Summary
Cytokrom c oksidase / natrium dehydrogenase (COX / SDH) dobbel merking metode gjør det mulig for direkte visualisering av mitokondrie luftveiene enzym mangler i fersk-frosset vev seksjoner. Dette er en grei histochemical teknikk og er nyttig i å undersøke mitokondrie sykdommer, aldring og aldring-relaterte lidelser.
Abstract
Mitokondrie DNA (mtDNA) mangler er en viktig årsak til sykdom, og kan ligge til grunn for aldring og aldring-relaterte endringer 1,2. Mitokondrie teori om aldring antyder en rolle for mtDNA mutasjoner som kan endre bioenergi homeostase og cellulære funksjon, i aldringsprosessen 3. Et vell av bevis er utarbeidet til støtte for denne teorien 1,4, et eksempel er den mtDNA mutator musen 5, men er den presise rolle mtDNA skader i aldring ikke helt forstått 6,7.
Observere aktiviteten av respiratorisk enzymer er en grei metode for å undersøke mitokondriell dysfunksjon. Kompleks IV, eller cytokrom c oksidase (COX), er avgjørende for mitochondrial funksjon. Den katalytiske subenheter av COX er kodet av mtDNA og er viktig for montering av komplekset (figur 1). Dermed er riktig syntese og funksjon i stor grad basert på mtDNA integritet 2.Selv om andre respiratoriske komplekser kan bli etterforsket, Komplekser IV og II er mest mottagelig for histochemical undersøkelse 8,9. Complex II, eller succinate dehydrogenase (SDH), er helt kodet av kjerne-DNA (figur 1), og om aktiviteten er vanligvis ikke påvirket av svekket mtDNA, men en økning kan indikere mitochondrial biogenesis 10-12. Den svekket mtDNA observert i mitokondrie sykdommer, aldring og aldersrelaterte sykdommer som ofte fører til tilstedeværelsen av celler med lav eller fraværende COX aktivitet 2,12-14. Selv om COX og SDH aktiviteter kan undersøkes individuelt, har den sekvensielle dobbel merking metode 15,16 viste seg å være en fordel i å finne celler med mitokondriedysfunksjon 12,17-21.
Mange av optimal forfatninger av analysen vært fastsatt, slik som substrat konsentrasjon, elektron akseptorer / givere, middels elektron bærere, påvirkning av pH, og reaksjonen tIME 9,22,23. 3,3 '-diaminobenzidine (DAB) er en effektiv og pålitelig elektron donor 22. I celler med fungerende COX, vil den brune indamine polymer produktet lokalisere i mitochondrial cristae og mette celler 22. Disse cellene med dysfunksjonelle COX vil derfor ikke bli mettet av DAB produktet, noe som åpner for visualisering av SDH aktivitet ved reduksjon av nitroblue tetrazolium (NBT), et elektron akseptor, til en blå formazanforbindelsen sluttprodukt 9,24. Cytokrom c og natrium succinate underlag legges til normalisere endogene nivåer mellom kontroll og syke / muterte vev 9. Catalase legges til som en forholdsregel for å unngå mulig forurensing reaksjoner fra peroksidase aktivitet 9,22. Phenazine methosulfate (PMS), en mellomliggende elektron carrier, brukes i forbindelse med natriumazid, en respiratoriske kjede hemmer, for å øke dannelsen av den endelige reaksjonen produktene 9,25. Til tross for dette informereasjon, noen kritiske detaljer som påvirker resultatet av denne høvisk enkle analysen, i tillegg til spesifisitet kontroller og fremskritt i teknikken, ennå ikke har blitt presentert.
Protocol
1. Tissue forberedelse for cryosectioning
- Offer dyret enten ved cervikal forvridning eller halshogging, i samsvar med tilgjengelige etiske tillatelse.
- Raskt samle vev av interesse (f.eks. Hjernen), og raskt fryse på tørris (vev kan kreve frysing i isopentan eller propan kjølt med flytende nitrogen for å oppnå optimal morfologi). Oppbevar vev i aluminiumsfolie ved -80 ° C til den er klar til seksjonen.
- Bygg frosset vev i forberedelse for cryosectioning.
- Samle 14-mikrometer cryostat seksjoner ved -21 ° C (må kanskje justere temperaturen ± 1-2 ° C). Tin seksjoner på lysbilder med oppvarming blokk, og lagre lysbilder uten coverslipping ved -20 ° C til den er klar til bruk.
2. COX histochemistry
- La lysbilder tørke i romtemperatur i 1 time. Sett lysbilder i en slide-flekker kammer med vått filter papir, skåret i strimler. For å få consistent resultatene i hvert forsøk, anbefales det å behandle maksimalt ti lysbilder per eksperimentere for å minimere forsinkelser.
- Forbered under en kjemisk hette 1X DAB, cytokrom 100 mM c i 0,1 M PBS pH = 7.0. Vortex raskt.
- Tilsett 2 mikrogram storfe katalase (2 mikrogram ml -1 eller ca 4 IE ml -1). Bland godt av virvling å bryte opp alle korn av katalase.
- Påfør 150-200 mL av inkubering medium til hvert lysbilde, bruke pipettespissen å spre seg jevnt på alle seksjoner.
- Inkuber lysbilder for 40 minutter ved 37 ° C.
- Fjern overflødig løsning fra lysbildene. Vask lysbilder 4 ganger, 10 minutter hver gang, i 0,1 m PBS pH = 7.0.
- Tilbake lysbilder til slide-flekker kammer med vått papir strimler.
3. SDH histochemistry
- Forbered under en kjemisk panseret 1,5 mM NBT, 130 mM natrium succinate, 0,2 mM PMS, og 1,0 mM natriumazid i 0,1 M PBS pH = 7.0. Vær forsiktig å skjermePMS mot lys. Vortex raskt.
- Påfør 150-200 mL av inkubering medium til hvert lysbilde, bruke pipettespissen å spre seg jevnt på alle seksjoner.
- Inkuber lysbilder for 40 minutter ved 37 ° C.
- Fjern overflødig løsning fra lysbildene. Vask lysbilder 4 ganger, 10 minutter hver gang, i 0,1 m PBS pH = 7.0.
- Tørke lysbildene i 2 minutter i følgende konsentrasjoner av etanol: 70%, 70%, 95%, 95%, 99,5%. Så ta 10 minutter i en ytterligere 99,5% trinn.
- Plasser lysbilder i xylen i 10 minutter. Monter med Entellan og dekkglass. La lysbilder å tørke over natten eller minst 1-2 timer i et ventilert område.
Fire. Fastsettelse av mitokondriell dysfunksjon
- Mengden av mitokondriell dysfunksjon er indikert av mengden av cellulære blå flekker. For semi-kvantifisere disse beløpene, bør slides kodes og visualisert i sterkt felt mikroskopi. Semi-kvantifisering bør utføres på en blind basis ved hjelp av en skala, for eksempel 0-4 (0, ingen blå flekker, 4, bare blå flekker). Det er best å utføre denne typen semi-kvantifisering på flere seksjoner fra et gitt emne / dyr å beregne en middelverdi for hvert fag / dyr.
- Statistikk bør utføres med et ikke-parametrisk test, som Mann-Whitney eller Kruskal-Wallis.
5. Passende spesifisitet kontroller
- For spesifisitet kontroller for COX aktivitet, gjenta "COX histochemistry" trinn, og legg til 2,5 mm natriumazid, en terminal respiratoriske kjede hemmer.
- For spesifisitet kontroller for SDH aktivitet, gjenta "SDH histochemistry" trinn med fjerning av natrium succinate og tillegg av 50 mM malonate, en kompetitiv hemmer av SDH.
- Vask og dehydrate seksjoner i en etanol-serien, og deretter montere og dekkglass lysbildene som beskrevet i trinn 3.4 til 3.6.
Seks. Representant Resultater:
telt "> Den generelle ordningen av COX / SDH dobbel merking histochemical analysen er illustrert i figur 2. Representative eksempler på egnede COX / SDH dobbel merking histochemistry i hjernen seksjoner fra vill-type og for tidlig aldring mtDNA mutator mus er vist i figur 3. Den mørke brune flekker i villtype mus (figur 3, venstre panel) viste normal COX aktivitet. Celler med respiratoriske kjede mangler, indikert ved den blå flekker, ble avslørt i 12 uker gamle mtDNA mutator mus, og disse manglene ble mer utbredt som mtDNA mutator mus alderen til 46 uker (figur 3, senter og høyre panel).Eksempler på upassende COX / SDH dobbel-merking i hjernen seksjoner fra villtype mus på grunn av utilstrekkelige COX merking er vist i figur 4.. Utilstrekkelig inkubasjonstid for demonstrasjon av COX aktivitet, eller redusere tilgjengeligheten av molekylært oksygen ved coverslipping raset under inkubering, resulterte i en redusert deponering av DAB reagereion produkt, og dermed åpnet for dannelsen av den blå formazanforbindelsen sluttproduktet løpet av SDH inkubering.
COX-og SDH aktiviteter kan også undersøkes separat (figur 5, venstre og midten), men er sekvensiell merking nyttig for å identifisere celler med COX mangler, på grunn av dannelsen av den blå bunnfallet under SDH inkubering (figur 3, senter og høyre). Spesifisitet kontroller for COX-og SDH aktiviteter kan også gjøres (Figur 5, høyre).
Figur 1. Mitokondriell luftveiene Komplekser IV. Mitokondrie respiratoriske kjeden ligger innenfor den indre membran og inneholder fem komplekser. Formålet med respiratoriske kjeden er å transportere elektroner fra Complex jeg til IV og da det skaper en proton gradient over den indre membranen brukes av Complex V (ATPase) til å produsere ATP. Red sekskanter represent subenheter kodet av mtDNA. Hvit sekskanter representerer subenheter kodet av kjerne-DNA (merk at Complex II er helt kodet fra kjernefysiske genom). Dermed kan mutasjoner i mitokondrie genomet årsaken dysfunksjon i luftveiene kjedet på grunn av mutasjoner i subenheter av respiratoriske kjeden komplekser.
Figur 2. Flow diagram av COX / SDH dobbel merking histochemical analysen. Dissekere organene av interesse, raskt fryse vevet på tørris, og lagre dem på - 80 ° C. Samle cryostat seksjoner og holde ved - 20 ° C før bruk. La seksjoner å lufttørke i romtemperatur i 1 time. Klargjør inkubering medium for COX histochemistry, gjelder det til lysbilder og inkuberes i 40 minutter ved 37 ° C. Vask delene i PBS 4 ganger i 10 minutter hver vask. Klargjør inkubering medium for SDH histochemistry, gjelder den til SLIdes, og igjen inkuberes i 40 minutter ved 37 ° C. Vask delene igjen i PBS, tørke i en etanol-serien, og deretter montere og dekkglass lysbildene. Den COX / SDH dobbel-merket seksjoner er klar for å vise i sterkt felt mikroskopi innen 1-2 timer.
Figur 3. Representative eksempler på COX / SDH dobbel-merking. Brain seksjoner fra vill-type og for tidlig aldring mtDNA mutator mus ble sekvensielt merket for COX-og SDH aktiviteter. (Scale bar:. 200 mikrometer) Normal COX aktivitet (angitt med mørk brun farge) ble vist i hippocampus fra villtype mus (venstre). COX mangler (angitt med blå farge) ble åpenbart i hippocampus fra mtDNA mutator mus (senter og høyre). Det var en ytterligere nedgang i COX aktivitet med 46 ukers alder i mtDNA mutator mus, noe som tyder på utbredt forverring av respiratorisk kjeden dysfunksjon. Den observerte Mitochondrial dysfunksjon i mtDNA mutator mus 12 er forårsaket av høye nivåer av mtDNA punktmutasjoner samt økte nivåer av lineære overstrykninger 5.
Figur 4. Eksempler på upassende COX / SDH dobbel-merking. Brain seksjoner fra villtype mus ble sekvensielt merket for COX-og SDH aktiviteter. (Scale bar:. 200 mikrometer) Utilstrekkelig inkubasjonstider (10 og 25 minutter) for påvisning av COX aktivitet resulterte i en redusert deponering av det brune DAB reaksjonen produktet, sammenlignet med 40-minutters inkubasjonstid (venstre og midten). Den forkortede inkubasjonstider tillatt for dannelsen av den blå formazanforbindelsen sluttproduktet løpet av SDH inkubasjon villedende tyder på tilstedeværelsen av celler med COX mangler. Coverslipping lysbildene under COX inkubering også resultert i unøyaktige formasjon og deponering av DAB reagereion produkt (høyre).
Figur 5. Jeg ndividual COX og SDH merking og spesifisitet kontroll. Brain seksjoner fra villtype mus ble særskilt merket for COX-og SDH aktiviteter, angitt med mørk brun farge og den blå fargen, henholdsvis (venstre og midten). Selv om COX og SDH aktiviteter kan være individuelt merket, har sekvensiell merking viste seg å være en fordel i å finne celler med mitokondriell dysfunksjon. Et eksempel på en spesifisitet kontroll for COX og SDH aktiviteter i hjernen fra en vill-type mus viste fravær av merking (høyre). (Scale bar:. 200 mikrometer)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den kombinerte COX / SDH histochemical metoden muliggjør visualisering av cellene med mitokondriell dysfunksjon. Denne teknikken, med tidlige studier som kan dateres tilbake til 1968, fortsatt populær, og mange vurderer det "gullstandard" for å identifisere mitokondrielle sykdommer hos pasienter 14,19,26,27. Det er nå ofte brukt for å undersøke mtDNA mutasjon-drevet aldring og aldring-relaterte lidelser 12,13,18,20,21,24. Den COX / SDH dobbel merking metoden er ofte brukt parallelt med andre teknikker for å identifisere spesifikke mtDNA mutasjoner og ytterligere undersøke mitokondrie respiratoriske enzymer, slik som oximetric målinger og spektrofotometriske enzym analyse 28,29.
På tross av sin mangeårige bruk, har viktige detaljer, enkel spesifisitet kontroller og fremskritt for å forbedre metoden ennå ikke blitt presentert. I forhold til håndtering av vev, er det viktig å bruke frisk-frosne vev med dette technique, fordi selv om COX vil overleve formalin fiksering, SDH vil ikke. Selv om dette er en begrensning av teknikken, har ingen post-mortem forsinkelse funnet å forstyrre denne metoden 24, men det er foreslått å raskt fjerne organer av interesse å bevare morfologi. Imidlertid bør kontinuerlig fryse-tine sykluser av vev og seksjoner unngås. Vevsprøver kan være frosset på tørris, men kan noen vev kreve frysing i isopentan eller propan kjøles med flytende nitrogen for å oppnå optimal morfologi og for å unngå frysing artefakter. Den passende tykkelse cryostat deler, avhengig av vev-type, bør også bestemmes. Det anbefales å samle mellom 8 - 14-mikrometer seksjoner, tynn nok for penetrasjon av løsningene, men tykk nok til å bevare anatomiske trekk etter dehydrering. De foreslåtte cryostat temperatur på -21 ° C må kanskje justeres ± 1-2 ° C. Hvis prøven er for kaldt, kan den delen curl, hvisdet er for varmt, kan seksjonen holde seg til kniven. Med hensyn til håndtering av lysbildene, bruk av fett penn, som ofte er gunstig å holde inkubasjonstiden medium på lysbildet, bør unngås. I stedet bruker 150-200 mL av inkubering medium per lysbilde, avhengig av antall seksjoner. Bruken av et dekkglass under inkubasjon bør også unngås inntil lysbildet er klar til å monteres, fordi molekylært oksygen må være til stede under COX merking trinn (figur 4). Endelig er det foreslått å bruke kommersielt tilgjengelige DAB-løsning (f.eks Sigma), et tryggere alternativ til å lage DAB-løsning fra krystallinske solid. DAB-løsning kan også være laget av tilgjengelig tabletter, men inkonsistente COX merking resultater ble funnet ved denne tablett-baserte DAB løsningen ble brukt.
For å få konsekvente og pålitelige resultater fra denne biokjemiske analysen, er følgende punkter anbefales. Bruk nylagde PBS og etanol i hver experiment. Forbered lager løsninger av cytokrom c, NBT, PMS (skjerme mot lys), natrium succinate, natriumazid, og malonate i 0,1 M PBS pH = 7.0, justere pH til 7,0 med 0,1 M HCl eller 0,1 M NaOH. Delmengde og lagre stamløsninger ved -20 ° C, og raskt tine løsningene like før bruk. For å oppnå konsistente resultater i hvert forsøk, anbefales det å behandle maksimalt ti lysbilder per eksperimentere for å minimere forsinkelser. Det er noe variasjon mellom eksperimenter, og derfor bør seksjoner fra hvert fag / dyr gjentas minst tre til fire ganger, og egnede kontroller bør brukes i hvert forsøk. Til slutt, da inkubasjonstider gjør påvirker mengden av COX-merking (Figur 4, venstre og midten paneler) og SDH-merking, er det ikke anbefalt å variere inkubasjonstider med mer enn 5% (2 min).
Den kombinerte COX / SDH protokoll som presenteres her er basert på prinsipper beskrevet tidligere 9,22,23,25. Som medmange technqiues, varianter av denne protokoll, for eksempel eksklusive tillegg av PMS og natriumazid, ved hjelp av en vandig mountant, og varierende inkubering og skyll tider, finnes og kan fungere like godt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Institute of Aging (AG04418), National Institute on Drug Abuse, National Institute of Health-Karolinska Institutet Graduate Partnerships Program, Karolinska Institutet, svensk Forskningsrådet, svensk Brain Power, og svensk Brain Foundation. Mange takk til Mattias Karlen og Dr. Giuseppe Coppotelli for kreative støtte med Figur 1 og 2, henholdsvis; Karin Pernold for teknisk assistanse, og Drs. Barry J. Hoffer, Lars Olson og Nils-Göran Larsson for mye nyttige råd og diskusjon.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Dry Ice | AGA Gas AB | block form | |
Isopentane (2-methylbutane) | Sigma-Aldrich | 277258 CAS: 78-78-4 | |
Cyrostat embedding solution | Sakura Finetek | Tissue Tek 4583 | |
Cryostat | Microm International | Microm Model HM 500M | |
Slides | Thermo Fisher Scientific, Inc. | Super Frost Plus Menzel Gläser J1800AMWZ | |
Cover glasses Borosilicate glass | VWR international | 16004-098 | 24 x 50 mm |
Filter Paper | Munktell Filter AB | Quality: 1350 Article Number: 242 001 | 430 x 430 mm |
3,3′-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) | Sigma-Aldrich | Sigma Liquid Substrate System, D7304 | |
Cytochrome c (Type III, from equine heart) | Sigma-Aldrich | C2506 CAS: 9007-43-6 | |
Bovine catalase (from liver) | Sigma-Aldrich | C9322 CAS: 9001-05-2 | |
Nitroblue tetrazolium (NBT) | Sigma-Aldrich | N6876 CAS: 298-83-9 | |
Sodium succinate | Sigma-Aldrich | S2378 CAS: 6106-21-4 | |
Phenazine methosulfate (PMS) | Sigma-Aldrich | P9625 CAS: 299-11-6 | PMS is light sensitive. Shield from light. |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 CAS: 26628-22-8 | |
Xylene | VWR international | EM-XX0060-4 | |
Entellan | VWR international | 100503-870 | |
Malonate (Malonic acid) | Sigma-Aldrich | M1296 CAS: 141-82-2 |
References
- Larsson, N. G. Somatic mitochondrial DNA mutations in mammalian aging. Annu. Rev. Biochem. 79, 683-706 (2010).
- Cottrell, D. A. Role of mitochondrial DNA mutations in disease and aging. Ann. NY Acad. Sci. 908, 199-207 (2000).
- Harman, D.
The biologic clock: the mitochondria. J. Am. Geriatr. Soc. 20, 145-147 (1972). - Wallace, D. C. Mitochondrial genetics - a paradigm for aging and degenerative diseases. Science. 256, 628-632 (1992).
- Trifunovic, A. Premature ageing in mice expressing defective mitochondrial DNA polymerase. Nature. 429, 417-423 (2004).
- Ameur, A. Ultra-deep sequencing of mouse mitochondrial DNA: mutational patterns and their origins. PLoS Genet. 7, e1002028-e1002028 (2011).
- Safdar, A. Endurance exercise rescues progeroid aging and induces systemic mitochondrial rejuvenation in mtDNA mutator mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 4135-4140 (2011).
- DiMauro, S., Bonilla, E., Zeviani, M., Nakagawa, M., DeVivo, D. C.
Mitochondrial myopathies. Ann. Neurol. 17, 521-538 (1985). - Old, S. L., Johnson, M. A. Methods of microphotometric assay of succinate dehydrogenase and cytochrome c oxidase activities for use on human skeletal muscle. Histochem. J. 21, 545-555 (1989).
- Chaturvedi, R. K. Impaired PGC-1alpha function in muscle in Huntington's disease. Hum. Mol. Genet. 18, 3048-3065 (2009).
- Edgar, D. Random point mutations with major effects on protein-coding genes are the driving force behind premature aging in mtDNA mutator mice. Cell. Metab. 10, 131-138 (2009).
- Ross, J. M. High brain lactate is a hallmark of aging and caused by a shift in the lactate dehydrogenase A/B ratio. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 20087-20092 (2010).
- Crugnola, V. Mitochondrial respiratory chain dysfunction in muscle from patients with amyotrophic lateral sclerosis. Arch. Neurol. 67, 849-854 (2010).
- Nonaka, I. Muscle pathology in cytochrome c oxidase deficiency. Acta. Neuropathol. 77, 152-160 (1988).
- DiMauro, S.
Mitochondrial encephalomyopathies. Neurol. Clin. 8, 483-506 (1990). - Bonilla, E. New morphological approaches to the study of mitochondrial encephalomyopathies. Brain. Pathol. 2, 113-119 (1992).
- Brierley, E. J., Johnson, M. A., Lightowlers, R. N., James, O. F., Turnbull, D. M. Role of mitochondrial DNA mutations in human aging: implications for the central nervous system and muscle. Ann. Neurol. 43, 217-223 (1998).
- Borthwick, G. M., Johnson, M. A., Ince, P. G., Shaw, P. J., Turnbull, D. M. Mitochondrial enzyme activity in amyotrophic lateral sclerosis: implications for the role of mitochondria in neuronal cell death. Ann. Neurol. 46, 787-790 (1999).
- Gellerich, F. N. Mitochondrial respiratory rates and activities of respiratory chain complexes correlate linearly with heteroplasmy of deleted mtDNA without threshold and independently of deletion size. Biochim. Biophys. Acta. 1556, 41-52 (2002).
- Larsson, N. G. Mitochondrial transcription factor A is necessary for mtDNA maintenance and embryogenesis in mice. Nat. Genet. 18, 231-236 (1998).
- Ekstrand, M. I. Progressive parkinsonism in mice with respiratory-chain-deficient dopamine neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 1325-1330 (2007).
- Seligman, A. M., Karnovsky, M. J., Wasserkrug, H. L., Hanker, J. S. Nondroplet ultrastructural demonstration of cytochrome oxidase activity with a polymerizing osmiophilic reagent, diaminobenzidine (DAB). J. Cell. Biol. 38, 1-14 (1968).
- Dubowitz, V., Brooke, M. Muscle Biopsy: A Modern Approach. , Saunders. (1973).
- Cottrell, D. A. Cytochrome c oxidase deficient cells accumulate in the hippocampus and choroid plexus with age. Neurobiol. Aging. 22, 265-272 (2001).
- Blanco, C. E., Sieck, G. C., Edgerton, V. R. Quantitative histochemical determination of succinic dehydrogenase activity in skeletal muscle fibres. Histochem. J. 20, 230-243 (1988).
- Moraes, C. T., Ricci, E., Bonilla, E., DiMauro, S., Schon, E. A. The mitochondrial tRNA(Leu(UUR)) mutation in mitochondrial encephalomyopathy, lactic acidosis, and strokelike episodes (MELAS): genetic, biochemical, and morphological correlations in skeletal muscle. Am. J. Hum. Genet. 50, 934-949 (1992).
- Petruzzella, V. Extremely high levels of mutant mtDNAs co-localize with cytochrome c oxidase-negative ragged-red fibers in patients harboring a point mutation at nt 3243. Hum. Mol. Genet. 3, 449-454 (1994).
- Tulinius, M. H., Holme, E., Kristiansson, B., Larsson, N. G., Oldfors, A. Mitochondrial encephalomyopathies in childhood. I. Biochemical and morphologic investigations. J. Pediatr. 119, 242-250 (1991).
- Haas, R. H. The in-depth evaluation of suspected mitochondrial disease. Mol. Genet. Metab. 94, 16-37 (2008).