 4, 4 mm KH 2 PO 4, 40 mm NaHCO 3, och 800 mM NaCl i Milli-Q Water. Lager kan lagras vid 4 ° C.
- Pre-cool centrifuger till 4 ° C.
- Bered en stamlösning av Isosmotic Percoll (SIP) genom att lägga till 9 volymer Percoll (18 ml) till 1 volym 2,5 M sackaros (2 ml) i milli-Q vatten och blanda väl.
- Förbered 3, 10, 15 och 23% lager lutning genom att lägga till respektive belopp för SIP till GM buffert och blanda varje:
- Häll lutning lager genom att pipettera 2 ml vardera av de 23, 15, 10, och 3% isosmotic lösningar Percoll i Beckman centrifugrör med lock med en P1000 Gilson Pipetman. Gränssnittet mellan skikten ska vara tydligt urskiljbar utan blandning av lagren. Förvara gradienter vid 4 ° C i minst 20 minuter före användning. Den lutningar kan lagras upp till 24 timmar även samma dag användning rekommenderas. [Oerfarna lab personal får öva förbereder gradienter genom att lägga till blått färgämne till isomotic Percoll lösningar för visualisering av lagret gränssnitt.]
2. Mus dissektion 1
- Se till att alla mus djurhållning och eutanasi ingrepp utförs i enlighet med NIH och universitet riktlinjer. Euthanize valpar (ålder P13 till P21) genom att koldioxid kvävning eller med en metod som godkänts av i djurets protokollet.
- Pin musen till en dissektion styrelse och spraya nacke och huvud med etanol. Med en vass sax skär genom ryggmärgen vid skallbasen, ta bort skinnet från toppen av skallen, skära skallen sidled mellan parietala ben och interparietal ben eller mellan storhjärnan och cortex regioner. Klipp skallen från basen till näsan (längs sagital suturen), försiktigt bort den mjuka parietala ben genom att dra varje halvklotet åt sidan och ta bort barken med en spatel. Sätt spateln in i hjärnan ovanför lillhjärnan och gröp ur hjärnbarken och placera den i iskallt GM buffert. Genast fortsätta till homogenisering steg. Låt inte cortex sitta i iskalla buffert för mycket länge detta negativt påverkar bildandet av SNS.
3. Beredning av homogenatet och SNS 1-4
- Skölj cortex i iskallt GM buffert och överför två cortices till ett glas Dounce homogeniseringsapparat innehåller 5 ml kallt GM buffert.
- Försiktigt homogeniseras i cortex med 5-10 slag av lös mortelstöt (mortelstöt "A"), följt av 5-10 slag av snäva mortelstöt (mortelstöt "B"). Strokes bör vara snabb, men långsam nog för att inte orsaka luftbubblor. En bild av homogenatet efter homogenisering är i Scheme 1. Det antal slag kommer att variera beroende på individen homogeniseringsblandare och tillhörande pestles. När du är klar gradienterna ska ge en stark SN band, om inte, justera antal slag.
- Överför homogenatet till en 15 ml konisk och centrifugera vid 1000xg i 10 min vid 4 ° C i en svängig hink rotorn (Allegra 6KR centrifug) till pellets cellulär skräp och kärnor. En bild av spunnen homogenatet är i Scheme 1.
- Layer 2 ml av supernatanten per Percoll-sackaros gradient, mössa rören och centrifugera vid 32.500 xg under 5 minuter vid 4 ° C i en fast vinkel rotor (Beckman J2-21 centrifug, JA-17 rotorn) med hjälp av lämpliga adaptrar ( Se Reagenser och utrustning tabell).
- Pipettera av och kassera lösningen ovanför SN band med hjälp av ett glas pasteurpipett. Pipettera från SN bandet på 15/23% gränssnitt, överföring till en konisk och förvara på is. Varje lutning eller en cortex ger 0,9-1,1 ml SN.
- Justera salt koncentrationen av SNS genom att lägga till en tiondel volym 10x stimulering buffert, lägga 1000x CaCl 2 till en slutlig koncentration på 12 nM, och tillsätt 1 mM TTX lager till en slutlig koncentration av 1 mikroM att undertrycka ospecifik excitation. (Tillägg av CaCl 2 är frivilligt om det skulle påverka nedströms SN tillämpningar).
- Bestäm protein koncentrationen av SNS med Micro BCA Kit Protein-analys. (The Bradford protein analys rekommenderas inte på grund av slutsatsen av Percoll.)
- SNS kan användas direkt och snabbt för protein omräkningsdifferenserning studier. För andra applikationer SN lysat kan saneras eller koncentrerat med Pierce SDS-PAGE Sample Prep Kit.
4. Representativa resultat:
När musen cortex var homogeniserad och separeras på diskontinuerliga Percoll-sackaros gradienter (Scheme 1), 6 band eller fraktioner sågs (Figur 1). Det var tidigare visat att råttor hjärnbarken 3,5 att beståndsdelarna i den höga molekylvikten banden bröts membranet och myelinet och att pelleterat material som finns mitokondrier eller organeller (tabell 1). De 23% / 15% gränssnitt (Band 5) innehöll berikat SNS.
Bandet på 23% / 15%-gränssnitt, som innehåller intakt SNS, togs bort och granskas av elektronmikroskopi (EM) som beskrivits tidigare. 2,6 EM visade förekomst av intakt synaptiska vesikler och bevarandet av presynaptiska och postsynaptiska element (Figur 2). Isolering av pre-och postsynaptiska fack är viktigt för att pröva signalering och proteinsyntesen, vilket sker i båda facken. 7-13 Den Percoll-sackaros gradient är en rå rening så vi såg mindre cell-, kärn-och organell föroreningar i SN bråkdel men totala separationen var bra.
När den undersöks genom Western blot innehöll Percoll fraktioner förväntade proteinmarkörer med en ökning i synaptiska renhet i SN-bandet (se figur 3, tabell 2). Synaptic och neuronala markörer bibehölls i berikade SN bandet (Band 5) men det överflöd av andra markörer minskade avsevärt. Framför allt var förekomsten av GFAP, en markör för astrocyternas och neoplastiska celler av stödjeceller ursprung och Lamin-B1, en nukleär markör, försumbara, medan strukturella och synaptic markörer bibehölls eller förbättras. Dessutom fanns lagring av markörer för organeller, som mitokondrier och Golgi, som spelar en roll i proteinsyntesen.
Typiska avkastningen för SN bandet var 250-500 ng protein per mikroliter, som bestäms av BCA protein analysen. Aktiviteten hos SNS bestämdes av den mängd de novo proteinsyntesen närvarande som övervakas av [35S]-Met inbyggnad (Figur 4). 2 Basal translationell aktivitet ökade 1,56 gånger när SNS fick stimuleras med 50 mikroM glutamate/10 mikroM glycin (GLU) eller 5,12 gånger när den aktiveras med PIN1 hämmare juglone. PIN1 hämning är känd för att resultera i ökade proteinsyntesen. 2 För att bekräfta att ökningen i [35S]-Met inbyggnad berodde på de novo proteinsyntesen, lade vi 40 mikroM anisomycin, en proteinsyntes hämmare, och såg en markant minskning av bolagsordning i närvaro och frånvaro av Glu jämfört med basala nivåer. Också, på tillsats av 2% Triton-X 100, vilket stör integritet SNS var basala översättning minskade med 75%. Dessutom 2, när man undersöker banden (B4-B6) som visade mest synaptiska markör anrikning, SNS eller Band 5 hade den största aktiviteten för de novo proteinsyntesen (Figur 5). Således diskontinuerlig Percoll-sackaros gradienter ger snabbt en mycket aktiv och berikat SN band som kan användas för att studera protein översättning.
Det diskontinuerliga Percoll-sackaros lutning förfarande är mer fördelaktig än andra metoder eftersom mekaniska skador orsakas av tuffare förhållanden. Vid en jämförelse med filtrering metod, där rensas kortikala homogenat passerar genom en serie av filter som minskar i storlek, former 3,14-15 den Percoll metoden mer SNS med större aktivitet. Som framgår av Figur 6, då en alikvot av SNS utarbetats av en metod med filtrering fördes över en Percoll-sackaros lutning finns det mycket mindre SNS på 15/23% gränssnitt och en större mängd trasiga membran. När de novo proteinsyntesen mättes via S35-met bolagsordning, var SNS utarbetats av en metod med filtrering betydligt mindre aktiva (Figur 7). För att maximera translationell aktivitet använder vi möss som är mellan ålder P14 och P18. SN kan framställas från vuxna möss, men vi observerade signifikant ökad translationell aktivitet med SN beretts av unga möss (Figur 8).
Tabell 1. Beståndsdelar av banden från den diskontinuerliga Percoll-gradient fractionations av homogeniserade musen cortex. 3,5
Tabell 2. Sammanfattning av västerländska bult analys av diskontinuerliga Percoll-sackaros beståndsdelar gradient bandet. Relativ protein koncentrationerna för varje bandet fraktioner isoleras med hjälp av en diskontinuerlig Percoll-sackaros lutning bestämdes av Western blot. Inga protein (-), 0 ≥ 0,2 (+), 0,2 ≥ 0,8 (++), eller> 0,8 (+++) gånger högre än protein i supernatanten (S, centrifugeras cortex homogenatet), representant för n = 3.
Scheme 1: Schematisk bild av ett SN beredning med hjälp av en diskontinuerlig Percoll-sackaros densitetsgradient Mus hjärnan cortex var dissekeras, homogeniserad och centrifugeras vid låg hastighet för att avlägsna icke-homogeniserad vävnad, celler, hela organeller såsom kärnor och membran.. Det diskontinuerliga lutning bör ha klart definierade lager. Bilden infällda bilden visar ett exempel på lager, som har färgats blå illustrativ för att visualisera lager. Supernatanten är lager på toppen av en diskontinuerlig Percoll-sackaros lutning och centrifugeras vid medelhastighet. Den SN Bandet är sedan hämtas från gradienten och är klar att använda.
Figur 1. Homogenatet fraktionering av en diskontinuerlig Percoll-sackaros lutning. Mus cortex var homogeniserad och separeras på en diskontinuerlig Percoll-sackaros lutning ger upphov till 6 band eller fraktioner. Den renade, aktiva SNS (*) hittades i Band 5.
Figur 2. SN förberedelser ger en heterogen blandning av SNS som behåller presynaptiska och postsynaptiska element. En elektron mikroskop av en SN preparat framställda av C57BL / 6 möss (ålder P13 till P21) utfördes som tidigare beskrivits och visar SNS med bevarade presynaptiska och postsynaptiska element. 2 , 6 röda pilarna pekar på postsynaptiska densiteter. Skala bar är 1 mikrometer.
Figur 3. Western blot analyser av SN förberedelser visade att Synaptic och neuronala markörer bibehölls i det renade SNS (Band 5) men det överflöd av andra markörer minskade avsevärt. Immunoblots av supernatanten (S, centrifugeras kortikala homogenatet) och Band 1-6 av en diskontinuerlig Percoll-sackaros gradient var sonderade för β-Actin (strukturella, lastning kontroll), GFAP (astrocytic), GP73 (Golgi), HSC70 (cytoplasmisk och nukleära), Lamin-B1 (kärnkraft), Prohibitin (mitokondriell), PSD95 (postsynaptiska densitet ), SNAP25 (synaptic), synaptophysin (synaptic) och β3-tubulin (neuron-specifika). Banden var visualiseras med hjälp av en storm 860 Phosphorimager, representant för n = 3.
Figur 4. SNS är aktiva och uppvisar de novo proteinsyntesen via [35S]-Met bolagsordningen. SNS var pre-jämvikt till 37 ° C i 10 min. Då SNS var obehandlat eller förbehandlat i 15 min med 40 mikroM anisomycin eller 1 mikroM juglone vid 37 ° C följt av tillsats av [35S]-Met, Mix 20 l Express Pro Label S35 Lätt tagg, plus eller minus Glu vid 37 ° C i 30 min. Proverna var beredda att använda Pierce SDS-PAGE Sample Prep Kit, köras på en 15% polyakrylamidgel, torkas och kvantifieras med hjälp av en Molecular Dynamics Storm 860 phosphorimager, representant för n = 3, ± SEM.
Figur 5. Band 5 från diskontinuerlig Percoll-sackaros gradient innehöll de högsta nivåerna av de novo proteinsyntes. Band 4, 5 och 6 och supernatanten (S, centrifugeras kortikala homogenatet) var pre-jämvikt till 37 ° C i 10 min. Sedan [35S]-Met, Express Pro Label Blanda S35 Lätt Tag, lades till, plus eller minus Glu vid 37 ° C i 30 min. Proverna var beredda att använda Pierce SDS-PAGE Sample Prep Kit, köras på en 15% polyakrylamidgel, torkas och kvantifieras med hjälp av en Molecular Dynamics Storm 860 phosphorimager, representant för n = 3, ± SEM.
Figur 6. SNS beretts av en filtrering metod innehåller mer trasiga membran och mindre hela SNS än SNS beretts av de diskontinuerliga Percoll-sackaros gradientmetoden. SNS har upprättats genom att skicka homogeniseras hjärnbarken genom en serie filter med minskande porstorlek som beskrivits tidigare. 3,14-15 en delmängd av SNS utarbetats av filtrering metoden var centrifugeras över en diskontinuerlig Percoll-sackaros lutning och jämförs med motsvarande belopp av material med hjälp av diskontinuerlig Percoll-sackaros gradientmetoden.
Figur 7. SNS beretts av en filtrering metod innehåller mindre de novo aktivitet proteinsyntes än sns beredd tillbakam det diskontinuerliga Percoll-sackaros gradientmetoden. SNS har upprättats genom att skicka homogeniseras hjärnbarken genom en serie filter med minskande porstorlek som beskrivits tidigare, 3,14-15 och av diskontinuerlig Percoll-sackaros gradient metoder. SNS från både förberedelser till jämvikt till 37 ° C i 10 min. Sedan [35S]-Met, Express Pro Label Blanda S35 Lätt Tag, lades till, plus eller minus Glu vid 37 ° C i 30 min. Proverna var beredda att använda Pierce SDS-PAGE Sample Prep Kit, köras på en 15% polyakrylamidgel, torkas och kvantifieras med hjälp av en Molecular Dynamics Storm 860 phosphorimager, representant för n = 3, ± SEM.
Figur 8. SNS från yngre möss (P14) har större translationell aktivitet än äldre möss (P85). SNS var beredda från olika åldrarna möss med diskontinuerlig Percoll-sackaros gradientmetoden, preequilibrated vid 37 ° C i 10 min, behandlat eller obehandlat med Glu i Förekomsten av [35S]-Met (Express Pro Label Blanda S35 Lätt Tag) i 30 min, snap fryst, och senare städas upp med Pierce SDS-PAGE Sample Prep Kit. SNS har sedan köras på en 12% SDS-polyakrylamidgel, torkade och avbildat på ett Molecular Dynamics Storm 860 phosphorimager, representant för n = 3, ± SEM. SNS från P14 möss var minst tre gånger mer aktiv än P85 möss.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det diskontinuerliga Percoll-sackaros gradient förberedelser som beskrivs häri är en snabb, tillförlitlig metod att isolera aktiva SNS, som kan användas i en mängd olika synaptisk transmission experiment. Denna gradient metod, som bygger på den metod som utvecklats av Dunkley et al., 3,4 är en subcellulära hjärna fraktionering förfarande som isolerar både pre-och postsynaptiska membran som härrör blåsor som är kopplade till varandra. Utan ytterligare rening dessa SNS är kompatibla med en mängd olika molekylärbiologiska tekniker, inklusive immunoprecipitation, Western blotting, flödescytometri, övervaka de novo proteinsyntesen via [35S]-Met bolagsordning, elektronmikroskopi, och en mängd enzymaktivitet analyser inklusive isomerase och kinasaktivitet analyser.
Det diskontinuerliga Percoll-sackaros gradient förfarandet är relativt enkelt, men det är nyckeln till att hålla lösningar och material från hjärnan vid 4 ° C under beredning och att i förväg kyla lutningar. Även om homogenatet hålls iskall hela tiden för att minimera proteolys, för bättre avkastning med större aktivitet är det bäst att inte låta cortex sitta på isen i GM buffert för länge innan homogenisering. Bildandet av SNS är bäst när cortex sköljs och sedan snabbt homogeniserad. Den homogenatet, kan dock förvaras på is före den första centrifugeringen utan negativa effekter. Speed är ett problem när cortex har skördats, så isoleringen av SNS bör slutföras så snabbt som möjligt. Även SNS kan behålla hög aktivitet i 1-2 timmar, kommer en längre tid mellan stegen resulterar i minskad aktivitet. Åldern på de möss som används för SN beredningen är också en nyckelfråga. Det har visat sig tidigare att det finns en åldersrelaterad minskning av synaptisk plasticitet hos gnagare. 16-19 Vi har sett samma effekt i SNS. Även äldre möss kan användas för att göra translationally aktiva SNS, har vi funnit att yngre möss (P14) har större translationell aktivitet sedan äldre möss (P85).
Det finns flera varianter och kombinationer av filtrering, 5,14-15,20-23 centrifugering, 24-27 och metoder lutning 26-29 som har använts för att förbereda SNS och alla har sina egna fördelar och nackdelar. Filtrering och centrifugering metoder kan orsaka mekaniska skador på SNS. De metoder som har använt olika por storlek filter resulterade i en större andel av trasiga membran och ger betydligt mindre SNS. Vi försökte filtret metoden, 5,14-15 som passerar homogenatet genom en serie av filter med sjunkande porstorlek och fann att SNS utarbetats av en metod med filtrering var betydligt mindre aktiva. Centrifugeringen metoder också resultera i mekaniska skador på grund av den långvariga snurrar i hög hastighet som pellets eller kompakt SNS i botten av rör och kräver resuspension. Percoll använder mildare villkor som undviker filtrering eller pelletering SNS, som kan krossa eller lyseras SNS. SN förfaranden som utnyttjar Ficoll 28,30-32 eller hög molarities sackaros 4,31 också leda till skadade eller mindre aktiva SNS, nedsatt biologisk funktion och morfologiska förändringar. 31-32 Ficoll kan orsaka oönskade celler aggregering vid fysiologiskt pH och ger osmotiska gradienter med ökande koncentrationer. 31-32 För att hålla isoosmotic förutsättningar, lutningar måste kompenseras med ett salt lutning. 31 SNS förberedda med hög koncentration av sackaros (1,4 till 0,8 M) resulterar i mindre och mindre aktiva SNS. 4
Det diskontinuerliga Percoll-sackaros metoden övervinner många av de frågor som med andra medier och förfaranden centrifugering. En stor fördel med denna metod är att använda Percoll, som har en låg viskositet, låg osmolalitet och relativt ingen toxicitet mot celler och deras beståndsdelar, vilket gör det bättre lämpat för experiment densitetsgradient än alternativen. 4,29 Dessutom Percoll kan vara beredd med sackaros för att upprätthålla osmolaritet behövs för att behålla SN integritet. 4 Använda diskontinuerlig Percoll-sackaros gradienter minskar centrifugeringstiden tiden från 30-45 min till 5 min, och därigenom förlänga användbara livslängd för SNS, som har en begränsad livslängd för aktivitet . En annan fördel med Percoll gradienter är det högre avkastning och aktivitet SNS jämfört med metoder som använder filter för att bilda SNS. Vi sprang SNS från filtret metod under en Percoll-sackaros lutning. Vi hittade en knappt urskiljbar SN band och ett överflöd av högre molekylvikt trasiga membran på övertoningen. Dessutom var translationell aktiviteten hos SNS utarbetats av Percoll metoden betydligt högre än med filtret metoden. Sammantaget är Percoll att föredra framför andra metoder eftersom den använder mildare villkor som undviker filtrering och pelletering SNS resulting mer lagring av synaptisk aktivitet och bättre vesikler formation. Fördelen med vår metod över Dunkley, et al, 3,4 är att ett glas var glas Dounce homogeniseringsblandare används här i motsats till den motordrivna teflon, glas homogeniseringsblandare som skadar mest postsynaptiska terminalen bilagor och leder till postsynaptiska element utsätts för media och mycket få blir instängd av oskadade hinnor.
Betydande arbete har fokuserat på proteinsyntesen i postsynaptiska densitet 11-13, men lite arbete har gjorts för att studera proteinsyntesen i presynaptiska fack. Det finns dock bevis för att proteinsyntesen sker i presynaptiska terminalerna. 7-10 Som framgår i elektron mikroskop av SNS, pre-och postsynaptiska bilagor finns i SN beredningen gör dem ett idealiskt system för framtida studier av translationell aktivitet i både fack.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi vill tacka BK augusti från University of Wisconsin-Madison Electron Microscope mikrokreditinstrumentet för elektronmikroskop. Detta arbete stöddes av NIH bidrag R01-DA026067 och P30-HD03352 (till JSM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Micro BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23235 | |
| CaCl2 | Fisher | C79-500 | |
| CO2 gas | Airgas (UW-MDS) | CD 50 | |
| EDTA | RPI | E57020 | |
| EtOH | Fisher | A407SK-4 | |
| HCl | Fisher | A142-212 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| KH2PO4 | Fisher | P285-500 | |
| PierceSDS-PAGE Sample Prep Kit | Pierce | 89888 | |
| NaCl | RPI | S23020 | |
| NaHCO3 | Fisher | BP328-500 | |
| Na2PHO4 | Fisher | S381-500 | |
| Sucrose | RPI | S24060 | |
| Tris Base | RPI | T60040 | |
| Tetrodotoxin | Sigma | T5651 | |
| Express Pro Label Mix S35 Easy Tag | Perkin Elmer | NEG772 | |
| Equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Dissection tools | |||
| Dounce homogenizer, 7 mL (comes with two glass pestles labled " A" and "B") | Wheaton | ||
| P1000 Gilson Pipetman | Gilson | F123602 | |
| Allegra 6KR Centrifuge | Beckman Coulter | 366830 | |
| GH 3.8 Rotor, Swinging bucket rotor | Beckman Coulter | 360581 | |
| Beckman J2-21 Centrifuge | Beckman | ||
| Beckman tubes with caps | Beckman | 355672 | |
| White walled adapters | Beckman | 342327 | |
| Blue walled adapters | Beckman | ||
| JA-17 Rotor, Fixed-angle rotor | Beckman | 369691 | |
Table of antibodies used for western blots: |
|||
| Name of Antibody | Company | Catalogue number | Host Species |
| β-Actin | Sigma | A5441 | mouse |
| GFAP | Santa Cruz | sc-65343 | mouse |
| GP73 | Santa Cruz | Sc-134509 | rabbit |
| HSC70 | Santa Cruz | sc-7298 | mouse |
| Laminβ | Santa Cruz | Sc-6261 | goat |
| Prohibitin | Santa Cruz | sc-28259 | rabbit |
| PSD95 | Millipore | MAB1596 | mouse |
| SNAP25 | AbCam | ab5666-100 | rabbit |
| Synaptophysin | Millipore | MAB368 | mouse |
| β-3-Tubulin | Santa Cruz | sc-80016 | mouse |
|
|||
References
- Westmark, C. J., Malter, J. S. FMRP mediates mGluR5-dependent translation of amyloid precursor protein. PLoS Biol. 5, e52-e52 (2007).
- Westmark, P. R., Westmark, C. J., Wang, S., Levenson, J., O'Riordan, K. J., Burger, C., Malter, J. S. Pin1 and PKMzeta sequentially control dendritic protein synthesis. Sci Signal. 3, ra18-ra18 (2010).
- Dunkley, P. R., Heath, J. W., Harrison, S. M., Jarvie, P. E., Glenfield, P. J., Rostas, J. A. A rapid Percoll gradient procedure for isolation of synaptosomes directly from an S1 fraction: Homogeneity and morphology of subcellular fractions. Brain Res. 441, 59-71 (1988).
- Dunkley, P. R., Jarvie, P. E., Robinson, P. J. A rapid Percoll gradient procedure for preparation of synaptosomes. Nat. Protoc. 3, 1718-1728 (2008).
- Hollingsworth, E. B., McNeal, E. T., Burton, J. L., Williams, R. J., Daly, J. W., Creveling, C. R. Biochemical characterization of a filtered synaptoneurosome preparation from guinea pig cerebral cortex: cyclic adenosine 3':5'-monophosphate-generating systems, receptors, and enzymes. J. Neurosci. 5, 2240-2253 (1985).
- Yi, H., Leunissen, J., Shi, G., Gutekunst, C., Hersch, S. A novel procedure for pre-embedding double immunogold-silver labeling at the ultrastructural level. J. Histochem. Cytochem. 49, 279-284 (2001).
- Akins, M. R., Berk-Rauch, H. E., Fallon, J. R. Presynaptic translation: stepping out of the postsynaptic shadow. Front. Neural Circuits. 3, (2009).
- Jin, I., Kandel, E. R., Hawkins, R. D. Whereas short-term facilitation is presynaptic, intermediate-term facilitation involves both presynaptic and postsynaptic protein kinases and protein synthesis. Learn. Mem. 18, 96-102 (2011).
- Lyles, V., Zhao, Y., Martin, K. C. Synapse formation and mRNA localization in cultured Aplysia neurons. Neuron. 49, 349-356 (2006).
- Wagatsuma, A., Azami, S., Sakura, M., Hatakeyama, D., Aonuma, H., Ito, E. De Novo synthesis of CREB in a presynaptic neuron is required for synaptic enhancement involved in memory consolidation. J. Neurosci. Res. 84, 954-9560 (2006).
- Sutton, M. A., Schuman, E. M. Local translational control in dendrites and its role in long-term synaptic plasticity. J. Neurobiol. 64, 116-131 (2005).
- Li, K. -W., Hornshaw, M. P., Van der Schors, R. C., Watson, R., Tate, S., Casetta, B., Jimenez, C. R. Proteomics analysis of rat brain postsynaptic density: implications of the diverse protein functional groups for the integration of synaptic physiology. J. Biol. Chem. 279, 987-1002 (2004).
- Peng, J., Kim, M. J., Cheng, D., Duong, D. M., Gygi, S. P., Sheng, M. Semi-quantitative proteomic analysis of rat forebrain postsynaptic density fractions by mass spectrometry. J. Biol. Chem. 279, 21003-21011 (2004).
- Kim, S. H., Fraser, P. E., Westaway, D., St. George-Hyslop, P. H. Group II metabotropic glutamate receptor stimulation triggers production and release of Alzheimer's amyloid β42 from isolated intact nerve terminals. J. Neurosci. 30, 3870-3875 (2010).
- Weiler, I. J., Greenough, W. T. Potassium ion stimulation triggers protein translation in synaptoneurosomal poiyribosomes. Mol. Cell. Neurosci. 2, 305-314 (1993).
- Billard, J. M. Ageing, hippocampal synaptic activity and magnesium. Magnes Res. 19, 199-215 (2006).
- Murphy, G. G., Fedorov, N. B., Giese, K. P., Ohno, M., Friedman, E., Chen, R., Silva, A. J. Increased neuronal excitability, synaptic plasticity, and learning in aged Kvbeta1.1 knockout mice. Curr. Biol. 14, 1907-1915 (2004).
- Norris, C. M., Halpain, S., Foster, T. C. Reversal of Age-Related Alterations in Synaptic Plasticity by Blockade of L-Type Ca21 Channels. J. Neurosci. 18, 3171-3179 (1998).
- Sallert, M., Malkki, H., Segersträlea, M., Tairaa, T., Lauri, S. E. Effects of the kainate receptor agonist ATPA on glutamatergic synaptic transmission and plasticity during early postnatal development. Neuropharm. 52, 1354-1365 (2007).
- Quinlan, E. M., Philpot, B. D., Huganir, R. L., Bear, M. F. Rapid, experience-dependent expression of synaptic NMDA receptors in visual cortex in vivo. Nat. Neurosci. 2, 357-35 (1999).
- Scheetz, A. J., Nairn, A. C., Constantine-Patton, M. NMDA receptor-mediated control of proteins synthesis at developing synapses. Nat. Neurosci. 3, 211-216 (2000).
- Villasana, L. E., Klann, E., Tejada-Simon, M. V. Rapid isolation of synaptoneurosomes and postsynaptic densities from adult mouse hippocampus. J. Neurosci. Methods. 158, 30-36 (2006).
- Weiler, I. J., Greenough, W. T. Metabotropic glutamate receptors trigger postsynaptic protein synthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 7168-7171 (1993).
- Gray, E. G., Whittaker, V. P. The isolation of nerve endings from brain: An electron microscopic study of cell fragments derived by homogenization and centrifugation. J. Anat. 96, 79-88 (1962).
- Gylys, K. H., Fein, J. A., Yang, F., Cole, G. M. Enrichment of Presynaptic and Postsynaptic Markers by Size-Based Gating Analysis of Synaptosome Preparations From Rat and Human Cortex. Cytometry A. 60, 90-96 (2004).
- Hajós, F. An improved method for the preparation of synaptosomal fractions in high purity. Brain Res. 93, 485-489 (1975).
- Bai, F., Witzmann, F. A. Synaptosome Proteomics. Subcell. Biochem. 43, 77-98 (2007).
- Rao, A., Steward, O. Evidence that protein constituents of postsynaptic membrane specializations are locally synthesized: analysis of proteins synthesized within synaptosomes. J Neurosci. 11, 2881-2895 (1991).
- Pertoft, H., Laurent, T. C. Isopycnic separation of cells and cell organelles by centrifugation and modified colloidal silica gradients. Methods of Cell Separation. Catsimpoolas, N. , Plenum Press. New York. 25-65 (1977).
- Ramarao, C. S., Acharya, S. R., Krishnan, K. S., Kenkare, U. W. High affinity uptake of L-glutamate and γ-aminobutyric acid in Drosophila melanogaster. J. Biosci. 11, 119-135 (1987).
- Munteanu, L. S., Dinu, A. Fractionation of granulocytes from whole human blood by centrifugation. Practical hints. Romanian J. Biophys. 14, 53-58 (2004).
- Cell separation composition, kit and method. US patent. Vlasselaer, P., Van Palathumpat, V. , 019713 (1997).
