Immunology and Infection

יישום של עכבר Ligated מעיים תיקון של Peyer Assay Loop להערכת ספיגת חיידקים על ידי תאים M

Published: December 17, 2011 doi: 10.3791/3225

Shinji Fukuda¹, Koji Hase¹, Hiroshi Ohno¹

¹Laboratory for Epithelial Immunobiology, RIKEN Research Center for Allergy and Immunology

Summary

בתאי האפיתל M זקיק הקשורים התמחה כיסוי טלאים של Peyer לשחק תפקיד חשוב עבור immunosurveillance הרירית ברקמת המעי הקשורים הלימפה. כאן אנו תיאר את שיטת הערכה transcytosis חיידקי ידי תאים M

Abstract

החלק הפנימי של המעי שלנו מאוכלס עם מספר עצום של חיידקים commensal. פני הרירית של מערכת העיכול חשופה ברציפות אליהם מדי פעם כדי פתוגנים. רקמת מעי הקשורים הלימפה (Galt) לשחק תפקיד מפתח לזירוז של התגובה החיסונית ברירית אלה החיידקים ^{1, 2.} כדי ליזום את התגובה החיסונית ברירית, אנטיגנים הרירית חייב להיות מועבר מן לומן המעיים על פני המכשול אפיתל לתוך זקיקי הלימפה מאורגן כמו טלאים של Peyer. Transcytosis אנטיגן זה מתווך על ידי תאים מיוחדים M אפיתל ^{3, 4.} תאים M הם תאים אפיתל טיפוסיות כי פעיל phagocytose מקרומולקולות חיידקים. שלא כמו תאים דנדריטים (DCS) וכן מקרופאגים, אנטיגנים אשר היעד lysosomes של השפלה, תאים M בעיקר transcytose אנטיגנים הפנימו. זה transcytosis macromolecular נמרץ באמצעות תאים M מספק אנטיגן אל זקיקי הלימפה הבסיסית מאורגןד הוא האמין להיות חיוני ליזום אנטיגן ספציפי התגובה החיסונית ברירית. עם זאת, המנגנונים המולקולריים בקידום זה ספיגת אנטיגן על ידי תאים M אינם ידועים ברובם. יש לנו דיווח בעבר כי גליקופרוטאין 2 (Gp2), הביע במפורש על הממברנה פלזמה apical של תאים M בין enterocytes, משמש לרצפטור transcytotic עבור משנה של commensal ו פתוגניים enterobacteria, כולל coli Escherichia ו סלמונלה enterica serovar Typhimurium (ס Typhimurium ), על ידי הכרה FimH, רכיב של סוג אני פילי על הממברנה החיצונית חיידקי ^5. כאן, אנו מציגים שיטה ליישום התיקון assay Peyer של העכבר לולאת המעי להעריך את ספיגת חיידקים על ידי תאים ז. שיטה זו היא גרסה משופרת של assay עכבר לולאת המעי שתואר לעיל ^{6, 7.} נקודות לשיפור הן כדלקמן: 1. Isoflurane שימש כסוכן הרדמה. 2. כ 1 ס"מ ligated includ לולאת המעיתיקון ing של Peyer הוקם. 3. חיידקים נלקח על ידי תאים M היו שכותרתו fluorescently ידי מגיב תיוג או על ידי חלבון פלואורסצנטי overexpressing ניאון כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP). 4. בתאי האפיתל M זקיק הקשורים מכסה תיקון של Peyer התגלו על ידי כל הר immunostainig עם נוגדן אנטי Gp2. 5. Transcytosis פלורסנט חיידקי ידי תאים M נצפו על ידי ניתוח מיקרוסקופי confocal. מעיים המדבקה Peyer של העכבר assay לולאה יכול לספק את התשובה איזה סוג של commensal או חיידקים פתוגניים transcytosed ידי תאים M, ועלולה לגרום לנו להבין את המנגנון המולקולרי של איך לגרות את המערכת החיסונית ברירית באמצעות תאים ז.

Protocol

1. הכנת תאים חיידקיים

גליצרול Streak מצויד חיידקים ניאון (כמו ה-GFP לבטא ס Typhimurium) LB על צלחת אגר המכילה 100 מיקרוגרם / מ"ל של אמפיצילין.
תרבות מושבה אחת מן אגר LB לילה 2 מ"ל של מדיום LB חדש.
הוסף 0.5 מ"ל של תרבית החיידקים עד 4.5 מ"ל של מדיום LB דגירה חדשים עד צפיפות אופטית של 1.0 ב 600 ננומטר הוא הגיע.
קציר תאים חיידקיים ידי צנטריפוגה (3000 XG, 5 דק ', 4 ° C).
בטל supernatant ולשטוף פעמיים עם 5.0 מ"ל של תמיסת מלח סטרילית חיץ פוספט (PBS).
Resuspend גלולה חיידקי עם 5 מ"ל של PBS, ולהשתמש 50 μl של השעיה המכיל כ -10 יחידה ⁷ המושבה להרכיב (CFU) כמו inoculum.
במקרה של שימוש בחיידקים שכותרתו fluorescently, התאים חיידקי תויגו על ידי מגיב תיוג הקרינה על פי הפרוטוקול הסטנדרטי.

2.nesthesia

ממלאים קופסת פלסטיק קטנה (10 x 10 x 5 ס"מ) עם 5% (v / v) מתאדה isoflurane מעורבב עם אוויר (קצב זרימה: 200 mL / min).
הרדימי שמונה עד שש עשרה חלש בן עכברים זכר או נקבה בתיבה.
העבר את העכברים לשולחן נתיחה לאחר הרדמה.
ברציפות להרדים את העכברים ב -2% (v / v) מתאדה isoflurane מעורבב עם אוויר (קצב זרימה: 200 mL / min) (איור 1). זהו הליך סופני.

3. לולאה תיקון Peyer Ligated של assay

1cm לחרות של עור הבטן ולאחר מכן לחתוך את הבטן הצפק של עכבר הרדים לקחת את המעי הדק המכיל תיקון של Peyer.
ולקשור את המעי עם חוט תפירה, מקפיד להימנע כלי הדם. הערה: רק אחד לאגד צד של המעי, ולהשאיר את הצד השני משוחרר.
הזרק 50 μl של השעיה או חיידקי PBS (שליטה) בעזרת מזרק לתוך הלולאה תיקון Peyer של ligated על ים הרופףIDE של המעי (איור 2).
Bind צד רופף, קרוב לבטן של עכבר עם קליפ.
לאחר h 1, להסיר את ligated של Peyer לולאה תיקון ו להרדים את העכבר על ידי נקע בצוואר הרחם.
Peyer והבלו של תיקון מן הלולאה תיקון Peyer של ligated.
מהבהב הצד apical של תיקון של Peyer ידי 1ml של PBS עם שימוש במזרק המצורף מחט להסיר עודפי נוזלים ברירית וחיידקים. הברקה תיקון של Peyer נוסף פעמיים.

4. הר מכתים שלמות ניתוח מיקרוסקופי confocal של תיקון של Peyer

תיקון של תיקון Peyer בפתרון Cytofix / Cytoperm BD על הקרח עבור שעה 1.
לשטוף תיקון של Peyer שלוש פעמים עם 1ml של BD פרם / לשטוף חיץ עבור 5 דקות, ולאחר מכן לחסום עם 1 מ"ל של חיץ חסימת המכיל 0.1% (w / v) saponin, 0.2% (w / v) BSA ב PBS למשך 30 דקות על קרח.
הוספת 200 פי בדילול אנטי עכבר GP2 נוגדנים חד שבטיים (5 מיקרוגרם / מ"ל) ל הדגימה כדי לזהותM תאים.
דגירה של 2 שעות בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 ° C.
לשטוף שלוש פעמים עם 1 מ"ל של קר PBS, ולאחר מכן להוסיף 200 פי נוגדן אנטי דילול עכברוש IgG מצומדות עם DyLight549 (20 מיקרוגרם / מ"ל) כדי הדגימה.
לדגור על מדגם קרח במשך 2 שעות.
לשטוף שלוש פעמים עם 1 מ"ל של קר PBS, ולאחר מכן להוסיף 50 פי אלקסה בדילול 633 Phalloidin מצומדות כדי הדגימה כדי לזהות F-אקטין.
לדגור על קרח במשך 2 שעות.
לשטוף קלות עם 1 מ"ל של קר PBS. אז במקום 3-4 חתיכות זכוכית לכסות מעגלי בשקופית, ולהטביע את הדגימות בתמיסה 30% גליצרול ב PBS בשקופית (איור 3).
שימו לב דגימות עם מיקרוסקופ DM-IRE2 confocal סריקת לייזר או שחזור DeltaVision מיקרוסקופ deconvolution.

5. נציג תוצאות:

הדוגמה הדגימה של עכבר ligated לולאה תיקון של Peyer assay עם GFP-S. typhimurium נצפתה עם מיקרוסקופ deconvolution שיקום DeltaVision (איור 4). GFP-S. Typhimurium הוא transcytosed ידי GP2 תאים ⁺ M. מעיים תיקון Peyer של העכבר assay לולאה יכול לזהות סוג של חיידקים פתוגניים commensal או שניתן transcytosed ידי תאים ז.

באיור 1. הרדמה של עכברים בתנאי isoflurane מתאדה. לאייר isoflurane סופקו על ידי מנגנון הרדמה ייעודי (צד שמאל).

באיור 2. סיכום תיקון assay Peyer של ligated לולאה מעיים. המתלים חיידקי פלורסנט היה מוזרק על ידי מזרק לתוך הלולאה תיקון Peyer של ligated בצד רופף של המעי.

איור 3

איור 4. דוגמה של עכבר ligated לולאה תיקון של Peyer assay עם GFP-Typhimurium ס. GP2, אשר דיווחו כסמן תא ספציפי M ^5, היה מוכתם GP2 נוגדן אנטי עכבר (אדום). הדגימה נצפתה באמצעות מיקרוסקופ deconvolution DeltaVision שיקום. GFP-לבטא ס Typhimurium היה שותף מקומי עם GP2 על הממברנה של התא פלזמה apical M ו שלפוחית cytoplasmic subapical (ראשי חץ). למעלה, apical להציג. התחתונה בצד, נופים לרוחב. סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

זמן הדגירה של תיקון Peyer של ligated עם השעיה חיידקית היא בדרך כלל עבור שעות 1 כדי לבחון את שילוב חיידקים לתאי M. במקרה של דגירה 4 שעות, חיידקים מזוהים לעתים קרובות באזור תא T של טלאים של Peyer. כמו הרדמה מתאדה נשימתית isoflurane יכול לשמור על עכברים יציב, זמן הדגירה של תיקון Peyer של ligated עם השעיה חיידקי היא להארכה כדי לבחון את חיידקים אשר לנוע לתוך אזור T-cell בתיקון של Peyer. הנקודה החשובה של ניסוי זה הוא לטפל לא לשרוט את כלי הדם כאשר ligating במעי. במקרה של לא להשתמש GFP-הביע חיידקים, אנחנו יכולים לחילופין להשתמש חיידקים שכותרתו fluorescently ידי מגיב מסחרי תיוג פלואורסצנטי. אם מגיב אולי מעכב את החיידק, אשר ברצונך להשתמש, מצורף למולקולה הביע על התא M, אתה צריך להשתמש נוגדן ראשוני ספציפי, אם הוא זמין, כדי לזהות את החיידקים משולבים.

ontent "> שיטת ligated assay לולאה תוארה בעבר ^{6, 7} לנו לשפר כמה נקודות של שיטה זו כדלקמן:.. 1 Isoflurane משמש כסוכן הרדמה לשמירה על העכברים יציב 2 כ 1 ס"מ ligated לולאת המעי כולל Peyer של.. התיקון מוגדר. 3. חיידקים נלקח על ידי תאים M הם שכותרתו fluorescently ידי מגיב תיוג הקרינה או על ידי חלבון overexpressing ניאון כגון ה-GFP.. 4 תאים M האפיתל זקיק הקשורים מכסה תיקון של Peyer מזוהים על ידי כל הר immunostainig עם נוגדן אנטי Gp2. 5. transcytosis חיידקי פלורסנט על ידי תאים M הם נצפו על ידי ניתוח מיקרוסקופי confocal.

אנו ואחרים הוכיחו כי אנטיגנים הטרוגניים ומגוון פעיל לזכות הכניסה לתאי M. מספר ניכר של פתוגנים כולל סלמונלה spp., Shigella spp., Yersinia spp. לנצל תאים M עבור ^8-10 הפלישה המארח. יתר על כן, טופס coccoid של Helicפילורי obacter עלולה translocate לתוך התיקון של Peyer באמצעות תאים M ו טרנסלוקציה זה חיוני אינדוקציה של דלקת כרונית של הקיבה ^11. מצד שני, את המנגנונים שבאמצעותם תאים פתוגנים אלה לפלוש M להישאר להיות הובהר במלואו. אנו מציעים כי לולאה התיקון Peyer של ligated assay היא שיטה ניסיונית מתאים לנתח את יחסי הגומלין בין התאים M וסוכני פתוגניים in vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Acknowledgments

המחברים מבקשים להודות לכל חברי EIB לפיתוח טכניקה זו. מחקר זה מומן בחלקו על ידי מענק סיוע-in-למחקר מדעי על אזורי עדיפות "התנועה ממברנה" (HO), ו "המטריקס של תופעות זיהומיות" (קרן היסוד), מדענים צעירים (SF ו KH), ואת המחקר המדעי (HO ), וכן על תחומי מחקר מדעי חדשני "לוגיסטיקה תאיים" (HO), ממשרד החינוך, התרבות, הספורט, המדע והטכנולוגיה של יפן.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
LB Agar Ampicillin- 100	SIGMA	L5667
Cy3 mono-Reactive Dye Pack	GE Healthcare	PA23001
Alexa Fluor 350 carboxylic acid, succinimidyl ester	Invitrogen	A10168
Inhalation anesthesia apparatus	Shinano Seisakusho	SN-487
Fixation and Permeabilization Solution	BD	554722
Anti mouse Glycoprotein 2 antibody	MBL	D278-3	200-fold dilution (5μg/ml)
Goat Anti-Rat IgG, F(ab')2 fragment specific	Jackson ImmunoResearch	112-505-006	200-fold dilution (20μg/ml)
Alexa Fluor 633 Phalloidin	Molecular Probes	A22284	50-fold dilution
Confocal laser scanning microscope	Leica Microsystems	DMIRE2
DeltaVision Restoration deconvolution microscope	Applied Precision	DeltaVision Core