Summary
HIV-1のコレセプター使用率の予測は、抗レトロウイルス薬、すなわち共受容体拮抗薬の新しいクラスの管理のために必要とされる。それは、一連の分析によって行うことができます
Abstract
マラビロクは（MVC）の共受容体拮抗薬のクラスからの最初のライセンスを取得し、抗レトロウイルス薬です。それは人間の免疫細胞（図1）を感染させるためにHIV株の大部分で使用されているホストコレセプターCCR5に結合する。他のHIV分離株が異なるコレセプター、CXCR4を使用しています。使用されている受容体、Envタンパク質（図2）でウイルスに決定される。コレセプター使用に応じて、ウイルスはそれぞれ、R5またはX4、として分類されます。 MVCは、CCR5受容体を阻害する標的細胞へのR5ウイルスのエントリにバインドします。病気の経過中、X4ウイルスが出現するとR5ウイルスを脱却することができる。 EMAとFDAが要求するようなコレセプター使用の決定は、（また、向性と呼ばれる）、従って前MVCの管理に必須です。
MVCの効率MOTIVATE、MERITと1029のための研究は、これはsophiに基づいた高品質なアッセイであるモノグラム、サンフランシスコ、アメリカからTrofileアッセイを用いて行われてきたsticated換えテスト。ヨーロッパの医師ではなく、またそれに伴う抵抗試験を提供する分散型の専門家の研究室で作業する傾向があるので、日常生活のためにこのテストの受け入れは、米国の外でかなり低いです。これらの研究所は、2011年1に提示されている最後のものをいくつかの品質保証評価を受けています。
ここ数年、我々はHIVのenv-V3の遺伝子領域（V3）2からの配列解析に基づく指向性の測定を行った。この領域は、信頼性の高い予測を実行するための十分な情報を運ぶ。短い回転時間（耐性試験に相当）を、低コスト、患者のニーズに結果を適応させる可能性と非常に低いか、またはあっても検出できないウイルス負荷（VLと臨床検体を分析の可能性：コレセプター使用の遺伝子型の決定は、次のような利点を提示）、特に以来、VLと分析されたサンプルの数<1000コピー/μL大体（図3）の最後の年で増加した。
向性テストするための主な手順は（図4）このビデオで実証：
1。血液サンプルの収集
2。血単核細胞から血漿および/またはHIVプロウイルスDNAからHIVのRNAの単離
3。 envの領域の増幅
4。 V3領域の増幅
5。 V3のアンプリコンの配列反応
6。シークエンシングサンプルの精製
7。精製サンプルのシーケンシング
8。シーケンス編集
9。データの解釈や向性予測をシーケン
Protocol
プロトコルを図にまとめられている。 4。
1。血液サンプルの収集
- 臨床現場でEDTAチューブ内に少なくとも3つのmlの血液を採取します。
- サンプルは4℃で一週間まで保存することができます
- 普通郵便で検査室にできるだけ早くEDTA-血液サンプルを送ってください。
2。 HIV RNAおよび/またはDNAの単離
- マグナピュアコンパクト核酸アイソレーションキットI私、マグナピュアコンパクトなシステムを使用して、1000μlの全血、血清または血漿からのウイルスRNAおよび/またはDNAを得た。
- 50μlのTEバッファーで培ったRNAまたはDNAを溶出する。あるいは、他の核酸精製法を用いてもよい。
3。 envの領域の増幅
血漿RNAまたはウイルスDNAのいずれかからのenv領域（図2、図4）を増幅する。 Envタンパク質の大部分を含む1245 bpの長さの製品、（NT 6556から7811 AccordinはHXB2へグラム）が生成されます。
- RNAサンプル：RT-PCR反応
- ウイルスRNAはRT反応を妨げる可能性が非常に複雑な二次構造（図4）を提示します。この問題を回避するには、10分（既にPCRチューブやPCRマシンで）65℃で10μlのRNAをインキュベートした後、50℃に温度を下げる
- プライマーENV-FおよびENV-Rを含むPCRマスターミックス40μlを添加する。
ハウスインシステムRT-PCR用マスターミックス：ボリューム/反応量（μl） 最終濃度 RNaseフリーH 2 O 14.4 5倍のバッファ（キアゲンワンステップRT-PCRキット） 10 1X Q-Solutionは5倍 10 1X dNTPミックス（各10mM） <TD> 2各dNTP400μMの Enzymミックス（キアゲンワンステップRT-PCRキット） 2 プライマーENV-F（100μM） 0.3 0.6μM プライマーENV-R（100μM） 0.3 0.6μM RNase阻害剤（RNasin） 1 5単位/反応
ENV-F：5'-CAAAGCCTAAAGCCATGTGTAAA -3 '（NT 6556→6586 HXB2による）
ENV-R：5'-AGTGCTTCCTGCTGCTCCTAAGAACCC -3 '（NT 7785←7811） - 30分間、50℃でRT反応を実行します。
- 次のように最初のPCRを実行します。
95℃、15分 1つのx 95℃、30秒
50℃、30秒
72℃、2分 1つのx95℃、30秒
56℃、30秒
72℃、2分38× 72℃、10分
4℃∞
- DNAサンプル：PCR反応
プロウイルスDNAのサンプルについては、初期のRT反応は必要ありませんし、PCR反応を直接起動することができます。- provialのDNAを10μlのPCR Master Mixを40μlを添加する。
ハウスインシステムPCR用マスターミックス：ボリューム/反応量（μl） 最終濃度 RNaseフリーH 2 O 15.4 5倍のバッファ（HotStarTaq DNAポリメラーゼ） 10 1X Q-Solutionは5倍 10 1X dNTPミックス（各10mM） 2 各dNTP400μMの Enzymミックス（HotStarTaq DNAポリメラーゼ） 2 プライマーENV-F（100μM） 0.3 0.6μM プライマーENV-R（100μM） 0.3 0.6μM
ENV-F：5'-CAAAGCCTAAAGCCATGTGTAAA -3 '（NT 6556→6586）
ENV-R：5'-AGTGCTTCCTGCTGCTCCTAAGAACCC -3 '（NT 7785←7811） - 以前にRNAサンプル（ステップ3.1.4）で説明したPCR条件を実行します。
- provialのDNAを10μlのPCR Master Mixを40μlを添加する。
4。 V3領域の増幅：ネステッドPCR
- nested PCR法は、鋳型として、最初のPCR反応（アガロースゲルで以前の分析なし）から5μlを使用し、PCRマスの95μlを加えるTERは混ぜる。
ネストされたインハウスPCR用マスターミックスボリューム/反応量（μl） 最終濃度 H 2 O 61.9 10×PCRバッファー 10 1X Q-Solutionは5倍 20 1X dNTPミックス（各10mM） 2 各dNTP200μMの プライマーENV-2F（100μM） 0.3 0.6μM プライマーENV-2R（100μM） 0.3 0.6μM HotStarTaq DNAポリメラーゼ 0.5 2,5単位/反応
ENV-2F：5'-GTCCAAAGGTATCCTTTGAGCCAATTC -3 '（NT 6838→6864）- 次のようにPCRを実行します。
93℃、15分1つのx 95℃、30秒
50℃、30秒
72℃、90秒1つのx 95℃、30秒
56℃、30秒
72℃、90秒43× 72℃、10分
4℃∞- 1％アガロースゲル（図4）でPCR産物を分析します。予想される製品は、902 bpの長さである。
- シークエンシングサンプルの精製。
- サプライヤーが提供するプロトコル、ソリューション、マイクロカラムを使用して、Qiagen社のPCR精製キットでPCR産物を精製する。バンド強度に応じて、30から100μlのPEのバッファーで溶出。
- あるいは、サンプルはエキソヌクレアーゼを用いて精製することができる私とFastのAP（サーモアルカリホスファターゼ）。この目的のために、15μlのPCR産物に6μlのエキソ-APのミックスを追加し、37℃で15分間インキュベート℃、
580μlのH 2 O 66μlの高速AP 13.4μlのエクソ私
- 次のようにPCRを実行します。
5。 V3のアンプリコンの配列反応
- シーケンス反応は以下のプライマーの一方のみを用いたPCR反応で構成されています。
ENV-2：5'-GTACAATGYACACATGGAATTAGGC -3（NT 6959→6980）
ENV-5：5'-AAAATTCCCCTCCACAATTA - 3 '（NT 7352←7371）
ENV-6：5'-GGCCAGTAGTATCAACTCAAC - 3 '（NT 6979→7000）
ENV-7：5'-TGTCCACTGATGGGAGGGGC - 3 '（NT 7530←7549）
ENV-10：5 ' - GCAGAATAAAACAAATTATAAACATGTGGC - 3'（NT 7478←7507）
ENV-11：5 ' - TACATTGCTTTTCCTACTTTCTGCCAC - 3'（NT 7638←7664）
最初の選択肢プライマーは以下のとおりです。ENV-2、ENV-6またはenv-7は、env-11 - テンプレートとして精製されたV3のアンプリコンから1μlを使用し、PCRマスターミックスの9μlを添加する。
Master Mixをシーケンシング：4μlのシーケンスミックス（HIV-ジェノタイピングキット） 4μlのH 2 O 1μlのプライマー（100ピコモル/μl）を - 次のようにシーケンス反応を実行します。
96℃、10秒 50℃、10秒 36× 60℃、45秒 4℃∞
6。シークエンシングサンプルの精製
シーケンスUSIを清めるngのセファデックスG-50超。
- デックスG-50超で "列ローダ"で井戸の数を適切に記入してください。上に回してフィルタープレートMAHVN4510にデックスを転送します。
- フィルタープレートの各ウェルに300μlのミリQ H 2 Oを追加し、2〜8℃で少なくとも3時間のためにそれをインキュベート℃に
- 910Xgと4から15℃で5分間プレートを遠心分離フロースルーを捨てる。
- シーケンスの製品との膨潤したセファデックスプレート上ピペットシーケンスに10μlのH 2 Oを追加します。
- 精製された生成物を得るためには、5分間プレートを遠心します。 910Xgと4から15℃で、フロースルーを収集します。
7。シーケンサーABIプリズム3130 XLの精製サンプルのシーケンシング
- 各実行の前に、バッファを変更して、ポリマー（POP7）の音量を確認してください。必要に応じて、新しいものに古いポリマーフラスコを交換してください。
- 18秒の噴射時間を含む保存された実行条件を使用。
- このマシンでは、16のシーケンスサンプルを1ランの信号データの収集は、約60分（36センチメートルキャピラリー）または150分（50センチメートルキャピラリー）を取ります。
8。シーケンス編集
- シーケンス（図5）を合わせて、編集するためのプログラムLASERGENE（DNAスター）を使用します。他のシーケンス編集プログラムを使用することができる。参照として"V3-コンセンサスB" および envコンセンサス配列を使用します。
- LASERGENEは、利用可能なすべての生データを用いて分析した試料のコンセンサス配列を作成し、FASTAファイルとして格納します。 FASTA形式のファイルには、サンプルの名前と塩基配列とヘッダを含むテキストファイルです。
9。データの解釈や向性予測をシーケン
- データ解釈をシーケンシングするWebベースの解釈システムによって行われるgeno2pheno [コレセプター]（ http://coreceptor.bioinf.mpi-inf.mpg.de/index.php）を。向性の予測については、別のFPRの設定が選択できます。デフォルト設定では、ドイツ·オーストリアの治療ガイドラインに沿っています。 FPRの≥20％の場合、ウイルスはFPR <12.5％時FPRの≥20％およびX4 R5として分類されます。
- サーバにFASTAファイルをアップロードします。このサーバーは、アミノ酸に塩基配列を変換V3-コンセンサスB配列でそれを整列させ、サブタイプ分類を生成します。また、偽陽性率（FPR）として表現（図4）コレセプター使用率の予測を生成します。
10。代表的な結果
geno2pheno [コレセプター]の出力は、向性の段階的な解釈を示しています。コレセプター使用の可能性に応じて、解釈のテキストと背景の色が可能であれば、リスクが低いことを示唆し、最終的に赤に黄色に、MVCのための安全管理を示唆し、緑（<20％FPR）によって異なります。赤は示唆している色ですMVCを処方していないING。さらに、サーバは、印刷された患者さん及び、サンプルデータで埋められ、医師に送信することができますPDF形式のレポートを生成します。 geno2pheno [コレセプター]の出力例を、図に示されている。 6。
図。 1。 HIV感染の概略複製。ビリオンは、受容体のような細胞のCD4に結合しなければならず、コレセプターとしてCCR5またはCXCR4のどちらかに。コレセプターCCR5は、マラビロクのようなCCR5アンタゴニスト（MVC、Celsentri、Selzentry）でブロックすることができます。ウイルスと細胞膜の融合後、ウイルスのヌクレオは、細胞質に放出される。ヌクレオカプシドは分解し、ウイルスRNAの複合体は、細胞質へ放出される。ウイルスの逆転写酵素（RT）は、次に核に輸送され、HIVインテグラーゼによって宿主ゲノムに組み込まれたプロウイルスDNAにゲノムRNAを転写する。細胞のRNAポリメラーゼのtraプロウイルスゲノムからのウイルスゲノムおよびメッセンジャーRNAをnscribe。ウイルスタンパク質は、細胞質内で産生され、細胞表面に輸送される。細胞から未熟な、非感染性ビリオンとしてウイルス粒子の芽。 HIVプロテアーゼは、感染性粒子を産生するタンパク質を切断する。の手順のいずれかの阻害は、複製サイクルの中断につながる。
彼らが阻害することを抗レトロウイルス薬とレプリケーション·ステップは赤でマークされています。
ウイルスRNAおよびプロウイルスDNA（向性や抵抗解析に用いる材料）が緑色でマークされています。
図2。 HIVプロウイルスゲノム。HIV粒子は、異なる構造タンパク質と住宅の両方のウイルスおよび細胞起源からの様々な酵素やタンパク質を構築されています。フィギュアショーウイルスゲノム内の遺伝子の位置はS。表面タンパク質gp120及びgp41はビリオンの表面にスパイクを構成し、膜融合を実行するためにヒト細胞にお問い合わせください。図の下の部分では、我々のプロトコルで使用されるPCR増幅産物とプライマーが示されています。
ウイルス学研究所で薬剤耐性または向性決定のための分析低ウイルス量（VL）の測定では、ケルン大学（ドイツ）の患者の図3：割合。
図4。実験の全体的なスキーム ..してくださいここをクリックし 、この図の拡大版を見ることができます。
図5。シーケンスはLASERGENEで編集。V3のアンプリコンが少なくともフォワード1と1リバースプライマーを用いて配列決定されています。 LASERGENEは参照配列 "V3-Bのコンセンサス"とenvでシーケンサーから得られた "。ABI"ファイルをalignes。 LASERGENEは、利用可能なすべての行データを使用してコンセンサス配列を作成します。彼らはサンプルコンセンサス配列に寄与しないように、リファレンス·シーケンスは、（そして、灰色で表示されます）マークを付けることができます。
図6。 geno2phenoによって生成された親和性の予測レポート[コレセプター] tool.Theレポートが保存され、コンピュータで完了することができますPDFファイルとして生成されます。追加データなど私たち患者の名前、血液抽出の日付などは、手動でPDF Writerのプログラムを使用して含めることができます。具体的なコメントを追加することもできます。テサロニケ電子データは、ユーザーのコンピュータ上ではなくgeno2pheno [コレセプター]サーバ上に排他的です。してくださいここをクリックし 、この図の拡大版を見ることができます。
Discussion
臨床試験3-9に示すように、V3のシーケンスは、信頼性の高いウイルス親和性の予測を可能にします。実際には、遺伝子型決定が現在のヨーロッパ、ドイツ·オーストリアのガイドライン10に企図されている。
表現型のテストに比べて、だけでなく、短い回転時間（耐性試験に相当）ですが、また、費用のことである。また、遺伝子型検査の主な利点は、結果がFPRのようにグレード分けされているため、患者のニーズに適合させることができるということです。 Trofileの結果は、他の一方で、単にR5またはX4のレポートであり、生データへのアクセスが与えられていない。
オーストリア·ドイツのガイドラインは、個々の患者のニーズ11にカットオフ特にFPRを適応できるようにしながら、現在、欧州のガイドラインでは、20％10のFPRカットオフを示唆している。この行では、抗レトロウイルス薬の選択肢の広い範囲、より高いFPRのカットオフ値（> 20％）の患者さんにrecommアール終了しました。逆に、限られた治療の選択肢を有する重度の事前治療を受けた患者のために、より低いFPRカットオフ（> 5％）を使用することができる。治療指針のこの種は、現在、部分的に活性な薬剤が減少治療の選択肢患者の治療に含めることができるのNRTI、NNRTIを、小僧、INISにテスト抵抗による進行中である。また、遺伝子型誘導療法の変化の成長数字で、臨床的に意義のあるFPRのカットオフ値は常にバイオインフォマティクス、ウイルス学者および臨床家のパネルによって調整されています。
遺伝子型の指向性テストのもう1つの重要な利点は、非常に低い、あるいは検出限界以下のウイルス負荷（VL）を用いた臨床試料を分析の可能性である。この例では、血漿RNAが増幅可能でないときに、プロウイルスDNAを配列決定することができ、信頼性の高い予測9,12に使用されます。注目すべきは、低いか、または検出できないウイルス量の患者数は急激に最新の年で増加している。日付、TへrofileアッセイはVLのみを有する患者からの試料の分析<1000コピー/ mlを可能にします。しかし、予備的研究では、プロウイルスDNAもTrofile 13でテストするadecuateすることができることが示されている。
Disclosures
この動画の記事はのViiVヘルスケア、グラクソ·スミスクライン社が主催しています。
Acknowledgments
著者はコーラス、MedSysの細胞侵入、CHAINとResinaプロジェクトから資金を調達しています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MagNA Pure Compact Nucleic Acid Isolation Kit I | Roche Group | 04 802 993 001 | |
| MagNA Pure Compact System | Roche Group | 03731146001 | |
| T3000 Thermocycler | Biometra | 050-723 | |
| One Step RT-PCR Kit | Qiagen | 210215 | |
| HotStarTaq Master Mix Kit | Qiagen | 203445 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| Exonuclease I (Exo I) | Fermentas | EN0582 | |
| FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase | Fermentas | EF0651 | |
| BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit | Applied Biosystems | 4337457 | |
| Sephadex G-50 Superfine | GE Healthcare | 17-0041-01 | |
| ABI Prism 3130 XL capillary sequencer | Applied Biosystems | 3130XL |
References
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