Summary
M celler i en specialiseret follikel-associerede epitel dækker Peyerske plaques spiller en vigtig rolle for mucosal immunosurveillance i tarmen-associerede lymfoide væv. Her har vi beskrev evalueringsmetode for bakteriel transcytosis af M celler
Abstract
Indersiden af vores tarm er beboet med enorme antal kommensale bakterier. Slimhinden i mave-tarmkanalen er kontinuerligt udsættes for dem og lejlighedsvis for patogener. Den gut-associerede lymfoide væv (Galt) spiller en central rolle for induktion af de mucosal immun reaktion på disse mikrober 1, 2. At indlede slimhinden immunrespons, skal slimhinde antigener blive transporteret fra tarmen lumen på tværs af epithelial barrieren til organiseret lymfoide follikler som Peyerske plaques. Dette antigen transcytosis er medieret af specialiserede epitelceller M celler 3, 4. M celler er atypiske epitelceller, der aktivt phagocytose makromolekyler og mikrober. I modsætning til dendritiske celler (DCS) og makrofager, som er målrettet antigener til lysosomer for nedbrydning, hovedsageligt M celler transcytose den internaliserede antigener. Denne energiske makromolekylære transcytosis gennem M celler leverer antigen til den underliggende organiseret lymfoide follikler end menes at være af afgørende betydning for iværksættelse af antigen-specifikke mucosale immunrespons. Men de molekylære mekanismer, der fremmer dette antigen optagelse af M celler er stort set ukendte. Vi har tidligere rapporteret, at glykoprotein 2 (GP2), især udtrykt på den apikale plasma membran af M celler blandt enterocyterne, tjener som et transcytotic receptor for en delmængde af kommensale og patogene enterobakterier, herunder Escherichia coli og Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium ), ved at anerkende FimH, en komponent af type I Pili på den bakterielle ydre membran 5. Her præsenterer vi en metode for anvendelse af en mus Peyer patch intestinal loop-analysen for at vurdere bakterielle optagelse af M celler. Denne metode er en forbedret udgave af musens tarm loop assay tidligere beskrevet 6, 7. De forbedrede punkter er som følger: 1. Isofluran blev brugt som et bedøvelsesmiddel agent. 2. Ca. 1 cm ligated tarm-loop herunderING Peyer patch blev oprettet. 3. Bakterier taget op af M-celler var fluorescens-mærkede ved fluorescens mærkning reagens eller ved overekspression fluorescerende protein som grønt fluorescerende protein (GFP). 4. M celler i hårsækken-associerede epitel dækker Peyer patch blev opdaget af hel-mount immunostainig med anti GP2 antistof. 5. Fluorescerende bakteriel transcytosis af M celler blev observeret ved konfokal mikroskopisk analyse. Musen Peyer patch tarm-loop-analysen kunne levere svaret, hvilken slags kommensale eller sygdomsfremkaldende bakterier transcytosed af M celler, og kan føre os til at forstå de molekylære mekanisme, hvordan man kan stimulere mucosal immunsystem gennem M celler.
Protocol
1. Udarbejdelse af bakterieceller
- Streak glycerol lager fluorescerende bakterier (som f.eks GFP udtrykke S. Typhimurium) på LB en agarplade indeholdende 100 mg / ml af ampicillin.
- Kultur en enkelt koloni fra LB agar natten i 2 ml nye LB medium.
- Tilsæt 0,5 ml bakteriekultur til 4,5 ml af nye LB medium og inkuber indtil optisk tæthed på 1,0 ved 600 nm er nået.
- Harvest bakterieceller ved centrifugering (3.000 xg, 5 min, 4 ° C).
- Supernatanten fjernes, og vaskes to gange med 5,0 ml steril fosfatbuffer saltvand (PBS).
- Resuspender bakteriel pellet med 5 ml PBS, og bruge 50 μl af suspensionen indeholder ca 10 7 kolonidannende enheder (CFU) som inokulum.
- Ved anvendelse af fluorescens-mærkede bakterier, blev de bakterieceller mærket af fluorescens mærkning reagens i henhold til standard-protokol.
2. Ennesthesia
- Fyld en lille plastik boks (10 x 10 x 5 cm) med 5% (v / v) fordampes isofluran blandet med luft (flow rate: 200 ml / min).
- Bedøver otte til seksten-svage gamle han-eller hun-mus i kassen.
- Flyt mus til en obduktion bordet efter anæstesi.
- Løbende bedøver de mus med 2% (v / v) fordampes isofluran blandet med luft (flow rate: 200 ml / min) (Figur 1). Dette er en terminal procedure.
3. Ligated Peyer patch loop assay
- Incise 1cm i bughuden og derefter klippe den abdominale peritoneum på en bedøvet mus og tage ud i tyndtarmen, der indeholder Peyer patch.
- Ligate tarmen med syr garn, idet man undgår blodkar. Bemærk: kun binder den ene side af tarmen, og lad den anden side løs.
- Indsprøjtes 50 μl af bakteriel suspension eller PBS (kontrol) med en sprøjte ind i ligated Peyer patch loop på løs side af tarmen (Figur 2).
- Bind løs side, og luk musens mave med et klip.
- Efter 1 time, fjerne ligated Peyer patch løkke, og aflive musen ved dislokation af halsen.
- Forbrugsafgifter Peyer patch fra ligated Peyer patch løkke.
- Blinkende den apikale side af Peyer patch ved 1 ml PBS med at bruge sprøjte fastgjort til en nål til at fjerne overskydende mucosale væske og bakterier. Flashing af Peyer patch yderligere to gange.
4. Hele mount farvning og konfokal mikroskopisk analyse af Peyer patch
- Fix Peyer patch i BD Cytofix / Cytoperm løsning på isen for 1 time.
- Vask Peyer patch tre gange med 1 ml BD Perm / Wash buffer i 5 min, og derefter blok med 1 ml blokerende buffer indeholdende 0,1% (w / v) saponin, 0,2% (w / v) BSA i PBS i 30 min på is.
- Tilsæt 200-fold fortyndet anti-mus GP2 monoklonalt antistof (5 mg / ml) til modellen til at opdageM celler.
- Inkuber i 2 timer ved stuetemperatur eller natten over ved 4 ° C.
- Vask tre gange med 1 ml kold PBS, hvorefter der tilsættes 200-fold fortyndet anti-rotte IgG antistof konjugeret med DyLight549 (20 mg / ml) til modellen.
- Inkuber prøven på is i 2 timer.
- Vask tre gange med 1 ml kold PBS, hvorefter der tilsættes 50-fold fortynding Alexa 633 konjugeret Phalloidin med modellen at opdage F-aktin.
- Inkuber på is i 2 timer.
- Vask let med 1 ml kold PBS. Derefter placerer 3-4 stykker af cirkulære dække glas på et dias, og integrere de prøver i en 30% opløsning af glycerol i PBS på diaset (Figur 3).
- Overhold prøver med en DM-IRE2 konfokal laser scanning mikroskop eller en DeltaVision Restoration deconvolution mikroskop.
5. Repræsentative resultater:
Prøven eksempel på en mus ligated Peyer patch loop analysen med GFP-S. Typhimurium blev observeret med en DeltaVision Restoration deconvolution mikroskop (Figur 4). GFP-S. Typhimurium er transcytosed af GP2 + M celler. En mus Peyer patch tarm-loop-analysen kan identificere den slags kommensale eller sygdomsfremkaldende bakterier, der kan transcytosed af M celler.
Figur 1. Bedøvelse af mus under fordampes isofluran tilstand. Fordampet isofluran blev leveret af en anæstesi-dedikeret apparat (venstre side).
Figur 2. Sammenfatning af ligated Peyer patch tarm-loop-analysen. Den fluorescerende bakterieopløsning blev injiceret med en sprøjte ind i ligated Peyer patch loop på løs side af tarmen.
Figur 4. Eksempel på en mus ligated Peyer patch loop analysen med GFP-S. Typhimurium. GP2, som er rapporteret som M celle specifikke markør 5, blev farvet med anti-muse-GP2-antistof (Rød). Prøven blev observeret med en DeltaVision Restoration deconvolution mikroskop. GFP-udtrykkende S. Typhimurium blev co-lokaliseret med GP2 på den apikale plasma membran af M celle og i subapical cytoplasmatiske vesikler (pilespidser). Top, apikal udsigt. Bund og side, lateral synspunkter. Skala bar: 10 ìm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Inkubationstiden for ligated Peyer patch med bakterieopløsning er normalt for 1 time at observere den bakterielle inkorporering i M-celler. I tilfælde af 4 timer inkubation, er bakterierne ofte påvises i T-celle zone Peyerske plaques. Da fordampet isofluran inhalationskapsler narkose kunne holde mus stabil, inkubationstid på ligated Peyer patch med bakteriel suspension kan udvides til at overholde de bakterier, der flytter ind i T-celle zone i Peyer patch. Det vigtige punkt i dette eksperiment er at passe på ikke at ridse blodkar, når ligating tarmen. I tilfælde af ikke at bruge GFP-udtrykte bakterier, kunne vi alternativt bruge fluorescens-mærkede bakterier af kommercielle fluorescens mærkning reagens. Hvis reagenset muligvis hæmmer den bakterielle, som du vil bruge, tilknytning til molekyle udtrykt på M celle, skal du bruge den specifikke primære antistof, hvis den er tilgængelig, for at opdage de inkorporerede bakterier.
ontent "> Den ligated loop assay metode blev beskrevet tidligere 6, 7 Vi forbedrer nogle punkter af denne metode som følger:.. 1 Isofluran bruges som bedøvelse agent for at holde mus fast efter 2 Ca. 1 cm ligated tarm-loop herunder Peyer er.. patch er sat op. 3. Bakterier taget op af M-celler er fluorescens-mærkede ved fluorescens mærkning reagens eller ved overekspression fluorescerende protein som GFP. 4. M celler i hårsækken-associerede epitel dækker Peyer patch påvises af hel-mount immunostainig med anti GP2 antistof. 5. Fluorescerende bakteriel transcytosis af M celler observeret af konfokal mikroskopisk analyse.Vi og andre har vist, at forskellige heterogene antigener aktivt at få adgang til M celler. Betydeligt antal af patogener, herunder Salmonella spp., Shigella spp., Yersinia spp. udnytte M celler til værten invasion 8-10. Desuden coccoid form af Helicobacter pylori kan potentielt translocate ind Peyer patch via M celler, og denne translokation er afgørende for induktion af kronisk betændelse i maven 11. På den anden side er der stadig de mekanismer, hvormed disse patogener invaderer M celler at være fuldt belyst. Vi foreslår, at ligated Peyer patch loop-analysen er en passende eksperimentel metode til dissekering samspillet mellem M celler og patogener in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke alle EIB-medlemmer til at udvikle denne teknik. Denne forskning blev delvist understøttet af Grant-in-Støtte til videnskabelig forskning på prioriterede områder "Membran Traffic" (HO), og "Matrix af infektiøs Phenomena" (KH), Unge Forskere (SF og KH), og videnskabelig forskning (HO ), og videnskabelig forskning i innovative områder "Intracellulær Logistics" (HO), fra Ministeriet for Undervisning, Kultur, Sport, Videnskab og Teknologi i Japan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB Agar Ampicillin- 100 | SIGMA | L5667 | |
| Cy3 mono-Reactive Dye Pack | GE Healthcare | PA23001 | |
| Alexa Fluor 350 carboxylic acid, succinimidyl ester | Invitrogen | A10168 | |
| Inhalation anesthesia apparatus | Shinano Seisakusho | SN-487 | |
| Fixation and Permeabilization Solution | BD | 554722 | |
| Anti mouse Glycoprotein 2 antibody | MBL | D278-3 | 200-fold dilution (5μg/ml) |
| Goat Anti-Rat IgG, F(ab')2 fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 112-505-006 | 200-fold dilution (20μg/ml) |
| Alexa Fluor 633 Phalloidin | Molecular Probes | A22284 | 50-fold dilution |
| Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems | DMIRE2 | |
| DeltaVision Restoration deconvolution microscope | Applied Precision | DeltaVision Core |
References
- Fagarasan, S., Honjo, T. Intestinal IgA synthesis: regulation of front-line body defences. Nat. Rev. Immunol. 3, 63-72 (2003).
- Hapfelmeier, S. Reversible microbial colonization of germ-free mice reveals the dynamics of IgA immune responses. Science. 328, 1705-1709 (2010).
- Owen, R. L., Jones, A. L. Epithelial cell specialization within human Peyer's patches: an ultrastructural study of intestinal lymphoid follicles. Gastroenterology. 66, 189-203 (1974).
- Neutra, M. R., Mantis, N. J., Kraehenbuhl, J. P. Collaboration of epithelial cells with organized mucosal lymphoid tissues. Nat. Immunol. 2, 1004-1009 (2001).
- Hase, K. Uptake through glycoprotein 2 of FimH(+) bacteria by M cells initiates mucosal immune response. Nature. 462, 226-230 (2009).
- Punyashthiti, K., Finkelstein, R. A. Enteropathogenicity of Escherichia coli. I. Evaluation of mouse intestinal loops. Infect. Immun. 4, 473-478 (1971).
- Owen, R. L., Pierce, N. F., Apple, R. T., Cray, W. C. Jr M cell transport of Vibrio cholerae from the intestinal lumen into Peyer's patches: a mechanism for antigen sampling and for microbial transepithelial migration. J. Infect. Dis. 153, 1108-1118 (1986).
- Owen, R. L. M cells--entryways of opportunity for enteropathogens. J. Exp. Med. 180, 7-9 (1994).
- Clark, M. A., Hirst, B. H., Jepson, M. A. M-cell surface beta1 integrin expression and invasin-mediated targeting of Yersinia pseudotuberculosis to mouse Peyer's patch M cells. Infect. Immun. 66, 1237-1243 (1998).
- Jensen, V. B., Harty, J. T., Jones, B. D. Interactions of the invasive pathogens Salmonella typhimurium, Listeria monocytogenes, and Shigella flexneri with M cells and murine Peyer's patches. Infect. Immun. 66, 3758-3766 (1998).
- Nagai, S. Role of Peyer's patches in the induction of Helicobacter pylori-induced gastritis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 8971-8976 (2007).
