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मॉनिटरिंग शाही सेना संरचना में 'Peroxidative' और 'ऑक्सीडेटिव' हाइड्रॉक्सिल कट्टरपंथी footprinting द्वारा संतुलन परिवर्तन

Published: October 17, 2011 doi: 10.3791/3244
Automatic Translation
*1, *2, 2, 2, 2
1Department of Chemistry, Hunter College, 2Department of Biochemistry, Albert Einstein College of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे मात्रा ठहराना करने के लिए (द्वितीय) मिलीग्राम निर्भर हाइड्रॉक्सिल कट्टरपंथी footprinting की दो विधियों द्वारा शाही सेना तृतीयक संरचना के गठन.

Abstract

शाही सेना अणु जीव विज्ञान में एक आवश्यक भूमिका निभाते हैं. आनुवांशिक जानकारी संचारण के अलावा, शाही सेना अद्वितीय तृतीयक नियामक, बांधने की मशीन, या उत्प्रेरक के रूप में एक विशिष्ट भूमिका जीवविज्ञान पूरा संरचनाओं में गुना कर सकते हैं. तृतीयक संपर्क गठन के बारे में सूचना शाही सेना अणु के समारोह को समझने के लिए आवश्यक है. हाइड्रॉक्सिल कण (OH •) में अपने उच्च जेट और छोटे आकार के कारण न्यूक्लिक एसिड की संरचना का अनूठा जांच कर रहे हैं 1. जब एक footprinting जांच के रूप में इस्तेमाल किया, हाइड्रॉक्सिल कण के साथ 1 डीएनए और आरएनए 2 के phosphodiester रीढ़ की विलायक सुलभ सतह नक्शा के रूप में एकल nucleotide संकल्प के रूप में ठीक है. हाइड्रॉक्सिल कट्टरपंथी footprinting के लिए एक intermolecular संपर्क सतह के भीतर है, जैसे 1 डीएनए प्रोटीन और आरएनए प्रोटीन परिसरों में nucleotides की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. 3 संतुलन और संक्रमण 4 गतिज soluti के एक समारोह के रूप में हाइड्रॉक्सिल कट्टरपंथी footprinting आयोजन द्वारा निर्धारित किया जा सकता है हैपर चर या समय क्रमशः. Footprinting की एक प्रमुख विशेषता है कि जांच करने के लिए सीमित जोखिम (जैसे, 'एकल मारा कैनेटीक्स) बहुलक के प्रत्येक nucleotide की वर्दी नमूना में परिणाम है 5 .

इस वीडियो लेख में, हम P4-P6 Tetrahymena ribozyme के डोमेन का उपयोग करने के लिए शाही सेना नमूना तैयार करने और मिलीग्राम (द्वितीय) मध्यस्थता तह isotherms का निर्धारण वर्णन. हम अच्छी तरह से जाना जाता हाइड्रॉक्सिल कट्टरपंथी footprinting प्रोटोकॉल है कि एच 2 2 हे (हम peroxidative 'प्रोटोकॉल कहते) और एक मूल्यवान है, लेकिन व्यापक रूप से नहीं जाना जाता विकल्प है, कि का उपयोग करता है स्वाभाविक रूप से भंग 2 हे है ( हम फोन की आवश्यकता का उपयोग का वर्णन इस ' 'oxidative प्रोटोकॉल). डेटा कमी, परिवर्तन और विश्लेषण की प्रक्रिया के एक सिंहावलोकन प्रस्तुत किया है.

Protocol

1. Footprinting अभिकर्मकों की तैयारी

  1. एक 10x प्रतिक्रिया बफर 100 मिमी सोडियम cacodylate, 1 मिमी EDTA, और 1 एम KCl युक्त तैयार. 7.4 पीएच को समायोजित करें. फ़िल्टर बफर 0.2 सुक्ष्ममापी एसीटेट फिल्टर डिवाइस (Nalgene) का उपयोग. टिप्पणी: pipet शाही सेना सीधे 10x बफर में नहीं है.
  2. प्रत्येक के रूप में तालिका 1 में संकेत दिया प्रतिक्रिया के लिए अनुमापन प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करें. अनुमापन मिश्रण की मात्रा (1x बफर और मिलीग्राम वांछित एकाग्रता में (द्वितीय)) 90 μl 1x बफर में शाही सेना के 10μl जोड़ने से पहले किया जाना चाहिए.
  3. RNase T1 पाचन 6.63M यूरिया, 20mm सोडियम साइट्रेट, 1mm EDTA, 0.25 μg / μl tRNA, 0.025% xylene cyanol, और 0.025% bromphenol नीले युक्त बफर तैयार. इस बफर 4 ° C पर संग्रहीत किया जा सकता है 6 महीने के लिए.
  4. Fenton प्रतिक्रिया 250 मिमी Fe (राष्ट्रीय राजमार्ग 4) 2 (अतः 4) 2, 250 मिमी EDTA, और 500 मिमी एल एस्कॉर्बेट सोडियम के हौसले से तैयार जलीय समाधान की आवश्यकता है. सांद्रता 1 अध्याय में उल्लेख किया0.5 बफर में सोडियम cacodylate के रूप में संतुलन प्रयोगों है कि कण और विविध द्विसंयोजक आयन सांद्रता मांजना नहीं करता है के लिए इष्टतम कर रहे हैं.
  5. Peroxidative (1.5.1) और oxidative (1.5.2) footprinting प्रतिक्रिया के लिए अभिकर्मकों.
    1. peroxidative Fenton प्रतिक्रिया 100 मिमी Fe-EDTA समाधान है, और 50 मिमी सोडियम एल एस्कॉर्बेट और 1.5% एच 2 हे 2 के हौसले से तैयार जलीय समाधान की आवश्यकता है. Fe-EDTA समाधान मिश्रण Fe (राष्ट्रीय राजमार्ग 4) 2 (अतः 4) 2 द्वारा EDTA के साथ तैयार किया जाता है 1.1 बार लोहे के अधिक EDTA से अधिक है.
    2. बस oxidative दरार प्रतिक्रिया (3.4.2) की शुरुआत से पहले, Fe के 2 μl (राष्ट्रीय राजमार्ग 4) 2 (अतः 4) 2 (250 मिमी), EDTA के 2.2 μl (250 मिमी), 62.5 μl संयोजन द्वारा Fenton प्रतिक्रिया मिश्रण बनाने के लिए एल एस्कॉर्बेट सोडियम (500 मिमी), 22.5 μl 10x प्रतिक्रिया बफर और एच 2 हे 135.5 μl 0 के footprinting प्रतिक्रिया मिश्रण (3.4.2) में अंतिम सांद्रता तक पहुँचने .10 मिमी, .11 मिमी, और 6.61 मिमी क्रमशः.

2. Footprinting प्रयोग के लिए शाही सेना तैयार

  1. शाही सेना डीएनए 6 टेम्पलेट्स के इन विट्रो प्रतिलेखन में मानक के द्वारा उत्पादित किया जा सकता है है या, यदि कम की तुलना में 50 nucleotides (एकीकृत डीएनए टेक्नोलॉजीज, www.idtdna.com पर जैसे) खरीदा जा. की सिफारिश की प्रयोगशाला सफाई प्रक्रियाओं का पालन करें footprinting प्रयोगों के दौरान शाही सेना के नमूना अखंडता बनाए रखने के 7.
  2. इन विट्रो लिखित शाही सेना में 8 Dephosphorylation पहले शाही सेना के 5 'के अंत में 32 पी लेबलिंग के लिए आवश्यक है . शाही सेना की 10 pmol kinasing द्वारा अंत लेबल 9 समाधान फॉस्फेट के सफल निष्क्रियता के बाद बादल होना चाहिए. .
  3. Radioactively लेबल denaturing जेल वैद्युतकणसंचलन का उपयोग शाही सेना शुद्ध. शाही सेना के दो बाद जेल 0.3 एम सोडियम एसीटेट (5.5 पीएच) का उपयोग extractions के द्वारा बरामद किया है. आरएनए 1 मिलीलीटर इथेनॉल और बाद के साथ 0.5 मिलीग्राम जलीय घोल के मिश्रण से उपजी हैसूखी बर्फ पर 1 मिनट के लिए ऊष्मायन. 4 डिग्री सेल्सियस, 0.5 घंटा के लिए 12,500 rpm पर नमूना स्पिन. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 70% इथेनॉल के साथ शाही सेना गोली धोने. अतिरिक्त centrifugation के बाद सतह पर तैरनेवाला निकालें और निर्वात में गोली सूखी.
  4. भंग 1x एक प्रतिक्रिया ट्यूब में शाही सेना समाधान, इथेनॉल और निर्वात में सूखी शाही सेना के साथ वेग के Buffer.Pipet μl 30 के 330 उल में 32 पी लेबल शाही सेना के नमूने, संदर्भ सीढ़ी (3.5 कदम) पैदा करने के लिए इस ट्यूब रखना . बफर हीटिंग द्वारा 95 आरएनए समाधान ° सी 2 मिनट के लिए denature. 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान के नमूने कूल और नीचे ट्यूबों के समाधान में वापस lids पर condensates लाने के लिए एक त्वरित स्पिन दे.

3. Footprinting प्रयोग

  1. वैद्युतकणसंचलन कंघी विश्लेषणात्मक जेल प्रति डेटा बिंदुओं की अधिकतम संख्या निर्धारित करता है. हम एक 30 अच्छी तरह कंघी का उपयोग करें. संदर्भ सीढ़ी 2 कुओं और uncleaved नियंत्रण एक रह रहे हैं. 27 प्रतिक्रिया ट्यूबों तैयार. अंतिम (द्वितीय) मिलीग्राम concentrations समान रूप से एक लॉगरिदमिक अनुमापन मध्य के आसपास परिमाण के आदेश फैले पैमाने पर दूरी होना चाहिए.
  2. उधर 5 मिनट के लिए शाही सेना और मिलीग्राम समाधान (द्वितीय) 50 डिग्री सेल्सियस सेते हैं. मिलीग्राम की इसी राशि 1x बफर में (द्वितीय) के 90 μl के साथ शाही सेना के समाधान के 10 μl मिक्स 100 μl के अंतिम मात्रा तक पहुँचने के लिए. 50 पर 30 मिनट के लिए समाधान सेते डिग्री सेल्सियस
  3. चलो समाधान 25 में ° 1 घंटे के लिए सी को संतुलित करना जबकि तह होता है.
  4. (3.4.1) Peroxidative या oxidative (3.4.2) हाइड्रॉक्सिल कट्टरपंथी footprinting प्रतिक्रिया.
    1. 2 μl Fe EDTA (100 मिमी) की बूंदों रखकर peroxidative प्रतिक्रिया प्रारंभ, 2 μl एल एस्कॉर्बेट सोडियम (50 मिमी) और 2 μl एच 2 2 हे (1.5%) प्रतिक्रिया के शीर्ष के अंदर पर एक दूसरे से अलग ट्यूब आरएनए समाधान युक्त और जोरदार मिश्रण द्वारा footprinting रिएक्शन शुरू. 300 μl ठंड निरपेक्ष इथेनॉल जोड़कर 15 सेकंड के बाद प्रतिक्रिया बंद करो. ट्यूब 3-5 बार मुड़ें. वेग, और धोनेगोली के रूप में 2.4 चरण में सूखी.
    2. हौसले से तैयार Fenton प्रतिक्रिया मिश्रण (1.6) के 5 μl जोड़कर oxidative हाइड्रॉक्सिल कट्टरपंथी footprintingreaction शुरू करो. 25 पर 30 मिनट के लिए सेते डिग्री सेल्सियस प्रतिक्रिया और ट्यूबों 3-5 बार बदल कर मिश्रण बुझाने ठंड निरपेक्ष इथेनॉल 300 μl जोड़ें. वेग धोने, और सूखी गोली के रूप में 2.4 चरण में संकेत दिया.
  5. मानक 10 प्रक्रियाओं 1.3 चरण में तैयार समाधान का उपयोग करने के लिए अनुसार एक RNase T1 पचाने में संदर्भ नमूना उत्पन्न करता है.
  6. 8 μl जेल लोड हो रहा डाई (AMBION) द्वितीय और की पुष्टि शाही सेना में शाही सेना छर्रों भंग Geiger काउंटर का उपयोग करके resuspended है.
  7. 11. लोड नमूने दो संदर्भों और एक नियंत्रण सहित मानक प्रोटोकॉल के अनुसार एक denaturing, 8% polyacrylamide अनुक्रमण जेल तैयार करें. 60 डब्ल्यू पर अलग शाही सेना के टुकड़े - 2.5 घंटा के लिए 75 डब्ल्यू. एक भंडारण फॉस्फर स्क्रीन रातोंरात सूख जेल बेनकाब. स्कैन फॉस्फर स्क्रीन filmless autoradiography, जैसे के लिए एक इमेजिंग प्रणाली के साथ. तूफान (जीई हेल्थकेयर) 865 या आंधी (जीई हेल्थकेयर). आपके कंप्यूटर को जेल छवि फ़ाइल स्थानांतरण.

4. डेटा विश्लेषण

  1. एक nucleotide के हाइड्रॉक्सिल कट्टरपंथी जेट विश्लेषणात्मक जेल पर प्रत्येक बैंड की तीव्रता बढ़ाता द्वारा निर्धारित किया जाता है. डाउनलोड, स्थापित है, और खुला साफा, एक एकल बैंड फिटिंग और मात्रा का ठहराव के लिए खुला स्रोत सॉफ़्टवेयर का उपयोग करने के लिए आसान के 12, 13 उपयोगकर्ता पुस्तिका निर्देशों का पालन करें. संक्षेप में, शाही सेना के अनुक्रम के रूप में txt फ़ाइल लोड जेल. फ़ाइल के रूप में जेल तस्वीर द्वारा पीछा किया. बैंड तीव्रता समायोजित, गलियों को परिभाषित, एक लंगर लेन चुनें, और एक जेल संरेखण प्रदर्शन. बैंड के nucleotides असाइनमेंट RNase T1 पाचन सीढ़ी के संदर्भ में होता है. बैंड integrals यों और सामान्य / colorplot सुविधा का उपयोग करने के लिए सामान्य और संभावित अपरिवर्तनीय अवशेषों आवंटित. एक txt फ़ाइल के रूप में उत्पादन सहेजें.
  2. साफा एक जेल पर गलियों और पंक्तियों में प्रतिनिधित्व का प्रतिनिधित्व स्तंभों से युक्त स्प्रेडशीट outputs केव्यक्तिगत शाही सेना टुकड़ा करने के लिए इसी बैंड के बैंड घनत्व tegrated. सबसे पहले, संरक्षण साइटों जो सुरक्षा अंत बिंदु मिलीग्राम (द्वितीय) एकाग्रता (हमारे उदाहरण में 50 मिमी) के प्रोफ़ाइल के साथ कोई मिलीग्राम नमूना (द्वितीय) से व्युत्पन्न प्रोफ़ाइल की तुलना द्वारा विलायक पहुँच में एक महत्त्वपूर्ण बदलाव प्रदर्शित की पहचान. कम मूल्य, अधिक सुरक्षित nucleotide के हाइड्रॉक्सिल कण और इसके विपरीत से हमले के खिलाफ है.
  3. व्यक्ति या मिलीग्राम एकाग्रता (द्वितीय) बनाम nucleotides के समूहों के सामान्यीकृत बैंड integrals से तह isotherms बनाएँ. - isotherms व्यक्तिगत इंटरनेट = + एल (एल यू) द्वारा भिन्नात्मक संतृप्ति के लिए बढ़ाया वाई जहां च बैंड के एकीकृत घनत्व (ओं) अर्थ विश्लेषण किया जा रहा है, एल और यू संक्रमण निचले और ऊपरी सीमा का प्रतिनिधित्व करते हैं और वाई भिन्नात्मक संतृप्ति 14 डेटा फिट एक गैर रेखीय एल का उपयोग कर रहे हैं.पूर्व वर्ग विश्लेषण हिल समीकरण (1) कार्यक्रम (हम या तो (OriginLab) उत्पत्ति या GraphPad (GraphPad सॉफ्टवेयर, Inc) का उपयोग करें.)
    1 समीकरण
    जहां कश्मीर घ संतुलन है पृथक्करण निरंतर, [एम] चर कि तह प्रतिक्रिया mediates, मिलीग्राम (द्वितीय) के इस उदाहरण में की एकाग्रता से मेल खाती है है, और पता एच हिल गुणांक है. यह प्रक्रिया भिन्नात्मक संतृप्ति करने के लिए संक्रमण तराजू, इसके मध्य निर्धारित करता है और कि क्या एक संक्रमण sigmoidal है phenomenological परीक्षण प्रदान करता है. अनुक्रमण (चित्रा 3A) जैल कि साफा (3B चित्रा) द्वारा विश्लेषण किया गया और फिट के रूप में ऊपर वर्णित से व्युत्पन्न isotherms चित्र 3C में दिखाए जाते हैं. भिन्नात्मक संतृप्ति 3 चित्र में दिखाया isotherms एक स्प्रेडशीट में स्केलिंग द्वारा उत्पन्न किया गया है सबसे अच्छा फिट ऊपरी और निचले सीमा (यू और एल) समीकरण अंश का उपयोग कर के खिलाफ साफा द्वारा उत्पन्न मान = / मूल्य (यू - एल) - एल / (यू - एल).

5. प्रतिनिधि परिणाम:

चित्रा 3 P4-P6 • OH footprinting प्रयोगों शाही सेना से प्रतिनिधि परिणाम से पता चलता है. जेल छवि (बाएं) इंगित करता है कि एक) पृष्ठभूमि दरार कम है (सही लेन), ख) एकल nucleotide असाइनमेंट T1 लेन (RNase प्रत्येक जी T1 cleaves) में अच्छी तरह से परिभाषित बैंड के कारण संभव है, और ग) हाइड्रॉक्सिल कट्टरपंथी शाही सेना के विखंडन प्रेरित पृष्ठभूमि अच्छी तरह से ऊपर है. उच्च मिलीग्राम (द्वितीय) के लिए कम से संक्रमण व्यक्तिगत और शाही सेना तृतीयक संरचना के गठन का संकेत बैंड के समूहों के एकीकृत बैंड घनत्व कम के साथ संबद्ध है. एकल या सन्निहित nucleotide दरार जिसका परिवर्तन समन्वित रूप से एक 'सुरक्षा' के रूप में संदर्भित कर रहे हैं समूहों. • OH मिलीग्राम (द्वितीय) की विशेषता सुरक्षा P4-P6 शाही सेना की तह मध्यस्थता बारीकी से अपनी क्रिस्टल संरचना में मनाया अणु की विलायक दुर्गम क्षेत्रों के अनुरूप 15 .

तह आरएनए अणुओं ग एक तृतीयक संपर्क संरक्षण है कि स्पष्ट संरचनात्मक या गतिशील घटना के साथ सहसंबद्ध नहीं है बहुत अलग extents (यानी, पृष्ठभूमि करने के लिए कैसे बैंड घनत्व गिरावट बंद) है. इस प्रकार, कुछ शाही सेना अणु अच्छी तरह से परिभाषित संरचनात्मक बदलाव दिखाने के लिए, के रूप में 3 चित्र में दिखाया गया है, और कुछ नहीं होगा. बैंड तीव्रता मात्रा और साफा 12 विश्लेषण (3B चित्रा) द्वारा सामान्यीकृत. उत्पादन में एक 'थर्मल • OH के खिलाफ संरक्षण के रिश्तेदार डिग्री visualizing साजिश है. रंग संक्रमण मिलीग्राम अलावा (द्वितीय) पर पहुंच परिवर्तन का वर्णन करता है. लाल या नीले रंग के और अधिक सुलभ या अधिक संरक्षित nucleotides से पता चलता है, क्रमशः के लिए व्हाइट. छायांकन के प्रत्येक डिग्री एक संख्यात्मक मूल्य है जो एक सुरक्षा वक्र (चित्र -3 सी) के रूप में प्लॉट किया जा सकता है और एक बाध्यकारी हिल समीकरण (1) जैसे मॉडल के आधार पर विश्लेषण किया के साथ संबद्ध है. संतुलन पृथक्करण स्थिरांक संरक्षण 153-155 के साथ संबद्ध मोटे तौर पर दो बार है कि 163-164 संरक्षण की इसी मूल्य के.

"ontent> चित्रा 1
चित्रा 1 हाइड्रॉक्सिल कट्टरपंथी उत्पादन और P4-P6 शाही सेना तह. ए) Fe (द्वितीय) हाइड्रोजन पेरोक्साइड से हाइड्रॉक्सिल कण की पीढ़ी catalyzes. लौह लोहे को एस्कॉर्बेट Fe वापस (iii) कम कर देता है. बी) मिलीग्राम (द्वितीय) के अभाव में कोई P4-P6 तृतीयक संरचना का गठन किया है, हाइड्रॉक्सिल कण घुसना और फोड़ना सभी सुलभ रीढ़ पदों की अनुमति. मिलीग्राम (द्वितीय) के अलावा P4-P6 की तह शुरू की, अनुमति केवल विलायक सुलभ रीढ़ हाइड्रॉक्सिल कण द्वारा cleaved.

चित्रा 2
चित्रा 2 एक हाइड्रॉक्सिल कट्टरपंथी footprinting प्रयोग के लिए बाह्यरेखा. ए) Dephophorylation और शाही सेना के 32 पी 5'-अंत लेबलिंग. बी) 32 के शोधन एक denaturing polyacrylamide जेल पर शाही सेना पी लेबल . सी) शाही सेना के बैंड के छांटना, बाद में शाही सेना के निष्कर्षण, और इथेनॉल वर्षण. डी) Prefolding औरशाही सेना की तह. ई) हौसले से तैयार Fenton प्रतिक्रिया मिश्रण के अतिरिक्त हाइड्रॉक्सिल कण उत्पन्न करने के लिए. एफ) शाही सेना polyacrylamide जेल वैद्युतकणसंचलन denaturing द्वारा टुकड़ा जुदाई. जी) साफा सॉफ्टवेयर द्वारा शाही सेना टुकड़ों के quantitation.

चित्रा 3
चित्रा 3 शाही सेना के टुकड़े के peroxidative Fenton footprinting प्रतिक्रिया के बाद विश्लेषण. (ए) शाही सेना हाइड्रॉक्सिल कण को ​​उजागर किया गया था और दरार उत्पादों denaturing polyacrylamide जेल वैद्युतकणसंचलन (पृष्ठ) का उपयोग कर सुलझाया गया. तस्वीर मिलीग्राम की बढ़ती एकाग्रता (द्वितीय) के साथ peroxidative दरार उत्पादों से पता चलता है. संदर्भ और नियंत्रण गलियों में चिह्नित कर रहे हैं. यह छवि फ़ाइल साफा प्रोग्राम है जो प्रत्येक बैंड की मात्रा quantitates के लिए इनपुट है. (बी) 'थर्मल' साजिश साफा द्वारा उत्पन्न. (सी) साफा से nucleotide संख्या उत्पादन के लिए एकीकृत बैंड घनत्व संबंधित मूल्यों के एक स्प्रेडशीट ऐसे हिल equati के रूप में एक बंधन मॉडल के आधार पर विश्लेषण किया है(1). सुरक्षा के क्षेत्र बैंड मिलीग्राम एकाग्रता (द्वितीय) के एक समारोह के रूप में अभिन्न घनत्व में वृद्धि के अनुसार चुने गए हैं. कश्मीर घ मिलीग्राम (द्वितीय) एकाग्रता, जिस पर शाही सेना के आधे से नजर रखी जा रही साइट पर जोड़ रहा है . हिल गुणांक, n, एच, जो बाध्यकारी cooperativity पर जानकारी देता है और इस विशेष साइट के तह में शामिल मैग्नीशियम आयनों की संख्या के लिए एक कम अनुमान प्रदान करती है वक्र की ढलान के एक उपाय है.

तालिका 1
तालिका 1. आरएनए नमूने युक्त विभिन्न मिलीग्राम सांद्रता (द्वितीय) पैदा करने के लिए प्रतिनिधि संस्करणों.

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Discussion

हाइड्रॉक्सिल कट्टरपंथी footprinting nucleic एसिड की सॉल्वैंट सुलभ सतह क्षेत्र का आकलन करने के लिए एक मूल्यवान उपकरण है. तृतीयक 14 संरचना के गुणात्मक और मात्रात्मक गठन आयन प्रकार और एकाग्रता, पीएच, तापमान, बंधनकारी प्रोटीन या तह सह कारकों जैसे मानकों के एक समारोह के रूप में पीछा किया जा सकता है. एक सीधे आगे और सस्ती प्रोटोकॉल और जिसके परिणामस्वरूप विलायक पहुँच और एक एकल nucleotide स्तर पर तह जानकारी के सम्मोहक संयोजन इस विधि बहुत ही आकर्षक बनाता है. परंपरागत • OH footprinting प्रतिक्रिया एच 2 2 हे, एक प्रोटोकॉल हम 'peroxidative' (चित्रा 1 ए) के रूप को देखें जोडी का उपयोग किया जाता है . वैकल्पिक ('oxidative') 17 प्रोटोकॉल है कि हम उजागर स्वाभाविक रूप से 2 हे भंग का इस्तेमाल करने के लिए प्रतिक्रियाओं के माध्यम से हाइड्रोजन पेरोक्साइड के छोटे मात्रा में उत्पादन
2 समीकरण

दोनों तरीकों जीई• Fe के ऑक्सीकरण (द्वितीय) एच 2 2 हे (चित्रा 1 ए) द्वारा Fe (तृतीय) के माध्यम से OH nerate. व्यक्तिगत वरीयता निर्धारित करने के लिए जो प्रोटोकॉल संरचनात्मक मानचित्रण और संतुलन अनुमापन प्रयोगों के लिए हमारी प्रयोगशाला के सदस्यों द्वारा प्रयोग किया जाता है लगता है. oxidative और peroxidative footprinting प्रतिक्रियाओं के बारे में 30 और 1 मिनट, क्रमशः ले. इस नुकसान oxidative थोड़ा सरल किया जा रहा प्रोटोकॉल (एक कम अभिकर्मक जोड़ा जाता है) और oxidative electrophoretic बैंड प्रोफाइल पर crispness 'द्वारा ऑफसेट है. हालांकि इस अवलोकन • OH दरार उत्पादों में कम विविधता का पता चलता है, इस परिकल्पना का परीक्षण नहीं किया गया है. हम oxidative प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए footprinting (15) नमूने या नमूने है कि एच 2 हे 2 संवेदनशील घटकों होते की एक बड़ी संख्या का विश्लेषण करने की सलाह देते हैं.

Fe के नकारात्मक आरोप लगाया EDTA जटिल (द्वितीय) (चित्रा 1 ए) का उपयोग नकारात्मक आरोप लगाया न्यूक्लिक के फॉस्फेट रीढ़ के साथ Fe (द्वितीय) के सहयोग से रोकताएसिड 1 फ्री Fe (द्वितीय) एक तेज़ और / या शाही सेना रीढ़ की hydrolysis को उत्प्रेरित कर सकते हैं के रूप में डीएनए और आरएनए और कार्य करने के लिए बाध्य कर सकते हैं.

Fenton अभिकर्मकों प्रस्तुत सांद्रता फोड़ना एकल हिट कैनेटीक्स संकेत बफर में footprinting के लिए आवश्यक शर्तों के तहत P4-P6 शाही सेना के लिए आदर्श होते हैं. एकल हिट कैनेटीक्स सुनिश्चित करें कि केवल एक बार शाही सेना अणु औसत पर cleaved है 18 यदि Fenton अभिकर्मक के एक अत्यधिक मात्रा प्रयोग किया जाता है, शाही सेना उत्पादों को एक से अधिक दरार की घटना से पैदा कर सकते हैं .. यह छोटी दरार उत्पादों की ओर टुकड़ा वितरण biases. कट्टरपंथी दरार की हद तक समायोजित किया जा ~ ताकि अंत लेबल शाही सेना के 20% cleaved है और ~ अंत लेबल शाही सेना के 80% बरकरार चाहिए. खुराक - प्रतिक्रिया प्रयोगों के लिए एक अन्वेषक के अध्ययन के समाधान की शर्तों के तहत एकल हिट कैनेटीक्स प्राप्त करने के लिए उचित (द्वितीय) Fe / 2 एच ओ 2 सांद्रता को पहचानने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए. 19

relative विलायक पहुँच • OH footprinting विश्लेषण से प्राप्त नक्शे अकेले इस्तेमाल किया जा सकता शाही सेना संरचना, तह और मध्यवर्ती संतुलन तह प्रयोगों के दौरान गठित संरचनाओं विशेषताएँ. इन आंकड़ों वैश्विक रचना में परिवर्तन 7, 20 और / या एंजाइमी और रासायनिक footprinting अध्ययन 21 जो समान शर्तों के तहत उत्पन्न थे को संबोधित तकनीक से परिणाम के साथ संयुक्त किया जा सकता है . आरएनए 22 संरचनाओं के भोंडा मॉडल हाइड्रॉक्सिल कट्टरपंथी और पूरक रासायनिक और बाधाओं के रूप में enzymatic footprinting प्रोफाइल का उपयोग कर विकसित किया जा सकता है.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

यह काम स्वास्थ्य RO1 - GM085130 के राष्ट्रीय संस्थान और राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन MCB0929394 से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था. हम उसे आतिथ्य के लिए और फिल्म के लिए हमें उसे प्रयोगशाला में अनुमति देने के लिए डॉ. मैरियन श्मिट धन्यवाद.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Name Company Cat#
Sodium Cacodylate(Caution! Toxic) Sigma-Aldrich C4945-25g
EDTA (0.5 M) Ambion AM9260G
DEPC treated water Ambion AM9915G
Sodium Acetate (3 M) Ambion AM9740
MgCl2 (1 M) Ambion AM9530G
Urea Ambion AM9902
Sodium Citrate Sigma-Aldrich W302600
tRNA Sigma-Aldrich R-7876
Sodium-L-ascorbate Sigma-Aldrich A7631-25g
Fe(NH4)2(SO4)2 . 6 H2O Sigma-Aldrich F1543-500g
RNase T1 Fermentas EN0541
Hydrogen Peroxide (30%) Sigma-Aldrich 349887

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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आण्विक जीवविज्ञान 56 अंक हाइड्रॉक्सिल कट्टरपंथी footprinting, शाही सेना Fenton संतुलन
मॉनिटरिंग शाही सेना संरचना में 'Peroxidative' और 'ऑक्सीडेटिव' हाइड्रॉक्सिल कट्टरपंथी footprinting द्वारा संतुलन परिवर्तन
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Bachu, R., Padlan, F. S.,… More

Bachu, R., Padlan, F. S., Rouhanifard, S., Brenowitz, M., Schlatterer, J. C. Monitoring Equilibrium Changes in RNA Structure by 'Peroxidative' and 'Oxidative' Hydroxyl Radical Footprinting. J. Vis. Exp. (56), e3244, doi:10.3791/3244 (2011).

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