Summary
एचआईवी-1 के coreceptor के उपयोग की भविष्यवाणी एंटीरेट्रोवाइरल दवाओं, यानी coreceptor गरम का एक नया वर्ग के प्रशासन के लिए आवश्यक है. यह के अनुक्रम विश्लेषण के द्वारा किया जा सकता है
Protocol
प्रोटोकॉल छवि में संक्षेप है. 4.
1. रक्त के नमूनों का संग्रह
- EDTA ट्यूब में कम से कम 3 नैदानिक स्थल पर मिली रक्त ले लीजिए.
- नमूने एक सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है
- EDTA रक्त के नमूनों के रूप में प्रयोगशाला के लिए संभव के रूप में जल्द ही साधारण मेल द्वारा भेजें.
2. एचआईवी आरएनए और / या डीएनए के अलगाव
- 1000 μl पूरे रक्त, सीरम या प्लाज्मा से प्राप्त वायरल शाही सेना और / या डीएनए, मैग्ना शुद्ध कॉम्पैक्ट न्यूक्लिक एसिड अलगाव मैं किट मैं और मैग्ना शुद्ध कॉम्पैक्ट प्रणाली का उपयोग कर.
- 50 μl ते बफर में प्राप्त की शाही सेना या डीएनए Elute. वैकल्पिक रूप से, अन्य न्यूक्लिक एसिड शोधन प्रक्रियाओं का इस्तेमाल किया जा सकता है.
3. वातावरण क्षेत्र के प्रवर्धन
या तो प्लाज्मा आरएनए या proviral डीएनए (2 Figs. और 4) से वातावरण क्षेत्र बढ़ाना. एक 1245 उत्पाद बीपी लंबे, enV प्रोटीन का बहुमत शामिल (NT 6556-7811 accordinHXB2 छ) उत्पन्न होता है.
- प्रतिक्रिया RT-पीसीआर: शाही सेना के नमूने
- वायरल शाही सेना के एक बहुत ही जटिल माध्यमिक (4 छवि) संरचना है कि आरटी प्रतिक्रिया में बाधा हो सकता है प्रस्तुत करता है. इस समस्या से बचने के लिए, 65 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट (पहले से ही पीसीआर ट्यूब में और पीसीआर मशीन में) के लिए 10 μl शाही सेना और सेते हैं तो 50 डिग्री सेल्सियस के तापमान को कम
- पीसीआर मास्टर मिक्स enV एफ प्राइमरों और enV-R सहित 40 μl जोड़ें.
हाउस सिस्टम RT-पीसीआर के लिए मास्टर मिक्स:मात्रा / प्रतिक्रिया (μl) अंतिम एकाग्रता RNase मुक्त एच 2 हे 14.4 5x बफर (Qiagen OneStep किट RT-पीसीआर) 10 1x 5x क्यू समाधान 10 1x dNTP मिक्स (10 मिमी प्रत्येक) <td> 2प्रत्येक dNTP के 400 सुक्ष्ममापी Enzym मिक्स (Qiagen OneStep किट RT-पीसीआर) 2 लि एफ (100 सुक्ष्ममापी) प्राइमर 0.3 0.6 सुक्ष्ममापी लि आर (100 सुक्ष्ममापी) प्राइमर 0.3 0.6 सुक्ष्ममापी RNase अवरोध (RNasin) 1 5 इकाइयों / प्रतिक्रिया
EnV एफ: 5'-CAAAGCCTAAAGCCATGTGTAAA (6556 NT 6586 → अनुसार HXB2 के लिए) -3 '
लि-R: 5'-AGTGCTTCCTGCTGCTCCTAAGAACCC (NT के 7785 ← 7811) -3 ' - 50 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए आरटी प्रतिक्रिया चलाएँ.
- के रूप में 1 पीसीआर चलाएँ:
95 ° C 15min 1 x 95 डिग्री सेल्सियस, 30 सेकंड
50 ° C 30, सेकंड
72 डिग्री सेल्सियस, 2 मिनट 1 x95 डिग्री सेल्सियस, 30 सेकंड
56 डिग्री सेल्सियस, 30 सेकंड
72 डिग्री सेल्सियस, 2 मिनट38 x 72 डिग्री सेल्सियस, 10 मिनट
4 डिग्री सेल्सियस ∞
- पीसीआर प्रतिक्रिया: डीएनए नमूने
Proviral डीएनए नमूने लिए, कोई प्रारंभिक RT प्रतिक्रिया की जरूरत है, और सीधे पीसीआर प्रतिक्रिया शुरू कर सकते हैं.- Provial डीएनए के 10 μl पीसीआर मास्टर मिक्स 40 μl जोड़ें.
मास्टर मिक्स - हाउस सिस्टम में पीसीआर के लिए:मात्रा / प्रतिक्रिया (μl) अंतिम एकाग्रता RNase मुक्त एच 2 हे 15.4 5x बफर (HotStarTaq डीएनए पोलीमरेज़) 10 1x 5x क्यू समाधान 10 1x dNTP मिक्स (10 मिमी प्रत्येक) 2 प्रत्येक dNTP के 400 सुक्ष्ममापी Enzym मिक्स (डीएनए पोलीमरेज़ HotStarTaq) 2 लि एफ (100 सुक्ष्ममापी) प्राइमर 0.3 0.6 सुक्ष्ममापी लि आर (100 सुक्ष्ममापी) प्राइमर 0.3 0.6 सुक्ष्ममापी
EnV एफ: 5'-CAAAGCCTAAAGCCATGTGTAAA (NT के 6556 → 6586) -3 '
लि-R: 5'-AGTGCTTCCTGCTGCTCCTAAGAACCC (NT के 7785 ← 7811) -3 ' - पीसीआर की स्थिति के रूप में पहले शाही सेना के नमूने (3.1.4 चरण) के लिए वर्णित चलाएँ.
- Provial डीएनए के 10 μl पीसीआर मास्टर मिक्स 40 μl जोड़ें.
4. V3 क्षेत्र के प्रवर्धन: नेस्टेड पीसीआर
- नेस्टेड पीसीआर लिए, टेम्पलेट के रूप में पहले पीसीआर प्रतिक्रिया (agarose जेल में पिछले विश्लेषण के बिना) से 5 μl का उपयोग करने के लिए और पीसीआर Mas के 95 μl जोड़ेंआतंकवाद मिक्स.
नेस्टेड में सदन पीसीआर के लिए मास्टर मिक्समात्रा / प्रतिक्रिया (μl) अंतिम एकाग्रता एच 2 हे 61.9 10x पीसीआर बफर 10 1x 5x क्यू समाधान 20 1x dNTP मिक्स (10 मिमी प्रत्येक) 2 प्रत्येक dNTP के 200 सुक्ष्ममापी लि 2 एफ (100 सुक्ष्ममापी) प्राइमर 0.3 0.6 सुक्ष्ममापी लि 2R (100 सुक्ष्ममापी) प्राइमर 0.3 0.6 सुक्ष्ममापी HotStarTaq डीएनए पोलीमरेज़ 0.5 2,5 इकाइयों / प्रतिक्रिया
लि 2F: 5'-GTCCAAAGGTATCCTTTGAGCCAATTC -3 '(6838 NT के → 6864)- के रूप में निम्नानुसार पीसीआर चलाएँ:
93 ° C 15min1 x 95 डिग्री सेल्सियस, 30 सेकंड
50 ° C 30, सेकंड
72 डिग्री सेल्सियस, 90 सेकंड1 x 95 डिग्री सेल्सियस, 30 सेकंड
56 डिग्री सेल्सियस, 30 सेकंड
72 डिग्री सेल्सियस, 90 सेकंडX 43 72 डिग्री सेल्सियस, 10 मिनट
4 डिग्री सेल्सियस ∞- एक 1% agarose जेल (4 छवि) पर पीसीआर उत्पाद का विश्लेषण. अपेक्षित उत्पाद 902 बीपी लंबी है.
- अनुक्रमण नमूनों की शोधन.
- शुद्ध क्विएज़न किट पीसीआर शुद्धि के साथ पीसीआर उत्पाद, प्रोटोकॉल, समाधान और सूक्ष्म कॉलम सप्लायर द्वारा प्रदान का उपयोग. को 30-100 μl पीई बफर में Elute, बैंड तीव्रता पर निर्भर करता है.
- वैकल्पिक रूप से, नमूने exonuclease का उपयोग कर शुद्ध किया जा सकता हैऔर मैं फास्ट एपी (थर्मो alkaline फॉस्फेट). इस प्रयोजन के लिए, 15 μl पीसीआर उत्पाद 6 μl Exo-एपी मिक्स जोड़ सकते हैं और 37 पर 15 मिनट सेते हैं डिग्री सेल्सियस
580 μl एच 2 हे 66 μl तेजी एपी 13.4 μl मैं Exo
- के रूप में निम्नानुसार पीसीआर चलाएँ:
5. V3 amplicon के अनुक्रम प्रतिक्रिया
- अनुक्रम प्रतिक्रिया एक पीसीआर केवल निम्नलिखित प्राइमरों एक का उपयोग कर प्रतिक्रिया के होते है:
लि-2: 5'-GTACAATGYACACATGGAATTAGGC -3 (NT के 6959 → 6980)
लि-5: 5'-AAAATTCCCCTCCACAATTA - (NT के 7352 ← 7371) 3 '
लि-6: 5'-GGCCAGTAGTATCAACTCAAC - (NT के 6979 → 7000) 3 '
लि-7: 5'-TGTCCACTGATGGGAGGGGC - (NT के 7530 ← 7549) 3 '
लि 10-: 5 '- GCAGAATAAAACAAATTATAAACATGTGGC - 3' (NT के ७,४७८ ← 7507)
लि-11: 5 '- TACATTGCTTTTCCTACTTTCTGCCAC - 3' (NT के 7638 ← 7664)
पहली पसंद प्राइमरों हैं: enV-2, enV-6 या enV-7, enV-11 - टेम्पलेट के रूप में शुद्ध V3 amplicon से 1 μl का उपयोग और मास्टर मिश्रण पीसीआर के 9 μl जोड़ें.
मास्टर मिक्स अनुक्रमण कर रहा है:4 μl अनुक्रम मिश्रण (किट एचआईवी जीनोटाइपिंग) 4 μl एच 2 हे 1 μl प्राइमर (100 pmol / μl) - अनुक्रम के रूप में प्रतिक्रिया चलाएँ:
96 ° C 10, सेकंड 50 ° C 10, सेकंड X 36 60 डिग्री सेल्सियस 45, सेकंड 4 डिग्री सेल्सियस ∞
6. अनुक्रमण नमूने का शोधन
दृश्यों उसी शुद्धएनजी Sephadex अति सूक्ष्म-50 जी.
- Sephadex जी 50 से उत्तम के साथ "स्तंभ लोडर" में कुओं की उचित संख्या भरें. फ़िल्टर थाली MAHVN4510 मोड़ पर स्थानांतरण Sephadex.
- फ़िल्टर थाली में एक अच्छी तरह से 300 μl मिल्ली क्यू एच 2 हे जोड़ें, और कम से कम 3 के लिए यह 2-8 पर सेते हैं डिग्री सेल्सियस
- और 4-15 910Xg सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए प्लेटों अपकेंद्रित्र प्रवाह के माध्यम से त्यागें.
- अनुक्रम के उत्पाद और फिर pipet बढ़कर Sephadex प्लेट पर अनुक्रम 10 μl एच 2 हे जोड़ें.
- शुद्ध उत्पाद प्राप्त करने के लिए, 5 मिनट के लिए थाली अपकेंद्रित्र. 910Xg और 4-15 डिग्री सेल्सियस और प्रवाह के माध्यम से इकट्ठा.
7. Sequencer अबी चश्मे 3130 XL पर शुद्ध नमूने अनुक्रमण
- प्रत्येक रन से पहले, बफर बदलने के लिए और बहुलक (POP7) की मात्रा की जाँच करें. यदि आवश्यक हो, तो एक नया एक पुराने बहुलक कुप्पी की जगह.
- बचाया 18 सेकंड का एक इंजेक्शन समय सहित रन शर्तों, का प्रयोग करें.
- इस मशीन, 16 अनुक्रम नमूनों के साथ एक रन के संकेत डेटा के संग्रह (केशिका 36 सेमी) के बारे में 60 मिनट या 150 मिनट (केशिका 50 सेमी) लेता है.
8. अनुक्रम संपादन
- कार्यक्रम Lasergene (डीएनए स्टार) का उपयोग करने के लिए पंक्ति में और (5 छवि) दृश्यों को संपादित. अन्य अनुक्रम संपादन प्रोग्राम का इस्तेमाल किया जा सकता है. एक "V3 सहमति बी" और वातावरण में संदर्भ के रूप में आम सहमति अनुक्रम का प्रयोग करें.
- Lasergene विश्लेषण नमूना के एक आम सहमति अनुक्रम सभी कच्चे उपलब्ध है और यह FASTA फ़ाइल के रूप में संग्रहीत डेटा का उपयोग कर बनाता है. FASTA फ़ाइल एक पाठ फ़ाइल है कि नमूना के नाम और nucleotide अनुक्रम के साथ एक शीर्षक शामिल है.
9. डेटा की व्याख्या और tropism भविष्यवाणी अनुक्रमण
- व्याख्या डेटा अनुक्रमण व्याख्या वेब आधारित प्रणाली के द्वारा किया जाता है geno2pheno [coreceptor] ( http://coreceptor.bioinf.mpi-inf.mpg.de/) index.php. Tropism भविष्यवाणी के लिए, अलग fpr सेटिंग का चयन किया जा सकता है. डिफ़ॉल्ट सेटिंग जर्मन ऑस्ट्रियाई चिकित्सा के दिशा निर्देशों के अनुसार है. Fpr ≥ 20% के लिए, वायरस R5 के रूप में वर्गीकृत किया जाता है जब fpr ≥ fpr <12.5% के लिए 20% और X4.
- सर्वर में FASTA फाइल अपलोड करें. इस सर्वर nucleotide अनुक्रम एमिनो एसिड में अनुवाद, यह बी V3 सहमति अनुक्रम के साथ aligns और एक उप प्रकार वर्गीकरण का उत्पादन. इसके अलावा, यह coreceptor उपयोग के एक भविष्यवाणी उत्पन्न (4 छवि) झूठी सकारात्मक दर (fpr) के रूप में व्यक्त किया.
10. प्रतिनिधि परिणाम
geno2pheno [coreceptor] उत्पादन tropism की एक वर्गीकृत व्याख्या से पता चलता है. Coreceptor उपयोग की संभावना के आधार पर व्याख्या पाठ और पृष्ठभूमि रंग हरे (<20% fpr) से बदलता है, MVC के लिए एक सुरक्षित प्रशासन सुझाव, पीले रंग के लिए संभव हो, कम जोखिम का सुझाव है और अंत में लाल. लाल रंग है सुझाव हैMVC नहीं लिख रही है. इसके अलावा, एक सर्वर pdf रिपोर्ट है कि मुद्रित किया जा सकता है, रोगी और नमूना डेटा के साथ में भरा उत्पन्न करता है, और चिकित्सक के लिए भेजा है. Geno2pheno [coreceptor] उत्पादन के उदाहरण छवि में चित्रित कर रहे हैं. 6.
चित्रा. 1. एचआईवी के योजनाबद्ध प्रतिकृति virion रिसेप्टर के रूप में सेलुलर CD4 के लिए बाध्य करने के लिए और CCR5 या coreceptor रूप CXCR4 तो चाहिए. coreceptor CCR5 CCR5 maraviroc तरह गरम (MVC, Celsentri, Selzentry) के साथ अवरुद्ध किया जा सकता है. वायरल और सेलुलर झिल्लियाँ के विलय के बाद, वायरल nucleocapsid cytoplasm में जारी की है. nucleocapsid disassembles और वायरल शाही सेना परिसर cytoplasm में मुक्त है. वायरल रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस (आर टी) proviral डीएनए, कि तब नाभिक के लिए ले जाया जाता है और एचआईवी इंटिग्रेस द्वारा मेजबान जीनोम में एकीकृत में जीनोमिक शाही सेना transcribes. सेलुलर आरएनए पोलिमेरासिज़ टीआरएवायरल और proviral जीनोम से जीनोमिक दूत RNAs nscribe. वायरल प्रोटीन cytoplasm में उत्पादित कर रहे हैं और कोशिका की सतह के लिए ले जाया जाता है. कोशिकाओं से अपरिपक्व, गैर संक्रामक virions के रूप में वायरस कणों कली. एचआईवी protease संक्रामक कणों को उत्पादन प्रोटीन cleaves. एक कदम के निषेध प्रतिकृति चक्र के एक रुकावट के लिए होता है.
एंटीरेट्रोवाइरल दवाओं और नकल कदम है कि वे को बाधित लाल रंग में चिह्नित कर रहे हैं.
वायरल शाही सेना और proviral डीएनए (सामग्री tropism या प्रतिरोध के विश्लेषण के लिए प्रयोग किया जाता है) को हरे रंग में चिह्नित कर रहे हैं.
चित्रा 2. एचआईवी proviral जीनोम एचआईवी कण विभिन्न संरचनात्मक प्रोटीन और दोनों वायरल और सेलुलर मूल से विभिन्न एंजाइमों और प्रोटीन के घरों के साथ बनाया गया है. आंकड़ा शोवायरल जीनोम के भीतर जीन का स्थान है. सतह प्रोटीन gp120 और gp41 virion के सतह पर spikes के गठन और मानव कोशिका झिल्ली संलयन प्रदर्शन संपर्क. आंकड़े के निचले हिस्से में, पीसीआर प्रवर्धन उत्पादों और हमारे प्रोटोकॉल में इस्तेमाल प्राइमरों दिखाए जाते हैं.
चित्रा 3 कम वायरल लोड (वीएल) के साथ रोगियों के अनुपात में दवा प्रतिरोध या विषाणु विज्ञान, कोलोन विश्वविद्यालय (जर्मनी) के संस्थान में tropism दृढ़ संकल्प के लिए विश्लेषण माप.
चित्रा 4. प्रयोग की समग्र योजना .. कृपया यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें .
चित्रा 5. अनुक्रम Lasergene साथ संपादन V3 amplicon आगे कम से कम एक और एक रिवर्स प्राइमर के साथ अनुक्रम है. Lasergene "अबी." संदर्भ दृश्यों "V3 सहमति बी" के साथ sequencer से प्राप्त और वातावरण फ़ाइलों alignes. Lasergene एक आम सहमति अनुक्रम सभी पंक्ति उपलब्ध डेटा का उपयोग कर बनाता है. संदर्भ दृश्यों (और कर रहे हैं तो भूरे रंग में प्रदर्शित) के रूप में चिह्नित किया जा सकता है ताकि वे नमूना आम सहमति अनुक्रम में योगदान नहीं है.
6 चित्रा. Tropism भविष्यवाणी geno2pheno द्वारा उत्पन्न रिपोर्ट [coreceptor] tool.The रिपोर्ट pdf फ़ाइलें कि और बचाया जा सकता है और कंप्यूटर में पूरा के रूप में उत्पन्न कर रहे हैं. अतिरिक्त हमें ऐसे रोगी के नाम, रक्त निकासी की तिथि, आदि डेटा, मैन्युअल एक pdf लेखक कार्यक्रम का उपयोग किया जा सकता है. विशेष टिप्पणी को भी जोड़ा जा सकता है. Thesई डेटा को उपयोगकर्ता के कंप्यूटर पर और geno2pheno [coreceptor] सर्वर पर नहीं विशेष रूप से कर रहे हैं. कृपया यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें .
Discussion
V3 क्रम में एक विश्वसनीय वायरल tropism भविष्यवाणी की अनुमति देता है, के रूप में नैदानिक अध्ययन 3-9 में दिखाया गया है. वास्तव में, वर्तमान में यूरोपीय और जर्मन ऑस्ट्रियाई 10 दिशानिर्देशों में genotypic दृढ़ संकल्प पर विचार किया गया है.
प्ररूपी परीक्षण की तुलना में, न केवल कारोबार कम समय (प्रतिरोध परीक्षण के बराबर) है, लेकिन यह भी खर्च कर रहे हैं. इसके अलावा, genotypic परीक्षण का एक बड़ा लाभ यह है कि परिणाम fpr के रूप में वर्गीकृत कर रहे हैं और इसलिए मरीजों की जरूरतों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. Trofile परिणाम, दूसरे हाथ पर, बस R5 या X4 रिपोर्टों, और कच्चे डेटा के लिए उपयोग नहीं दिया जाता है.
वर्तमान में, यूरोपीय दिशानिर्देश 20 10% की एक fpr काट सुझाव है, जबकि ऑस्ट्रियाई जर्मन दिशानिर्देशों का पूरी तरह पालन करते fpr आदत डाल प्रत्येक रोगी के 11 जरूरतों के लिए कट ऑफ विशेष रूप से अनुमति देते हैं. इस लाइन में, एंटीरेट्रोवाइरल दवाओं विकल्पों में से एक व्यापक रेंज, उच्च fpr नापसंद कटौती (> 20%) के साथ रोगियों के लिए recomm हैंसमाप्त हो गया. इसके विपरीत, के लिए सीमित चिकित्सकीय विकल्प के साथ भारी पूर्व इलाज रोगियों, कम fpr नापसंद कटौती (> 5%) इस्तेमाल किया जा सकता है. चिकित्सा मार्गदर्शन के इस तरह वर्तमान NRTIs, NNRTIs, पीआईएस, और INIS, जहां आंशिक रूप से सक्रिय दवाओं कम चिकित्सीय विकल्पों के साथ रोगियों के लिए इलाज में शामिल किया जा सकता है के लिए परीक्षण प्रतिरोध से चल रही है. इसके अलावा, नैदानिक प्रासंगिक genotypically निर्देशित चिकित्सा परिवर्तन की बढ़ती संख्या के साथ fpr नापसंद कटौती लगातार bioinformaticians virologists, और चिकित्सकों के एक पैनल द्वारा समायोजित किया जा रहा है.
Genotypic tropism परीक्षण की एक अन्य महत्वपूर्ण लाभ बहुत कम है या भी undetectable वायरल लोड (वीएल) के साथ चिकित्सीय नमूनों का विश्लेषण करने की संभावना है. इस मामले में, जब प्लाज्मा आरएनए amplifiable नहीं है, proviral डीएनए और अनुक्रम किया जा सकता है विश्वसनीय 9,12 भविष्यवाणियों के लिए प्रयोग किया जाता है. ध्यान से, कम या undetectable वायरल लोड के साथ रोगियों की संख्या तेजी से हाल के वर्षों में बढ़ गया है. तिथि करने के लिए, टीrofile परख केवल VL साथ रोगियों <1000 प्रतियां / एमएल से नमूने के विश्लेषण की अनुमति देता है. हालांकि, प्रारंभिक अध्ययनों से पता चला है कि proviral डीएनए भी 13 Trofile द्वारा परीक्षण किया जा adecuate हो सकता है.
Disclosures
इस वीडियो लेख ViiV हेल्थकेयर और ग्लैक्सोस्मिथक्लाइन द्वारा प्रायोजित है.
Acknowledgments
लेखकों कोरस, MedSys सेल एंट्री, चेन और RESINA परियोजनाओं से वित्त पोषित कर रहे हैं.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MagNA Pure Compact Nucleic Acid Isolation Kit I | Roche Group | 04 802 993 001 | |
| MagNA Pure Compact System | Roche Group | 03731146001 | |
| T3000 Thermocycler | Biometra | 050-723 | |
| One Step RT-PCR Kit | Qiagen | 210215 | |
| HotStarTaq Master Mix Kit | Qiagen | 203445 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| Exonuclease I (Exo I) | Fermentas | EN0582 | |
| FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase | Fermentas | EF0651 | |
| BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit | Applied Biosystems | 4337457 | |
| Sephadex G-50 Superfine | GE Healthcare | 17-0041-01 | |
| ABI Prism 3130 XL capillary sequencer | Applied Biosystems | 3130XL |
References
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