La aplicación de un ratón ligado Ensayo placas de Peyer asa intestinal para evaluar la absorción por las células bacterianas M

Summary

Las células M en un folículo especializada asociada a epitelio que recubre las placas de Peyer juegan un papel importante para el inmunovigilancia la mucosa en el intestino de tejido linfoide asociado. Aquí se describe el método de evaluación para transcitosis bacteriana por las células M

Abstract

El interior de nuestro intestino es habitado por gran número de bacterias comensales. La superficie de la mucosa del tracto gastrointestinal está continuamente expuesta a ellos y, ocasionalmente, a los agentes patógenos. El tejido linfoide asociado al intestino (GALT) juegan un papel clave para la inducción de la respuesta inmune de la mucosa de estos microbios ^{1, 2.} Para iniciar la respuesta inmune de la mucosa, los antígenos de la mucosa debe ser transportado desde el lumen intestinal a través de la barrera epitelial en folículos linfoides organizados, tales como las placas de Peyer. Este transcitosis antígeno está mediada por células especializadas del epitelio M ^{3, 4.} Las células M son células atípicas del epitelio que fagocitan activamente macromoléculas y los microbios. A diferencia de las células dendríticas (DC) y los macrófagos, que los antígenos objetivo de los lisosomas para la degradación de las células M, principalmente transcytose los antígenos internalizados. Este transcitosis macromoleculares vigorosa a través de las células M ofrece a los antígenos subyacente folículos linfoides organizó unad se cree que es esencial para iniciar antígenos específicos de las respuestas inmunitarias de las mucosas. Sin embargo, los mecanismos moleculares de la promoción de esta captación de antígenos por las células M son en gran parte desconocido. Hemos informado anteriormente de que la glicoproteína 2 (GP2), específicamente expresado en la membrana plasmática apical de las células M entre los enterocitos, sirve como un receptor transcytotic para un subconjunto de comensales y enterobacterias patógenas, incluyendo Escherichia coli y Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium ), mediante el reconocimiento de FimH, un componente de tipo I pili en la membrana bacteriana externa ^5. A continuación, presentamos un método para la aplicación de un ensayo de Peyer del ratón bucle parche para evaluar la absorción intestinal de bacterias por las células M. Este método es una versión mejorada del ensayo con ratones asa intestinal se ha descrito anteriormente ^{6, 7.} Los puntos de mejora son los siguientes: 1. Isoflurano fue utilizado como un agente anestésico. 2. Aproximadamente 1 cm incluyendo ligado asa intestinalING parche de Peyer se creó. 3. Las bacterias tomadas por las células M se marcaron con fluorescencia mediante reactivo de marcaje fluorescente o sobreexpresión de la proteína por fluorescentes, como la proteína verde fluorescente (GFP). 4. Las células M del epitelio folicular asociada que cubre las placas de Peyer se detectaron por todo el montaje immunostainig con anticuerpos anti GP2. 5. Fluorescentes transcitosis bacteriana por las células M fueron observados por el análisis microscópico confocal. El ensayo de Peyer del ratón parche asa intestinal puede proporcionar la respuesta qué tipo de comensales o bacterias patógenas transcytosed por las células M, y puede llevarnos a comprender el mecanismo molecular de cómo estimular el sistema inmunológico de la mucosa a través de las células M.

Protocol

1. Preparación de las células bacterianas

1. Glicerol racha surtido bacterias fluorescentes (GFP, como expresión de S. typhimurium) en una placa de agar LB que contenía 100 mg / ml de ampicilina.
2. La cultura de una sola colonia de agar LB durante la noche en 2 ml de medio LB nuevo.
3. Añadir 0,5 ml de cultivo bacteriano y 4,5 ml de medio LB e incubar nuevas hasta que la densidad óptica de 1,0 a 600 nm se alcanza.
4. Cosecha de células bacterianas por centrifugación (3.000 xg, 5 min, 4 ° C).
5. Descartar el sobrenadante y lavar dos veces con 5,0 ml de agua estéril de tampón fosfato salino (PBS).
6. Resuspender sedimento bacteriano con 5 ml de PBS, y el uso de 50 l de la suspensión que contiene aproximadamente 10 ⁷ unidades formadoras de colonias (UFC) en el inóculo.
7. En el caso de la utilización de bacterias marcados con fluorescencia, las células bacterianas fueron etiquetados por reactivo de marcaje de fluorescencia de acuerdo con el protocolo estándar.

2. Anesthesia

1. Llene una caja de plástico pequeña (10 x 10 x 5 cm) con un 5% (v / v) isoflurano vaporizado se mezcla con aire (caudal: 200 ml / min).
2. Anestesiar de ocho a dieciséis débiles de edad, los ratones macho o hembra en el cuadro.
3. Mueva el ratón a una mesa de autopsia después de la anestesia.
4. Continuamente anestesiar a los ratones en un 2% (v / v) isoflurano vaporizado se mezcla con aire (caudal: 200 ml / min) (Figura 1). Este es un procedimiento terminal.

3. Ensayo ligado placas de Peyer bucle

1. 1 cm de incisión de la piel del abdomen y luego se corta el peritoneo abdominal de un ratón anestesiado y sacar el intestino delgado que contiene la placa de Peyer.
2. Ligar el intestino con hilo de coser, teniendo cuidado de evitar los vasos sanguíneos. Nota: sólo se unen por un lado del intestino, y dejar el otro lado flojo.
3. Inyectar 50 l de suspensión bacteriana o PBS (control) con una jeringa en el bucle parche liga de Peyer en el s sueltoside del intestino (Figura 2).
4. Enlazar lado flojo, y cerrar el abdomen del ratón con un clip.
5. Después de 1 hora, quitar la liga de Peyer ciclo de parches, y la eutanasia a los ratones por dislocación cervical.
6. Peyer al consumo de parches de bucle de las placas de Peyer liga.
7. Parpadea la parte apical de las placas de Peyer por 1 ml de PBS con el uso de una jeringa conectada a una aguja para extraer el exceso de líquido mucoso y bacterias. Parpadear la placa de Peyer un plazo adicional de dos veces.

4. Tinción Todo el montaje y el análisis microscópico confocal de las placas de Peyer

1. Fijar las placas de Peyer en BD Cytofix / Cytoperm solución en hielo durante 1 hora.
2. Lavar las placas de Peyer tres veces con 1 ml de BD Perm / Wash buffer durante 5 minutos, y luego bloquear con 1 ml de tampón de bloqueo que contiene 0,1% (w / v) de saponina, un 0,2% (w / v) de BSA en PBS durante 30 minutos en hielo.
3. Añadir 200 veces diluido anti-ratón de GP2 anticuerpo monoclonal (5 mg / ml) a la muestra para detectarM células.
4. Incubar durante 2 horas a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C.
5. Lavar tres veces con 1 ml de PBS frío, se añaden después 200 veces diluido anti-rata de anticuerpos IgG conjugado con DyLight549 (20 ug / ml) a la muestra.
6. Incubar la muestra en hielo durante 2 horas.
7. Lavar tres veces con 1 ml de PBS frío, a continuación, añadir 50 veces diluido Alexa 633 faloidina conjugada con la muestra para detectar la F-actina.
8. Incubar en hielo durante 2 horas.
9. Lave suavemente con 1 ml de PBS frío. A continuación, colocar tres a cuatro piezas de la cubierta de vidrio circular en una diapositiva, e incluir las muestras en una solución de 30% de glicerol en PBS en la diapositiva (Figura 3).
10. Observar las muestras con un microscopio DM-IRE2 confocal de barrido láser o un microscopio Restauración DeltaVision deconvolución.

5. Los resultados representativos:

En el ejemplo de muestra de un ratón ligado ensayo de placas de Peyer lazo con GFP-S. Typhityphimurium fue observado con un microscopio de deconvolución DeltaVision Restauración (Figura 4). GFP-S. Typhimurium es transcytosed de GP2 ^{+ en las} células M. Un ensayo de Peyer del ratón parche asa intestinal puede identificar el tipo de bacterias comensales o patógenos que pueden ser transcytosed por las células M.

Figura 1. Anestesia de ratones en condiciones isoflurano vaporizado. Isoflurano vaporizado fue suministrada por un aparato de anestesia especial (lado izquierdo).

Figura 2. Resumen del ensayo de Peyer liga de bucle parche intestinal. La suspensión bacteriana fluorescentes se inyectó con una jeringa en el bucle parche liga de Peyer en el lado flojo del intestino.

Figura 4. Ejemplo de un ratón ligado ensayo de placas de Peyer lazo con las buenas prácticas agrarias, S. Typhimurium. GP2, que se presenta como marcador de células específicas de M ^5, se tiñeron con anticuerpos anti-ratón GP2 (rojo). La muestra se observa con un microscopio deconvolución DeltaVision Restauración. Que expresan GFP S. Typhimurium fue co-localizada con la GP2 en la membrana plasmática apical de las células M y en las vesículas citoplasmáticas subapical (puntas de flecha). Vista superior, apical. Fondo y laterales, puntos de vista lateral. Barra de escala: 10 micras.

Discussion

El tiempo de incubación de parches de Peyer ligado con la suspensión bacteriana suele ser de 1 hora para observar la incorporación de bacterias en las células M. En el caso de cuatro horas de incubación, las bacterias a menudo se detectan en la zona de las células T de las placas de Peyer. A medida que la anestesia con isoflurano vaporizado inhalantes podría mantener estables los ratones, el tiempo de incubación de las placas de Peyer ligado con la suspensión bacteriana se puede ampliar para observar las bacterias que se mueven en las células T en la zona de las placas de Peyer. El punto importante de este experimento es tener cuidado de no rayar la ligadura de los vasos sanguíneos cuando el intestino. En el caso de no utilizar las buenas prácticas agrarias-expresaron las bacterias, que alternativamente podrían utilizar bacterias marcados con fluorescencia por reactivo comercial etiquetado de fluorescencia. Si el reactivo posiblemente inhibe la bacteriana, que desea utilizar, el apego a la molécula expresada en células M, se debe utilizar el anticuerpo primario específico, si está disponible, para detectar la bacteria incorporada.

CONTENIDO "> El método de lazo ensayo de liga se ha descrito anteriormente ^{6, 7} Nos mejorar algunos puntos de este método de la siguiente manera:.. 1 El isoflurano se utiliza como un agente anestésico para mantener a los ratones constante 2 aproximadamente 1 cm ligado asa intestinal incluyendo Peyer.. el parche se instala. 3. bacterias tomadas por las células M son marcados con fluorescencia mediante reactivo de marcaje de fluorescencia o la proteína que sobreexpresan fluorescentes, como las buenas prácticas agrarias. 4. células M del epitelio folicular asociada que cubre las placas de Peyer son detectados por todo el montaje immunostainig con anticuerpos anti GP2. 5. transcitosis fluorescente de bacterias por las células M son observados por el análisis microscópico confocal.

Nosotros y otros han demostrado que diversos antígenos heterogéneo activamente entrar en las células M. Un número considerable de agentes patógenos como Salmonella spp., Shigella spp., Yersinia spp. explotar las células M de ^8.10 la invasión del huésped. Además, la forma de cocos Helicobacter pylori potencialmente puede trasladar en las placas de Peyer a través de las células M, y este desplazamiento es esencial para la inducción de la inflamación crónica en el estómago ^11. Por otro lado, los mecanismos por los cuales estos agentes patógenos invaden células M aún no se han aclarado completamente. Sugerimos que el ensayo de Peyer del parche liga bucle es un método experimental apropiado para la disección de la interacción entre las células M y agentes patógenos en vivo.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
LB Agar Ampicillin- 100	SIGMA	L5667
Cy3 mono-Reactive Dye Pack	GE Healthcare	PA23001
Alexa Fluor 350 carboxylic acid, succinimidyl ester	Invitrogen	A10168
Inhalation anesthesia apparatus	Shinano Seisakusho	SN-487
Fixation and Permeabilization Solution	BD	554722
Anti mouse Glycoprotein 2 antibody	MBL	D278-3	200-fold dilution (5μg/ml)
Goat Anti-Rat IgG, F(ab')2 fragment specific	Jackson ImmunoResearch	112-505-006	200-fold dilution (20μg/ml)
Alexa Fluor 633 Phalloidin	Molecular Probes	A22284	50-fold dilution
Confocal laser scanning microscope	Leica Microsystems	DMIRE2
DeltaVision Restoration deconvolution microscope	Applied Precision	DeltaVision Core