Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

تصور وظيفة الجهاز التنفسي الميتوكوندريا باستخدام السيتوكروم C أوكسيديز / سكسينات نازعة (كوكس / SDH) مزدوجة وضع العلامات الكيمياء النسيجية

Published: November 23, 2011 doi: 10.3791/3266
Automatic Translation
1,2
1Department of Neuroscience, Karolinska Institutet, 2National Institute on Drug Abuse (NIDA)

Summary

والسيتوكروم أوكسيديز ج / نازعة الصوديوم (كوكس / SDH) المزدوج الوسم الأسلوب يسمح للرؤية مباشرة من الميتوكوندريا القصور التنفسي الانزيم في أقسام الأنسجة الطازجة المجمدة. هذا هو أسلوب مباشر النسيجية ومفيد في التحقيق في أمراض الميتوكوندريا ، والشيخوخة ، والاضطرابات المتصلة بالشيخوخة.

Abstract

الميتوكوندريا الحمض النووي (و mtDNA) العيوب هي سبب هام للمرض ، وربما تكمن وراء الشيخوخة والشيخوخة ذات الصلة 1،2 التعديلات. نظرية الميتوكوندريا الشيخوخة يشير إلى وجود دور للطفرات و mtDNA ، الذي يمكن أن يغير توازن الطاقة الحيوية والوظيفة الخلوية ، في عملية الشيخوخة 3. وقد تم تجميع ثروة من الأدلة لدعم هذا 1،4 الناحية النظرية ، على سبيل المثال يجري mutator 5 و mtDNA الماوس ، ولكن الدور الدقيق للضرر و mtDNA في الشيخوخة ليست مفهومة تماما 6،7.

مراقبة نشاط الانزيمات التنفسية هو نهج واضحة للتحقيق في ضعف الميتوكوندريا. رابعا معقدة ، أو السيتوكروم أوكسيديز ج (كوكس) ، أمر ضروري من أجل وظيفة الميتوكوندريا. يتم ترميز مفارز الحفاز كوكس و mtDNA والتي تعتبر ضرورية لتجميع المجمع (الشكل 1). وبالتالي ، تستند إلى حد كبير التوليف الصحيح والدالة على سلامة و mtDNA 2.رغم أن من الممكن تحقيق المجمعات التنفسية الأخرى ، المجمعات الرابع والثاني هم الأكثر قابلية للفحص النسيجية 8،9. يتم ترميز معقدة تماما الثاني ، أو نازعة سكسينات (SDH) ، عن طريق الحمض النووي (الشكل 1) ، وعادة ما يكون نشاطها لم تتأثر و mtDNA ضعاف ، على الرغم من زيادة قد تشير إلى نشوء حيوي الميتوكوندريا 10-12. لاحظ و mtDNA ضعف في أمراض الميتوكوندريا ، والشيخوخة ، والأمراض المرتبطة بالعمر وغالبا ما يؤدي إلى وجود خلايا للنشاط COX منخفضة أو غائبة 2،12-14. على الرغم من أن يتم التحقيق كوكس وSDH أنشطة فردية ، أثبتت متتابعة المزدوج وسم 15،16 طريقة ليكون من المفيد في تحديد الخلايا التي تحتوي على ضعف الميتوكوندريا 12،17-21.

وقد تم تحديد العديد من الدساتير الأمثل للمقايسة ، مثل تركيز الركيزة ، يقبلون الإلكترون / المتبرعين والناقلين الإلكترون وسيطة ، وتأثير درجة الحموضة ، والتفاعل طنIME 9،22،23. 3،3 '- diaminobenzidine (DAB) هو المانحة الإلكترون فعالة وموثوق بها 22. في الخلايا التي تحتوي على سير كوكس ، فإن البوليمر الناتج البني indamine توطين في أعراف الميتوكوندريا وتشبع الخلايا 22. وبالتالي فإن هذه الخلايا مع كوكس مختلة لا تكون مشبعة بواسطة المنتج DAB ، والسماح للتصور النشاط SDH بتخفيض tetrazolium nitroblue (NBT) ، والمتقبلة الإلكترون ، إلى منتج الأزرق نهاية formazan 9،24. تضاف السيتوكروم ج سكسينات الصوديوم وركائز لتطبيع المستويات المحلية بين السيطرة والأنسجة المريضة / 9 متحولة. الكاتلاز يضاف كاجراء احترازي لتجنب ردود الفعل المحتملة من تلوث النشاط البيروكسيداز 9،22. يستخدم Phenazine methosulfate (PMS) ، حاملة الإلكترون الوسيطة ، بالاشتراك مع أزيد الصوديوم ، مثبط السلسلة التنفسية ، وزيادة في تشكيل منتجات التفاعل النهائي 9،25. على الرغم من ذلك إبلاغأوجه ، وبعض التفاصيل الهامة التي تؤثر على نتيجة الفحص هذه واضحة لائق ، بالإضافة إلى الضوابط المحددة والتقدم في التقنية ، لم يتم تقديمها حتى الآن.

Protocol

1. التحضير لأنسجة cryosectioning

  1. التضحية الحيوانية إما خلع عنق الرحم أو قطع الرأس ، وفقا لتصريح الأخلاقية المتاحة.
  2. جمع الأنسجة بسرعة من الفائدة (على سبيل المثال. الدماغ) ، وتجميد بسرعة على الثلج الجاف (الأنسجة قد تتطلب درجة التجمد في isopentane أو البروبان المبردة مع النتروجين السائل للحصول على التشكل الأمثل). تخزينها في الأنسجة رقائق الألومنيوم في -80 درجة مئوية حتى جاهزة للمقطع.
  3. تضمين الأنسجة المجمدة تمهيدا لcryosectioning.
  4. جمع المقاطع ناظم البرد 14 ميكرومتر في -21 درجة مئوية (قد تحتاج إلى ضبط درجة الحرارة ± 1-2 درجة مئوية). ذوبان الجليد على أبواب الشرائح باستخدام كتلة التدفئة ، والشرائح في مخزن دون coverslipping -20 درجة مئوية حتى جاهزة للاستخدام.

2. كوكس الكيمياء النسيجية

  1. تسمح الشرائح لتجف في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. خفض وضع الشرائح في غرفة الشريحة تلطيخ مع ورق الترشيح الرطب ، إلى شرائح. للحصول على consistenالنتائج طنا في كل تجربة ، فمن المستحسن أن العملية بحد أقصى عشرة شرائح في تجربة لتقليل فترات التأخير.
  2. السيتوكروم 100 ميكرومتر تعد تحت DAB الكيميائية 1X هود ، ج 0.1 درجة الحموضة في برنامج تلفزيوني M = 7.0. الدوامة بسرعة.
  3. إضافة 2 ميكروغرام البقري الكاتلاز (2 ميكروغرام مل -1 أو IU حوالي 4 مل -1). مزيج جيد من قبل vortexing لتفريق جميع الحبوب من الكاتلاز.
  4. تطبيق 150 -- إلى كل شريحة من 200 ميكرولتر المتوسطة الحضانة ، واستخدام ماصة للطرف موزعة بالتساوي على جميع الأقسام.
  5. احتضان الشرائح لمدة 40 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  6. الحل إزالة الزائدة من الشرائح. تغسل الشرائح 4 مرات ، و 10 دقائق في كل مرة ، في 0.1 درجة الحموضة PBS M = 7.0.
  7. عودة إلى الشريحة الشرائح تلطيخ الغرفة بشرائط الورق الرطب.

3. SDH الكيمياء النسيجية

  1. تعد تحت غطاء الكيميائية NBT 1.5 ملم ، 130 ملم سكسينات الصوديوم ، 0.2 PMS ملم ، و 1.0 ملي أزيد الصوديوم في 0.1 درجة الحموضة PBS M = 7.0. الحيطة والحذر لحمايةPMS بعيدا عن الضوء. الدوامة بسرعة.
  2. تطبيق 150-200 ميكروليتر المتوسطة حضانة إلى كل الشرائح ، واستخدام ماصة للطرف موزعة بالتساوي على جميع الأقسام.
  3. احتضان الشرائح لمدة 40 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  4. الحل إزالة الزائدة من الشرائح. تغسل الشرائح 4 مرات ، و 10 دقائق في كل مرة ، في 0.1 درجة الحموضة PBS M = 7.0.
  5. يذوى الشرائح لمدة 2 دقيقة في تركيزات التالية من الايثانول : 70 ٪ ، 70 ٪ ، 95 ٪ ، 95 ٪ ، 99.5 ٪. السماح ثم 10 دقيقة في خطوة إضافية 99.5 ٪.
  6. مكان الشرائح في الزيلين لمدة 10 دقائق. جبل مع Entellan وساترة. السماح للشرائح حتى يجف ساعات خلال الليل ، أو على الأقل 1-2 في منطقة جيدة التهوية.

4. تحديد الخلل الميتوكوندريا

  1. يشار إلى ضعف كمية الميتوكوندريا بمقدار تلطيخ الزرقاء الخلوية. إلى شبه تحديد هذه المبالغ ، ينبغي ترميز الشرائح وتصور تحت المجهر مشرق الميدان. ينبغي أن يقوم على القياس الكمي شبه أعمى باستخدام مقياس أساس ، على سبيل المثال 0-4 (0 ، أي تلطيخ الأزرق ؛ 4 ، تلوين فقط أزرق). فمن الأفضل لتنفيذ هذا النوع من القياس الكمي شبه على عدة أقسام من موضوع معين / الحيوان لحساب القيمة المتوسطة لكل موضوع / الحيوانات.
  2. يجب أن يتم تنفيذ الإحصاءات باستخدام اختبار غير المعلمية ، مثل مان ويتني أو كروسكال واليس.

5. ضوابط خصوصية المناسبة

  1. لضوابط خصوصية للنشاط كوكس ، كرر "كوكس الكيمياء النسيجية" خطوات ، وإضافة 2.5 ملي أزيد الصوديوم ، سلسلة تنفسية مثبط المحطة.
  2. لضوابط خصوصية للنشاط SDH ، كرر "SDH الكيمياء النسيجية" خطوات مع إزالة سكسينات الصوديوم وإضافة المالونات 50 مم ، والمانع التنافسية للSDH.
  3. يغسل ويجفف المقاطع في سلسلة الإيثانول ، وإعداد العدة ثم ساترة الشرائح كما هو موضح في الخطوات 3،4-3،6.

6. ممثل النتائج :

خيمة "> وترد الخطة الشاملة للالأمثلة الممثل كوكس / SDH المزدوج العلامات مقايسة النسيجية هو موضح في الشكل 2. كوكس من الكيمياء النسيجية / SDH المزدوج وضع العلامات المناسبة في أقسام الدماغ من النوع البري والشيخوخة قبل الأوان الفئران mutator و mtDNA في الشكل 3. أظهرت تلوين بني غامق في البرية من نوع الفئران (الشكل 3 ، لوحة على اليسار) العادي كوكس نشاط الخلايا مع سلسلة القصور التنفسي ، التي أشار إليها تلطيخ الأزرق ، والذي كشف في 12 أسبوع من العمر و mtDNA mutator الفئران ، وأصبحت هذه العيوب أكثر انتشارا في الفئران الذين تتراوح أعمارهم بين mutator و mtDNA إلى 46 أسابيع (الشكل 3 ، ومركز اللوحة اليمنى).

وترد أمثلة كوكس / SDH مناسبة مزدوجة وضع العلامات في أقسام الدماغ من الفئران من النوع البري بسبب عدم كفاية العلامات كوكس في الشكل 4. عدم كفاية الوقت لاحتضان هذه التظاهرة من النشاط كوكس ، أو الحد من توافر الأكسجين الجزيئي التي coverslipping الشريحة أثناء الحضانة ، أسفرت عن خفض ترسب من رد فعل DABايون المنتج ، وبالتالي السماح لتشكيل المنتج الأزرق نهاية formazan خلال حضانة SDH.

ويمكن أيضا كوكس SDH وأنشطة يتم التحقيق بشكل منفصل (الشكل رقم 5 ، واليسار والوسط) ، إلا أن العلامات متسلسلة مفيد في تحديد الخلايا التي تحتوي على أوجه القصور كوكس ، ويرجع ذلك إلى تشكيل ليعجل الزرقاء خلال الاحتضان SDH (الشكل 3 ، ومركز اليمين). ويمكن أيضا ضوابط لأنشطة خصوصية كوكس وSDH ينبغي القيام به (الشكل رقم 5 ، والحق).

الشكل 1
الشكل 1. الميتوكوندريا التنفسي المجمعات الرابع. وتقع سلسلة تنفسية الميتوكوندريا داخل الغشاء الداخلي وتشمل خمسة مجمعات. الغرض من هذه السلسلة هو الجهاز التنفسي لنقل الإلكترونات من مجمع من الأول إلى الرابع ، وبذلك يخلق تدرج البروتونات عبر الغشاء الداخلي المستخدمة من قبل مجمع الخامس (أتباز) لإنتاج ATP. أحمر السداسي represeمفارز المشفرة بواسطة NT و mtDNA. السداسي بيضاء تمثل مفارز المشفرة بواسطة الحمض النووي (لاحظ أنه يتم ترميز تماما مجمع الثاني من الجينوم النووي). وبالتالي ، يمكن أن طفرات في الجينوم الميتوكوندريا تسبب خلل في الجهاز التنفسي بسبب سلسلة الطفرات في مفارز من سلسلة مجمعات في الجهاز التنفسي.

الشكل 2
الشكل 2. الرسم البياني للمقايسة كوكس / SDH المزدوج العلامات النسيجية. تشريح أجهزة الفائدة ، وتجميد الأنسجة بسرعة على الثلج الجاف ، وتخزينها في -- 80 درجة مئوية. جمع المقاطع ناظم البرد والحفاظ على -- 20 درجة مئوية حتى الاستخدام. السماح ليجف المقاطع في الهواء في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. إعداد المتوسطة حضانة الكيمياء النسيجية كوكس ، وتطبيق ذلك على الشرائح ، واحتضان لمدة 40 دقيقة عند 37 درجة مئوية. يغسل المقاطع في برنامج تلفزيوني 4 مرات لمدة 10 دقيقة كل غسل. إعداد المتوسطة حضانة الكيمياء النسيجية SDH ، تطبيقه على سليقصر ، واحتضان مرة أخرى لمدة 40 دقيقة عند 37 درجة مئوية. يغسل المقاطع مرة أخرى في برنامج تلفزيوني ، يذوى في سلسلة من الإيثانول ، ومن ثم تحميل وساترة الشرائح. كوكس / SDH المزدوج المسمى المقاطع على استعداد لعرض تحت المجهر مشرق الميدان في غضون 1-2 ساعات.

الشكل 3
الشكل 3 أمثلة ممثل كوكس / SDH المزدوج التوسيم. وصفت بالتسلسل أقسام الدماغ من النوع البري والشيخوخة قبل الأوان الفئران mutator و mtDNA لأنشطة كوكس وSDH. وقد ظهر نشاط عادي كوكس (المشار إليها بواسطة اللون البني الداكن) في قرن آمون من الفئران البرية من نوع (اليسار) : (200 ميكرون شريط مقياس). تم الكشف عن أوجه القصور كوكس (المشار إليها باللون الأزرق) في قرن آمون من الفئران mutator و mtDNA (الوسط واليمين). كان هناك مزيد من الانخفاض في النشاط كوكس بنسبة 46 أسابيع من العمر في الفئران mutator و mtDNA ، مما يشير إلى تفاقم الخلل واسع النطاق للسلسلة في الجهاز التنفسي. لاحظ ميتوسبب الخلل في chondrial و mtDNA mutator الفئران 12 من مستويات عالية من الطفرات نقطة و mtDNA فضلا عن زيادة مستويات الحذف الخطية 5.

الشكل 4
الشكل 4. أمثلة من غير الملائم كوكس / SDH المزدوج التوسيم. وصفت بالتسلسل أقسام الدماغ من الفئران من النوع البري للأنشطة كوكس وSDH. (شريط القياس : 200 ميكرون) أدى عدم كفاية حضانة مرات (10 و 25 دقيقة) للمظاهرة النشاط كوكس في ترسب خفض رد الفعل الناتج البني DAB ، بالمقارنة مع فترة حضانة لمدة 40 دقيقة (يسار ووسط). أوقات حضانة تقصير سمح لتشكيل المنتج الأزرق نهاية formazan خلال حضانة SDH ، مما يوحي بشكل مضلل وجود خلايا مع القصور كوكس. Coverslipping الشرائح خلال حضانة كوكس أسفرت أيضا عن تشكيل غير دقيقة وترسب من رد فعل DABايون المنتج (يمين).

الشكل 5
الشكل 5. أنا ndividual كوكس SDH ووضع العلامات والسيطرة النوعية. وصفت بشكل منفصل من أقسام الدماغ من النوع البري الفئران لأنشطة كوكس والمحددات ، وأشارت حسب اللون البني الداكن واللون الأزرق ، على التوالي (يسار ووسط). بالرغم من أنه يمكن كوكس والأنشطة SDH المسمى بشكل فردي ، أثبت التوسيم متتابعة ليكون من المفيد في تحديد الخلايا التي تحتوي على ضعف الميتوكوندريا. وأظهر مثال على السيطرة النوعية للأنشطة كوكس وSDH في الدماغ من ماوس البرية من نوع غياب العلامات (يمين). (شريط القياس : 200 ميكرون)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

مجتمعة كوكس / SDH النسيجية طريقة تمكن من الخلايا التصور مع ضعف الميتوكوندريا. هذه التقنية ، مع دراسات في وقت مبكر يعود إلى عام 1968 ، لا يزال يتمتع بشعبية ، مع العديد من معتبرا انه "المعيار الذهبي" لتحديد أمراض الميتوكوندريا في المرضى 14،19،26،27. الآن أنها كثيرا ما تستخدم لتحقيق طفرة و mtDNA يحركها الشيخوخة والاضطرابات المتصلة بالشيخوخة 12،13،18،20،21،24. وكثيرا ما يستخدم في كوكس / SDH المزدوج الوسم الأسلوب بالتوازي مع الأساليب الأخرى لتحديد الطفرات و mtDNA محددة ، ومواصلة التحقيق في الإنزيمات الميتوكوندريا الجهاز التنفسي ، مثل القياسات oximetric والتحليل الطيفي انزيم 28،29.

على الرغم من الاستخدام الطويل الأمد والخمسين ، لم التفاصيل المهمة ، وضوابط خصوصية بسيطة ، والسلف لتحسين الأسلوب يتم تقديمها حتى الآن. في ما يخص التعامل مع الأنسجة ، فمن المهم استخدام الطازجة المجمدة مع هذا النسيج techniqرق ، لأنه على الرغم كوكس ستنجو من التثبيت الفورمالين ، وسوف لا SDH. على الرغم من أن هذا هو الحد من هذه التقنية ، وقد تم العثور على أي تأخير في مرحلة ما بعد الوفاة لتتداخل مع هذا الأسلوب 24 ، ولكن يقترح بسرعة لإزالة الأجهزة من الاهتمام للحفاظ على شكلها. ومع ذلك ، ينبغي تجنب استمرار تجميد أذاب دورات للأنسجة والمقاطع. يجوز تجميد عينات الأنسجة على الثلج الجاف ، ولكن قد تتطلب بعض الأنسجة في isopentane تجميد أو تبريد البروبان مع النيتروجين السائل للحصول على التشكل والأمثل لتفادي تجميد التحف. وينبغي أيضا سمك المناسبة من المقاطع ناظم البرد ، اعتمادا على نوع الأنسجة ، ويتم تحديدها بعد. فمن المستحسن لجمع ما بين 8-14 ميكرون ، مقاطع ، رقيقة بما يكفي لاختراق من الحلول ولكن سميكة بما فيه الكفاية للحفاظ على الخصائص التشريحية بعد الجفاف. درجة الحرارة من -21 اقترح ناظم البرد · مايو C تحتاج إلى تعديل ± 1-2 درجة مئوية. إذا كانت العينة الباردة جدا ، قد المقطع حليقة ، إذافمن دافئة جدا ، قد المقطع التمسك سكين. فيما يتعلق بالتعامل مع الشرائح ، واستخدام القلم الشحوم ، والتي غالبا ما تكون مفيدة في الحفاظ على حضانة المتوسطة على الشريحة ، ينبغي تجنبه. بدلا من ذلك ، استخدم 150-200 ميكروليتر من الحضانة لكل شريحة المتوسطة ، اعتمادا على عدد من الأبواب. وينبغي أيضا استعمال ساترة خلال الحضانة حتى يمكن تجنب الانزلاق على استعداد لتركيبها ، لأن الأكسجين الجزيئي يجب أن تكون موجودة خلال هذه الخطوة وضع العلامات كوكس (الشكل 4). أخيرا ، يقترح استخدام الحل DAB المتاحة تجاريا (مثل سيغما) ، بديلا آمنا لإعداد حل DAB من المادة الصلبة البلورية. ويمكن أيضا حل DAB أن تكون مصنوعة من ألواح المتاحة ، ولكن تم العثور على نتائج غير متناسقة وضع العلامات كوكس عندما كان يستخدم هذا الحل القائم على قرص DAB.

للحصول على نتائج متسقة وموثوق بها من هذا الاختبار البيوكيميائية ، وأوصت على النقاط التالية. استخدام برنامج تلفزيوني أعد طازجة والايثانول في كل experimenت. إعداد المخزون من الحلول ج السيتوكروم ، NBT ، PMS (درع من الضوء) ، سكسينات الصوديوم ، وأزيد الصوديوم ، ودرجة الحموضة في 0.1 المالونات PBS = 7.0 م ، وتعديل الرقم الهيدروجيني إلى 7.0 M مع حمض الهيدروكلوريك هيدروكسيد الصوديوم 0.1 أو 0.1 م. قسامة وتخزين حلول السهم عند -20 درجة مئوية ، وذوبان الجليد بسرعة قبل حلول عادلة للاستخدام. للحصول على نتائج ثابتة في كل تجربة ، فمن المستحسن أن العملية بحد أقصى عشرة شرائح في تجربة لتقليل فترات التأخير. هناك بعض التباين بين التجارب ، وبالتالي ، ينبغي تكرار مقاطع من كل موضوع / الحيوان ما لا يقل عن ثلاث إلى أربع مرات ، وينبغي أن تستخدم الضوابط المناسبة في كل تجربة. أخيرا ، كما فعل مرات الحضانة التأثير على كمية كوكس وضع العلامات (الشكل 4 ، لوحات اليسار والوسط) ووضع العلامات SDH ، فمن غير المستحسن أن تختلف أوقات الحضانة أكثر من 5 ٪ (2 دقيقة).

ويستند التقرير الجامع كوكس / SDH بروتوكول المقدمة هنا على المبادئ المذكورة سابقا 9،22،23،25. كما هو الحال معtechnqiues العديد من الاختلافات من هذا البروتوكول ، مثل استبعاد إضافة PMS وأزيد الصوديوم ، وذلك باستخدام mountant مائي ، وتفاوت الحضانة وشطف مرات ، موجودة ، وربما العمل على قدم المساواة أيضا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من قبل المعهد الوطني للشيخوخة (AG04418) ، المعهد الوطني لتعاطي المخدرات ، والمعهد الوطني للصحة من معهد كارولينسكا برنامج الشراكات العليا ، معهد كارولينسكا ، مجلس البحوث السويدية والسويدية كهربائية الدماغ ، والسويدية مؤسسة الدماغ. شكرا جزيلا لKarlen والدكتور ماتياس Coppotelli جوزيبي للحصول على الدعم الخلاق مع الشكل 1 و 2 ، على التوالي ؛ كارين Pernold للحصول على المساعدة التقنية ، والدكاترة. باري ج. هوفر ، لارس أولسون ، ونيلز لارسون ، غوران لنصائح مفيدة كثيرا والمناقشة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dry Ice AGA Gas AB block form
Isopentane (2-methylbutane) Sigma-Aldrich 277258 CAS: 78-78-4
Cyrostat embedding solution Sakura Finetek Tissue Tek 4583
Cryostat Microm International Microm Model HM 500M
Slides Thermo Fisher Scientific, Inc. Super Frost Plus Menzel Gläser J1800AMWZ
Cover glasses Borosilicate glass VWR international 16004-098 24 x 50 mm
Filter Paper Munktell Filter AB Quality: 1350 Article Number: 242 001 430 x 430 mm
3,3′-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) Sigma-Aldrich Sigma Liquid Substrate System, D7304
Cytochrome c (Type III, from equine heart) Sigma-Aldrich C2506 CAS: 9007-43-6
Bovine catalase (from liver) Sigma-Aldrich C9322 CAS: 9001-05-2
Nitroblue tetrazolium (NBT) Sigma-Aldrich N6876 CAS: 298-83-9
Sodium succinate Sigma-Aldrich S2378 CAS: 6106-21-4
Phenazine methosulfate (PMS) Sigma-Aldrich P9625 CAS: 299-11-6 PMS is light sensitive. Shield from light.
Sodium azide Sigma-Aldrich S8032 CAS: 26628-22-8
Xylene VWR international EM-XX0060-4
Entellan VWR international 100503-870
Malonate (Malonic acid) Sigma-Aldrich M1296 CAS: 141-82-2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Larsson, N. G. Somatic mitochondrial DNA mutations in mammalian aging. Annu. Rev. Biochem. 79, 683-706 (2010).
  2. Cottrell, D. A. Role of mitochondrial DNA mutations in disease and aging. Ann. NY Acad. Sci. 908, 199-207 (2000).
  3. Harman, D. The biologic clock: the mitochondria. J. Am. Geriatr. Soc. 20, 145-147 (1972).
  4. Wallace, D. C. Mitochondrial genetics - a paradigm for aging and degenerative diseases. Science. 256, 628-632 (1992).
  5. Trifunovic, A. Premature ageing in mice expressing defective mitochondrial DNA polymerase. Nature. 429, 417-423 (2004).
  6. Ameur, A. Ultra-deep sequencing of mouse mitochondrial DNA: mutational patterns and their origins. PLoS Genet. 7, e1002028-e1002028 (2011).
  7. Safdar, A. Endurance exercise rescues progeroid aging and induces systemic mitochondrial rejuvenation in mtDNA mutator mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 4135-4140 (2011).
  8. DiMauro, S., Bonilla, E., Zeviani, M., Nakagawa, M., DeVivo, D. C. Mitochondrial myopathies. Ann. Neurol. 17, 521-538 (1985).
  9. Old, S. L., Johnson, M. A. Methods of microphotometric assay of succinate dehydrogenase and cytochrome c oxidase activities for use on human skeletal muscle. Histochem. J. 21, 545-555 (1989).
  10. Chaturvedi, R. K. Impaired PGC-1alpha function in muscle in Huntington's disease. Hum. Mol. Genet. 18, 3048-3065 (2009).
  11. Edgar, D. Random point mutations with major effects on protein-coding genes are the driving force behind premature aging in mtDNA mutator mice. Cell. Metab. 10, 131-138 (2009).
  12. Ross, J. M. High brain lactate is a hallmark of aging and caused by a shift in the lactate dehydrogenase A/B ratio. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 20087-20092 (2010).
  13. Crugnola, V. Mitochondrial respiratory chain dysfunction in muscle from patients with amyotrophic lateral sclerosis. Arch. Neurol. 67, 849-854 (2010).
  14. Nonaka, I. Muscle pathology in cytochrome c oxidase deficiency. Acta. Neuropathol. 77, 152-160 (1988).
  15. DiMauro, S. Mitochondrial encephalomyopathies. Neurol. Clin. 8, 483-506 (1990).
  16. Bonilla, E. New morphological approaches to the study of mitochondrial encephalomyopathies. Brain. Pathol. 2, 113-119 (1992).
  17. Brierley, E. J., Johnson, M. A., Lightowlers, R. N., James, O. F., Turnbull, D. M. Role of mitochondrial DNA mutations in human aging: implications for the central nervous system and muscle. Ann. Neurol. 43, 217-223 (1998).
  18. Borthwick, G. M., Johnson, M. A., Ince, P. G., Shaw, P. J., Turnbull, D. M. Mitochondrial enzyme activity in amyotrophic lateral sclerosis: implications for the role of mitochondria in neuronal cell death. Ann. Neurol. 46, 787-790 (1999).
  19. Gellerich, F. N. Mitochondrial respiratory rates and activities of respiratory chain complexes correlate linearly with heteroplasmy of deleted mtDNA without threshold and independently of deletion size. Biochim. Biophys. Acta. 1556, 41-52 (2002).
  20. Larsson, N. G. Mitochondrial transcription factor A is necessary for mtDNA maintenance and embryogenesis in mice. Nat. Genet. 18, 231-236 (1998).
  21. Ekstrand, M. I. Progressive parkinsonism in mice with respiratory-chain-deficient dopamine neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 1325-1330 (2007).
  22. Seligman, A. M., Karnovsky, M. J., Wasserkrug, H. L., Hanker, J. S. Nondroplet ultrastructural demonstration of cytochrome oxidase activity with a polymerizing osmiophilic reagent, diaminobenzidine (DAB). J. Cell. Biol. 38, 1-14 (1968).
  23. Dubowitz, V., Brooke, M. Muscle Biopsy: A Modern Approach. , Saunders. (1973).
  24. Cottrell, D. A. Cytochrome c oxidase deficient cells accumulate in the hippocampus and choroid plexus with age. Neurobiol. Aging. 22, 265-272 (2001).
  25. Blanco, C. E., Sieck, G. C., Edgerton, V. R. Quantitative histochemical determination of succinic dehydrogenase activity in skeletal muscle fibres. Histochem. J. 20, 230-243 (1988).
  26. Moraes, C. T., Ricci, E., Bonilla, E., DiMauro, S., Schon, E. A. The mitochondrial tRNA(Leu(UUR)) mutation in mitochondrial encephalomyopathy, lactic acidosis, and strokelike episodes (MELAS): genetic, biochemical, and morphological correlations in skeletal muscle. Am. J. Hum. Genet. 50, 934-949 (1992).
  27. Petruzzella, V. Extremely high levels of mutant mtDNAs co-localize with cytochrome c oxidase-negative ragged-red fibers in patients harboring a point mutation at nt 3243. Hum. Mol. Genet. 3, 449-454 (1994).
  28. Tulinius, M. H., Holme, E., Kristiansson, B., Larsson, N. G., Oldfors, A. Mitochondrial encephalomyopathies in childhood. I. Biochemical and morphologic investigations. J. Pediatr. 119, 242-250 (1991).
  29. Haas, R. H. The in-depth evaluation of suspected mitochondrial disease. Mol. Genet. Metab. 94, 16-37 (2008).

Tags

الخلوي علم الأحياء ، العدد 57 ، والشيخوخة ، والدماغ ، COX / SDH ، الكيمياء النسيجية ، الميتوكوندريا ، وأمراض الميتوكوندريا ، الميتوكوندريا اختلال وظيفي ، و mtDNA ، و mtDNA الطفرات ، وسلسلة تنفسية
تصور وظيفة الجهاز التنفسي الميتوكوندريا باستخدام السيتوكروم<em> C</em> أوكسيديز / سكسينات نازعة (كوكس / SDH) مزدوجة وضع العلامات الكيمياء النسيجية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ross, J. M. Visualization of… More

Ross, J. M. Visualization of Mitochondrial Respiratory Function using Cytochrome C Oxidase / Succinate Dehydrogenase (COX/SDH) Double-labeling Histochemistry. J. Vis. Exp. (57), e3266, doi:10.3791/3266 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter