Summary
La previsione del corecettore utilizzo di HIV-1 è necessaria per la somministrazione di una nuova classe di farmaci antiretrovirali, antagonisti corecettore cioè. Può essere effettuata mediante analisi di sequenza del
Abstract
Maraviroc (MVC) è il primo farmaco autorizzato antiretrovirale della classe degli antagonisti corecettore. Si lega all'host corecettore CCR5, utilizzato dalla maggior parte dei ceppi di HIV per infettare le cellule immunitarie umane (Fig. 1). Altri isolati di HIV utilizzare un corecettore diverso, il CXCR4. Recettore che viene utilizzato, è determinato il virus dalla proteina Env (Fig. 2). A seconda del corecettore utilizzato, i virus sono classificati come R5 o X4, rispettivamente. MVC lega al recettore CCR5 inibendo l'ingresso di virus R5 nella cellula bersaglio. Durante il corso della malattia, virus X4 possono emergere e diventare troppo i virus R5. Determinazione di utilizzo co-recettore (chiamato anche tropismo) è quindi obbligatoria prima della somministrazione di MVC, come richiesto da EMA e FDA.
Gli studi di efficienza MVC MOTIVATE, MERIT e il 1029 sono stati eseguiti con il test Trofile da Monogram, San Francisco, USA Si tratta di un saggio di alta qualità sulla base di Sophisticated test ricombinanti. L'accettazione di questo test per la routine quotidiana è piuttosto bassa al di fuori degli Stati Uniti, dal momento che i medici europei piuttosto tendono a lavorare con laboratori decentrati esperti, che prevedono prove di resistenza concomitante. Questi laboratori sono stati sottoposti a diverse valutazioni di garanzia della qualità, l'ultimo viene presentato nel 2011 1.
Da diversi anni, abbiamo eseguito le determinazioni tropismo sulla base di analisi di sequenza della regione V3 env-HIV gene (V3) 2. Questa regione trasporta informazioni sufficienti per effettuare una stima affidabile. La determinazione genotipica di utilizzo corecettore presenta vantaggi quali: tempo di rotazione più breve (equivalente a test di resistenza), riduzione dei costi, possibilità di adattare i risultati alle esigenze dei pazienti e la possibilità di analizzare i campioni clinici con molto basso o addirittura carica virale non rilevabile (VL ), tanto più che il numero di campioni analizzati con VL <1000 copie / mLapprossimativamente aumentata negli ultimi anni (Fig. 3).
I passi principali per i test tropismo (Fig. 4) hanno dimostrato in questo video:
1. Raccolta di un campione di sangue
2. L'isolamento del RNA dell'HIV dalla / o plasma e DNA provirale HIV dalle cellule mononucleate del sangue
3. Amplificazione della regione env
4. Amplificazione della regione V3
5. Reazione Sequenza dell'amplicone V3
6. Purificazione dei campioni di sequenziamento
7. Sequenziamento dei campioni purificati
8. Sequenza di montaggio
9. Sequencing interpretazione dei dati e la previsione tropismo
Protocol
Il protocollo è riassunto in fig. 4.
1. Raccolta di campioni di sangue
- Raccogliere almeno 3 ml di sangue in EDTA al sito clinico.
- I campioni possono essere conservati fino ad una settimana a 4 ° C.
- Inviare i campioni di sangue EDTA quanto prima al laboratorio per posta ordinaria.
2. Isolamento di HIV RNA e / o DNA
- Ottenere l'RNA virale e / o DNA a partire da 1000 microlitri di sangue intero, siero o plasma, utilizzando il MagNA Pure isolamento degli acidi nucleici Compact I kit di Io e il MagNA Pure System Compact.
- Eluire l'acquisita RNA o DNA in 50 microlitri tampone TE. In alternativa, altri procedimenti di purificazione di acidi nucleici possono essere utilizzati.
3. Amplificazione della regione env
Amplificare la regione env (figg. 2 e 4) sia da RNA o DNA provirale plasma. A-1245 bp lungo prodotto, comprendente la maggior parte della proteina Env (nt 6556-7811 according di HXB2) viene generato.
- I campioni di RNA: RT-PCR di reazione
- RNA virale presenta una struttura molto complessa secondaria (Fig. 4) che possono ostacolare la reazione RT. Per evitare questo problema, incubare RNA 10 pl a 65 ° C per 10 minuti (già nel tubo PCR e nella macchina PCR) e quindi ridurre la temperatura a 50 ° C.
- Aggiungere 40 ml di PCR Master Mix compreso il primer Env-F e Env-R.
Master Mix per RT-PCR In-House-System:Volume / reazione (pl) concentrazione finale RNasi-free H 2 O 14,4 Buffer 5x (Qiagen OneStep RT-PCR Kit) 10 1x 5x Q-Solution 10 1x dNTP Mix (10 mM ciascuno) <td> 2400 uM di ciascun dNTP Enzym-Mix (Qiagen OneStep RT-PCR Kit) 2 Primer Env-F (100 pM) 0,3 0,6 micron Primer Env-R (100 pM) 0,3 0,6 micron RNase Inhibitor (RNasin) 1 5 unità / reazione
Env-F: 5'-CAAAGCCTAAAGCCATGTGTAAA -3 '(nt 6556 → 6586 secondo HXB2)
Env-R: 5'-AGTGCTTCCTGCTGCTCCTAAGAACCC -3 '(nt 7785 ← 7811) - Eseguire la reazione di RT a 50 ° C per 30 minuti.
- Eseguire la prima PCR come segue:
95 ° C, 15 min 1 x 95 ° C, 30 sec
50 ° C, 30 sec
72 ° C, 2 min 1 x95 ° C, 30 sec
56 ° C, 30 sec
72 ° C, 2 min38 x 72 ° C, 10 min
4 ° C ∞
- I campioni di DNA: reazione PCR
Per i campioni di DNA provirale, nessuna reazione RT è necessaria, e la reazione di PCR può avviare direttamente.- Aggiungere 40 ml di PCR Master Mix a 10 microlitri di DNA provial.
Master Mix per PCR In-House-System:Volume / reazione (pl) concentrazione finale RNasi-free H 2 O 15,4 Buffer 5x (DNA Polymerase HotStarTaq) 10 1x 5x Q-Solution 10 1x dNTP Mix (10 mM ciascuno) 2 400 uM di ciascun dNTP Enzym-Mix (DNA polimerasi HotStarTaq) 2 Primer Env-F (100 pM) 0,3 0,6 micron Primer Env-R (100 pM) 0,3 0,6 micron
Env-F: 5'-CAAAGCCTAAAGCCATGTGTAAA -3 '(nt 6556 → 6586)
Env-R: 5'-AGTGCTTCCTGCTGCTCCTAAGAACCC -3 '(nt 7785 ← 7811) - Eseguire le condizioni di PCR come descritto in precedenza per i campioni di RNA (Punto 3.1.4).
- Aggiungere 40 ml di PCR Master Mix a 10 microlitri di DNA provial.
4. Amplificazione della regione V3: nested PCR
- Per la nested PCR, utilizzare 5 microlitri dalla prima reazione di PCR (senza precedente analisi in gel di agarosio) come modello e aggiungere 95 ml di Mas PCRter Mix.
Master Mix per Nested-PCR In-HouseVolume / reazione (pl) concentrazione finale H 2 O 61,9 10x PCR Buffer 10 1x 5x Q-Solution 20 1x dNTP Mix (10 mM ciascuno) 2 200 mM di ciascun dNTP Primer Env-2F (100 mM) 0,3 0,6 micron Primer Env-2R (100 mM) 0,3 0,6 micron HotStarTaq DNA polimerasi 0,5 2,5 unità / reazione
Env-2F: 5'-GTCCAAAGGTATCCTTTGAGCCAATTC -3 '(nt 6838 → 6864)- Eseguire la PCR come segue:
93 ° C, 15 min1 x 95 ° C, 30 sec
50 ° C, 30 sec
72 ° C, 90 sec1 x 95 ° C, 30 sec
56 ° C, 30 sec
72 ° C, 90 sec43 x 72 ° C, 10 min
4 ° C ∞- Analizzare il prodotto di PCR su un gel di agarosio 1% (Fig. 4). Il prodotto atteso è 902 bp di lunghezza.
- Purificazione dei campioni di sequenziamento.
- Purificare il prodotto di PCR con il kit di purificazione PCR-Qiagen, utilizzando il protocollo, soluzioni e micro-colonne fornite dal fornitore. Eluire in 30-100 microlitri di buffer PE, dell'intensità banda.
- In alternativa, i campioni possono essere purificato utilizzando esonucleasiI e veloce AP (Thermo fosfatasi alcalina). A tale scopo, aggiungere 6 microlitri Exo-AP prodotto Mix a 15 microlitri PCR e incubare 15 minuti a 37 ° C.
580 microlitri H 2 O 66 microlitri AP veloce 13,4 microlitri I Exo
- Eseguire la PCR come segue:
5. Reazione Sequenza dell'amplicone V3
- La reazione sequenza consiste in una reazione di PCR utilizzando una sola delle seguenti primers:
Env-2: 5'-GTACAATGYACACATGGAATTAGGC -3 (nt 6959 → 6980)
Env-5: 5'-AAAATTCCCCTCCACAATTA - 3 '(nt 7352 ← 7371)
Env-6: 5'-GGCCAGTAGTATCAACTCAAC - 3 '(nt 6979 → 7000)
Env-7: 5'-TGTCCACTGATGGGAGGGGC - 3 '(nt 7530 ← 7549)
Env-10: 5 '- GCAGAATAAAACAAATTATAAACATGTGGC - 3' (nt 7478 ← 7507)
Env-11: 5 '- TACATTGCTTTTCCTACTTTCTGCCAC - 3' (nt 7638 ← 7664)
Primer di prima scelta sono: Env-2, 6 o Env-Env-7, Env-11 - Utilizzare 1 microlitri dal amplicone V3 purificato come modello e aggiungere 9 ml di PCR master-mix.
Sequencing Master Mix:4 MIX sequenza microlitri (HIV-Genotipizzazione Kit) 4 microlitri H 2 O Primer 1 pl (100 pmol / pl) - Eseguire la reazione di sequenza nel modo seguente:
96 ° C, 10 sec 50 ° C, 10 sec 36 x 60 ° C, 45 sec 4 ° C ∞
6. Purificazione dei campioni di sequenziamento
Purify sequenze USIng Sephadex G-50 superfine.
- Riempire il numero appropriato di pozzi nel "caricatore colonna" con Sephadex G-50 superfine. Trasferire il Sephadex al MAHVN4510 piastra filtro girando.
- Aggiungere 300 microlitri Milli-Q H 2 O in ciascun pozzetto nella piastra filtro, e incubare per almeno 3 ore a 2-8 ° C.
- Centrifugare le piastre per 5 min a 910Xg e 4-15 ° C. Gettare il flow-through.
- Aggiungere 10 ml H 2 O al prodotto sequenza e quindi la sequenza pipetta sulla piastra gonfiò Sephadex.
- Per ottenere il prodotto purificato, centrifugare la piastra per 5 min. a 910Xg e 4-15 ° C e raccogliere il flusso passante.
7. Sequenziamento dei campioni purificati sul sequencer ABI Prism 3130 XL
- Prima di ciascuna serie, modificare il buffer e verificare la quantità del polimero (POP7). Se necessario, sostituire il vecchio pallone polimero con uno nuovo.
- Utilizzare le condizioni di esecuzione salvate, tra cui un tempo di iniezione di 18 secondi.
- In questa macchina, la raccolta dei dati di segnale di un'esecuzione con 16 campioni di sequenza dura circa 60 min (36 cm capillare) o 150 min (50 cm capillare).
8. Sequenza di montaggio
- Utilizzare il programma Lasergene (DNA-Star) per allineare e modificare le sequenze (Fig. 5). Altri programmi di modifica di sequenza possono essere utilizzati. Utilizzare un "V3-Consensus B" e la sequenza consenso env come riferimenti.
- Lasergene crea una sequenza consenso del campione analizzato utilizzando tutti i dati grezzi disponibili e memorizzarli come file FASTA. Il file FASTA è un file di testo che include un header con il nome del campione e la sequenza nucleotidica.
9. Sequencing interpretazione dei dati e la previsione tropismo
- Sequenziamento interpretazione dei dati viene eseguita dal sistema web-based interpretazione geno2pheno [corecettore] ( http://coreceptor.bioinf.mpi-inf.mpg.de/index.php). Per la previsione tropismo, FPR diverse impostazioni possono essere selezionate. L'impostazione predefinita è secondo i tedesco-austriaco linee guida di terapia. Per FPR ≥ 20%, il virus è classificato come R5 quando FPR ≥ 20% e X4 per FPR <12,5%.
- Carica il file FASTA nel server. Questo server traduce la sequenza nucleotidica in aminoacidi, allinea con il consenso sequenza V3-B e produce una classificazione sottotipo. Inoltre, si genera una previsione dell'utilizzo corecettore (Fig. 4) espresso come tasso di falsi positivi (FPR).
10. Risultati rappresentativi
Il geno2pheno [corecettore] uscita mostra una interpretazione graduale del tropismo. A seconda della probabilità di utilizzo corecettore, il testo e il colore di sfondo interpretazione varia da verde (FPR <20%), suggerendo una somministrazione sicura per MVC, al giallo, suggerendo un possibile, basso rischio ed infine al rosso. Rosso è il colore suggerisconozione non prescrivere MVC. Inoltre, il server genera un report pdf che può essere stampato, compilato con paziente e dati di esempio, e inviati al medico. Esempi di geno2pheno uscita [corecettore] sono rappresentate in fig. 6.
Figura. 1. La replicazione del virus HIV schematica. Il virione deve legarsi ai recettori cellulari come CD4 e sia al CCR5 o CXCR4 come co-recettore. Il co-recettore CCR5 può essere bloccato con antagonisti CCR5 come il Maraviroc (MVC, Celsentri, Selzentry). Dopo la fusione delle membrane virali e cellulari, il nucleocapside virale viene rilasciato nel citoplasma. Nucleocapside smonta e il complesso RNA virale è liberata nel citoplasma. La trascrittasi inversa virale (RT) trascrive l'RNA genomico in DNA provirale, che viene poi trasportato nel nucleo e integrato nel genoma dell'ospite dal HIV integrasi. Cellular RNA polimerasi tradinscribe genomico virale e RNA messaggeri dal genoma provirale. Le proteine virali sono prodotte nel citoplasma e trasportati alla superficie cellulare. La gemma virus particelle immature, non infettive virioni dalle cellule. La proteasi dell'HIV scinde le proteine produttrici di particelle infettive. Inibizione di una delle fasi porta ad una interruzione del ciclo di replicazione.
I farmaci antiretrovirali e la fase di replica che inibiscono sono contrassegnati in rosso.
Le RNA virale e DNA provirale (materiale utilizzato per l'analisi del tropismo o resistenza) sono contrassegnati in verde.
Figura 2. Genoma dell'HIV provirale. La particella dell'HIV è costruito con diverse proteine strutturali e case di vari enzimi e proteine sia di origine virale e cellulare. La figura mostras la posizione dei geni nel genoma virale. La superficie proteine gp120 e gp41 costituiscono picchi sulla superficie del virione e contattare la cellula umana per effettuare la fusione della membrana. Nella parte inferiore della figura, i prodotti di amplificazione PCR e primer utilizzati nel nostro protocollo sono mostrati.
Figura 3. Percentuale di pazienti con bassa carica virale (VL) misure analizzate per farmaco-resistenza o la determinazione tropismo presso l'Istituto di Virologia, Università di Colonia (Germania).
Figura 4. Schema generale della sperimentazione .. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. Sequenza di montaggio con Lasergene. L'amplicone V3 è sequenziato con almeno un avanti e un innesco inverso. Lasergene alignés i ". Abi" i file ottenuti dal sequencer con la sequenza di riferimento "V3-Consensus B" e env. Lasergene crea una sequenza consenso utilizzando tutti i dati di riga disponibili. Le sequenze di riferimento può essere marcato (e vengono quindi visualizzate in grigio) in modo che non contribuiscono alla sequenza consensus campione.
Figura 6. Rapporti di previsione tropismo generati dal geno2pheno [corecettore] Servizi tool.The vengono generati in formato pdf che possono essere salvati e completato nel computer. Altri dati quali nome paziente ci, la data di estrazione del sangue, ecc, può essere inclusa manualmente utilizzando un programma pdf scrittore. Osservazioni specifiche possono essere aggiunte. Thesdati elettronici sono esclusivamente sul computer dell'utente e non sul server geno2pheno [corecettore]. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Discussion
La sequenza V3 permette una previsione affidabile tropismo virale, come dimostrato in studi clinici 3-9. Infatti, la determinazione del genotipo è contemplato nelle linee guida europee in vigore e austro-tedesco 10.
Rispetto al test fenotipico, non solo è il tempo di rotazione più breve (equivalente a test di resistenza), ma anche i costi. Inoltre, un vantaggio importante di test genotipico è che i risultati sono classificati come FPR e quindi può essere adattata alle esigenze del paziente. Risultati Trofile, invece, sono semplicemente relazioni R5 o X4, e l'accesso ai dati grezzi non è dato.
Attualmente, le linee guida europee suggeriscono un FPR cut-off del 20% 10, mentre gli austro-tedeschi linee guida permettono di adattare il FPR cut-off in particolare alle esigenze di ogni paziente 11. In questa linea, per i pazienti con una vasta gamma di opzioni di farmaci antiretrovirali, più FPR cut-off (> 20%) sono raccomfinita. Al contrario, per pesantemente pre-trattati pazienti con limitate opzioni terapeutiche, inferiore FPR cut-off (> 5%) può essere utilizzato. Questo tipo di guida terapia è attualmente in corso della prova di resistenza NRTI, NNRTI, PI, e Inis, dove farmaci parzialmente attivi possono essere incluse nel trattamento di pazienti con ridotte opzioni terapeutiche. Inoltre, con un numero crescente di cambiamenti di terapia genotipicamente-guidate, l'clinicamente rilevante FPR cut-off sono costantemente regolati da un gruppo di bioinformatici, virologi e medici.
Un altro importante vantaggio del test genotipico tropismo è la possibilità di analizzare campioni clinici con molto basso o non rilevabile carica virale (VL). In questi casi, quando plasma RNA non è amplificabile, il DNA provirale può essere sequenziato e utilizzate per previsioni affidabili 9,12. Di nota, il numero di pazienti con bassa o carica virale non è nettamente aumentata negli ultimi anni. Ad oggi, la Trofilo test consente solo l'analisi di campioni da pazienti con VL <1000 copie / ml. Tuttavia, studi preliminari hanno dimostrato che il DNA provirale possono essere anche adecuate essere testato da Trofile 13.
Disclosures
In questo articolo il video è sponsorizzato da ViiV Healthcare e GlaxoSmithKline.
Acknowledgments
Gli autori sono finanziati dalla Corus, immissione di cella medsys, CATENA e progetti Resina.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MagNA Pure Compact Nucleic Acid Isolation Kit I | Roche Group | 04 802 993 001 | |
| MagNA Pure Compact System | Roche Group | 03731146001 | |
| T3000 Thermocycler | Biometra | 050-723 | |
| One Step RT-PCR Kit | Qiagen | 210215 | |
| HotStarTaq Master Mix Kit | Qiagen | 203445 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| Exonuclease I (Exo I) | Fermentas | EN0582 | |
| FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase | Fermentas | EF0651 | |
| BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit | Applied Biosystems | 4337457 | |
| Sephadex G-50 Superfine | GE Healthcare | 17-0041-01 | |
| ABI Prism 3130 XL capillary sequencer | Applied Biosystems | 3130XL |
References
- Heger, E., Schuelter, E., Klimkait, T., Lengauer, T., Kaiser, R., Walter, H., Sierra, S. European coreceptor proficiency panel test. 9th European Workshop on HIV & Hepatitis Treatment Strategies & Antiviral Drug Resistance, Paphos, Cyprus, , (2011).
- Lengauer, T., Sander, O., Sierra, S., Thielen, T., Kaiser, R. Bioinformatic prediction of HIV coreceptor usage. Nature Biotech. 25 (12), 1407-1410 (2007).
- McGovern, R., Dong, W., Zhong, X., Knapp, D., Thielen, A., Chapman, D., Lewis, M., James, I., Valdez, H., Harrigan, P. R. Population-based Sequencing of the V3-loop Is Comparable to the Enhanced Sensitivity Trofile Assay in Predicting Virologic Response to Maraviroc of Treatment-na ve Patients in the MERIT Trial. 17th Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections, San Francisco, USA, , (2010).
- Reuter, S., Braken, P., Jensen, B., Sierra-Aragon, S., Oette, M., Balduin, M., Kaiser, R., Haussinger, D. Maraviroc in treatment-experienced patients with HIV-1 infection - experience from routine clinical practice. Eur. J. Med. Res. 15 (6), 231-237 (2010).
- Recordon-Pinson, P., Soulie, C., Flandre, P., Descamps, D., Lazrek, M., Charpentier, C., Montes, B., Trabaud, M. A., Cottalorda, J., Schneider, V., Morand-Joubert, L., Tamalet, C., Desbois, D., Mace, M., Ferre, V., Vabret, A., Ruffault, A., Pallier, C., Raymond, S., Izopet, J., Reynes, J., Marcelin, A. G., Masquelier, B. Evaluation of the genotypic prediction of HIV-1 coreceptor use versus a phenotypic assay and correlation with the virological response to maraviroc: the ANRS GenoTropism study. Antimicrob. Agents. Chemother. 54 (8), 3335-3340 (2010).
- Swenson, L. C., Knapp, D., Harrigan, P. R. Calibration and accuracy of the geno2pheno co-receptor algorithm for predicting HIV tropism for single and triplicate measurements of V3 genotype. 10th International Congress on Drug Therapy in HIV Infection, Glasgow, UK, , (2010).
- Macartney, M. J., Cameron, J., Strang, A., García, A., Booth, C., Marshall, N., Johnson, M., Geretti, A. M. Use of a genotypic assay for the prediction of HIV-1 coreceptor tropism and guiding the use of CCR5 antagonists in clinical practice. 8th European HIV Drug Resistance Workshop, Sorrento, Italy, , (2010).
- Sierra, S., Thielen, A., Reuter, S., Jensen, B., Esser, S., Fätkenheuer, G., Lengauer, T., Pfister, H., Sichtig, N., Kaiser, R. Tropism determination and clinical outcome of 61 patients under MVC treatment. 8th European HIV Drug Resistance Workshop, Sorrento, Italy, , (2010).
- Obermeier, M., Carganico, A., Bieniek, B., Schleehauf, D., Dupke, S., Fischer, K., Freiwald, M., Neifer, S., Schuler, C., Mayr, C., Klausen, G., Köppe, S., üünsche, T., Berg, T., Baumgarten, A. Tropism testing from proviral DNA - analysis of a subgroup from the Berlin Maraviroc cohort. 8th European HIV Drug Resistance Workshop, Sorrento, Italy, , (2010).
- Vandekerckhove, L. P., Wensing, A. M., Kaiser, R., Brun-Vezinet, F., Clotet, B., De Luca, A., Dressler, S., Garcia, F., Geretti, A. M., Klimkait, T., Korn, K., Masquelier, B. European guidelines on the clinical management of HIV-1 tropism testing. Lancet Infect Dis. 11 (5), 394-407 (2011).
- Walter, H., Eberle, J., Möller, H., Noah, C., Wolf, E., St rmer, M., Braun, P., Krn, K., D umer, M., Berg, T., Obermeier, M., Thielen, A., Kaiser, R. Empfehlung zur Bestimmung des HIV-1-Korezeptor-Gebrauchs (DAIG Recommendations for the HIV-1 tropism testing). , (2011).
- Obermeier, M. J., Carganico, A., Dupke, S., Schranz, D., Cordes, C., Freiwald, M., Klausen, G., Köppe, S., Schuler, C., Mayr, C., Schleehauf, D., Berg, T., Krznaric, I., Baumgarten, A. Clinical application of genotypic co-receptor tropism testing from viral RNA and proviral DNA: week 24 analysis of the Berlin maraviroc cohort. Journal of the International AIDS Society. 13, Suppl . 4. 129-129 (2010).
- Toma, J., Frantzell, A., Hoh, R., Martin, J., Deeks, S., Petropoulos, C., Huang, W. Determining HIV-1 Co-receptor Tropism Using PBMC Proviral DNA Derived from Aviremic Blood Samples. 18th Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections, San Francisco, USA, , (2010).
