Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Visualisering af Mitokondriel Respiratorisk funktion ved hjælp af cytochrom C Oxidase / succinat dehydrogenase (COX / SDH) Dobbelt-mærkning Histochemistry

Published: November 23, 2011 doi: 10.3791/3266
Automatic Translation
1,2
1Department of Neuroscience, Karolinska Institutet, 2National Institute on Drug Abuse (NIDA)

Summary

Cytochrom c oxidase / natrium dehydrogenase (COX / SDH) double-mærkning metode giver mulighed for direkte visualisering af mitokondrie respiratoriske enzym mangler i fersk-frosne vævssnit. Dette er en ligetil histokemiske teknik og er nyttig i at undersøge mitokondrie-sygdomme, aldring og aldersrelaterede sygdomme.

Abstract

Mitokondrie-DNA (mtDNA) mangler er en vigtig årsag til sygdom og kan ligge til grund aldring og aldersrelaterede forandringer 1,2. Den mitokondrie teori om aldring antyder en rolle for mtDNA mutationer, som kan ændre bioenergetik homeostase og cellulære funktion i aldringsprocessen 3. Et væld af beviser er blevet udarbejdet til støtte for denne teori 1,4, et eksempel er den mtDNA mutator musen 5, men den nøjagtige rolle mtDNA skade i aldring er ikke helt forstået 6,7.

Observere aktiviteten af ​​luftvejene enzymer er en enkel metode til undersøgelse af mitokondriel dysfunktion. Kompleks IV, eller cytochrom c oxidase (COX), er afgørende for mitokondrie-funktion. Den katalytiske subunits af COX er kodet af mtDNA og er afgørende for samling af de komplekse (Figur 1). Således er ordentlig syntese og funktion i vid udstrækning baseret på mtDNA integritet 2.Selv om andre respiratoriske komplekser kunne undersøges, komplekser IV og II er de mest modtagelig for histokemiske eksamen 8,9. Complex II, eller succinat dehydrogenase (SDH), er helt kodet af nukleare DNA (figur 1), og dets aktivitet er typisk ikke påvirkes af nedsat mtDNA, selv om en stigning kunne tyde mitokondrie biogenese 10-12. Den nedskrevne mtDNA observeret i mitokondrie-sygdomme, aldring og aldersrelaterede sygdomme ofte fører til tilstedeværelsen af celler med lav eller ingen COX aktivitet 2,12-14. Selvom COX og SDH aktiviteter kan blive undersøgt individuelt, har den sekventielle dobbelt-mærkning metode 15,16 viste sig at være en fordel med at finde celler med mitokondriel dysfunktion 12,17-21.

Mange af de optimale forfatninger analysen er fastlagt, så som substrat koncentration, elektronacceptorer / donorer, mellemliggende elektron luftfartsselskaber, indflydelse af pH, og reaktionen tIME 9,22,23. 3,3 '-diaminobenzidin (DAB) er en effektiv og pålidelig elektron donor-22. I celler med fungerende COX, vil den brune indamine polymer produkt lokalisere i mitokondrie cristae og mætte celler 22. Disse celler med dysfunktionelle COX vil derfor ikke blive mættet af DAB-produkt, der giver mulighed for visualisering af SDH aktivitet ved reduktion af nitroblue tetrazolium (NBT), en elektron acceptor, at en blå formazan slutprodukt 9,24. Cytokrom c og natrium succinat substrater er tilføjet til normalisere endogene niveauer mellem kontrol og syge / mutant væv 9. Katalase er tilføjet som en sikkerhedsforanstaltning for at undgå en eventuel forurening reaktioner fra peroxidaseaktivitet 9,22. Phenazine methosulfate (PMS), en mellemliggende elektron luftfartsselskab, der bruges i forbindelse med natriumazid, en respiratorisk kæde-hæmmer, for at øge dannelsen af den endelige reaktionsprodukter 9,25. På trods af dette informereation, nogle kritiske detaljer, der påvirker resultatet af denne sømmelig ligetil assay, foruden specificitet kontrol og fremskridt i teknikken, er endnu ikke blevet præsenteret.

Protocol

1. Væv forberedelse til cryosectioning

  1. Offer dyret enten ved cervikal dislokation eller halshugning, i overensstemmelse med tilgængelige etiske tilladelse.
  2. Hurtigt at indsamle væv af interesse (f.eks. Hjernen), og hurtigt fryse på tøris (væv, der kan kræve frysning i isopentan eller propan kølet med flydende kvælstof for at opnå optimal morfologi). Store væv i alufolie ved -80 ° C, indtil klar til afsnittet.
  3. Integrer frosset væv som forberedelse til cryosectioning.
  4. Saml 14-μm kryostat sektioner ved -21 ° C (kan være nødvendigt at justere temperatur ± 1-2 ° C). Optø sektioner på dias ved hjælp af varmeblok, og opbevar dias uden dækglas ved -20 ° C, indtil klar til brug.

2. COX histochemistry

  1. Lad dias til tørre ved stuetemperatur i 1 time. Sæt dias i et dias-farvning kammer med vådt filtrerpapir, skåret i strimler. For at opnå consistent resultaterne i hvert eksperiment, anbefales det at behandle en højst ti dias pr eksperiment for at minimere forsinkelser.
  2. Forbered under en kemisk hætte 1X DAB, 100 mM cytochrom c i 0,1 M PBS pH = 7,0. Vortex hurtigt.
  3. Tilsæt 2 mg kvæg katalase (2 mg ml -1 eller ca 4 IU ml -1). Bland grundigt ved hvirvelblanding til at bryde op alle de kerner af katalase.
  4. Anvend 150 til 200 μL af inkuberingsmedium til hvert dias, skal du bruge pipette tip at sprede sig jævnt på alle dele.
  5. Inkuber slides i 40 minutter ved 37 ° C.
  6. Fjern overskydende opløsning fra dias. Vask dias 4 gange, 10 minutter hver gang, i 0,1 M PBS pH = 7,0.
  7. Retur dias til at glide-farvning kammer med våde papirstrimler.

3. SDH histochemistry

  1. Forbered under en kemisk hætte 1,5 mm NBT, 130 mm natrium succinat, 0,2 mM PMS, og 1,0 mM natriumazid i 0,1 M PBS pH = 7,0. Tag forsigtighed til at beskyttePMS mod lys. Vortex hurtigt.
  2. Påfør 150-200 μL af inkuberingsmedium til hvert dias, skal du bruge pipette tip at sprede sig jævnt på alle dele.
  3. Inkuber slides i 40 minutter ved 37 ° C.
  4. Fjern overskydende opløsning fra dias. Vask dias 4 gange, 10 minutter hver gang, i 0,1 M PBS pH = 7,0.
  5. Dehydreres dias i 2 minutter i følgende koncentrationer af ethanol: 70%, 70%, 95%, 95%, 99,5%. Så tillader 10 minutter i et yderligere 99,5% trin.
  6. Anbring objektglassene i xylen i 10 minutter. Monter med Entellan og dækglas. Lad dias til tørre natten over, eller mindst 1-2 timer i et ventileret område.

4. Bestemmelse om mitokondriel dysfunktion

  1. Mængden af ​​mitokondriel dysfunktion er indiceret ved mængden af ​​cellulære blå farvning. Til semi-kvantificere disse beløb, bør slides kodes og visualiseres under lyse-felt mikroskopi. Semi-kvantificering bør udføres på en blind grundlag ved hjælp af en skala, for eksempel 0-4 (0, ingen blå pletter, 4, kun blå farvning). Det er bedst at udføre denne form for semi-kvantificering af flere sektioner fra et givent emne / dyr til at beregne en gennemsnitlig værdi for hvert emne / dyr.
  2. Statistik skal udføres med en ikke-parametrisk test, som Mann-Whitney eller Kruskal-Wallis.

5. Passende specificitet kontrol

  1. For specificitet styringer til COX aktivitet, gentag "COX histochemistry" skridt, og tilføj 2,5 mm natriumazid, en terminal respiratorisk kæde-hæmmer.
  2. For specificitet styringer til SDH aktivitet, gentag "SDH histochemistry" trin med fjernelse af natrium succinat og tilføjelsen af ​​50 mM malonate, en kompetitiv hæmmer af SDH.
  3. Vask og dehydrerer sektioner i en ethanol-serien, og derefter montere og dækglas de dias, som beskrevet i trin fra 3,4 til 3,6.

6. Repræsentative resultater:

telt "> Den overordnede opbygning af de COX / SDH dobbelt-mærkning histokemiske assay er illustreret i figur 2. Repræsentative eksempler på passende COX / SDH dobbelt-mærkning histochemistry i hjernen sektioner af wild-type og tidlig aldring mtDNA mutator mus er vist i figur 3. De mørke brune farvning i wild-type mus (Figur 3, venstre panel) viste normale COX aktivitet. Celler med respiratoriske kæde mangler, angivet ved den blå farvning, blev afsløret i 12 uger gamle mtDNA mutator mus, og disse mangler blev mere udbredt som mtDNA mutator mus alderen til 46 uger (Figur 3, center og højre panel).

Eksempler på uhensigtsmæssig COX / SDH dobbelt-mærkning i hjernen sektioner af wild-type mus på grund af utilstrækkelig COX mærkning er vist i figur 4. Utilstrækkelig inkubation tid til demonstration af COX aktivitet, eller reducerer tilgængeligheden af ​​molekylær ilt dækglas slide under inkubation, resulterede i en reduceret deposition af DAB reagererion produkt, og dermed gav mulighed for dannelse af det blå formazan slutproduktet i løbet af SDH inkubation.

COX-og SDH aktiviteter kan også undersøges særskilt (Figur 5, venstre og midten), men den sekventielle mærkning er nyttigt at identificere celler med COX mangler, på grund af dannelsen af ​​det blå bundfald under SDH inkubering (Figur 3, center-og til højre). Specificitet styringer til COX-og SDH aktiviteter kan også ske (Figur 5, højre).

Figur 1
Figur 1. Mitokondriel respiratoriske Komplekser IV. Den mitokondrie respiratoriske kæde er beliggende i den indre membran og omfatter fem komplekser. Formålet med respiratoriske kæden er at transportere elektroner fra kompleks I-IV og dermed skaber det en proton gradient over den indre membran, der anvendes af Complex V (ATPase) til at producere ATP. Red sekskanter represent subunits kodes af mtDNA. Hvid sekskanter repræsenterer subunits kodet af nukleare DNA (bemærk, at Complex II er helt kodet fra det nukleare genom). Således kunne mutationer i det mitokondrielle genom forårsage dysfunktion af det respiratoriske kæden på grund af mutationer i subunits af respiratoriske kæde komplekser.

Figur 2
Figur 2. Flow diagram af COX / SDH dobbelt-mærkning histokemiske analysen. Dissekere organer af interesse, hurtigt fryse væv på tøris, og opbevar dem på - 80 ° C. Saml kryostat sektioner og holde ved - 20 ° C indtil brug. Lad sektioner lufttørre ved stuetemperatur i 1 time. Forbered inkuberingsmedium for COX histochemistry, gælder det til dias, og inkuber i 40 minutter ved 37 ° C. Vask sektioner i PBS 4 gange i 10 minutter hver vask. Forbered inkuberingsmedium for SDH histochemistry, gælder det til SLIdes, og igen inkuber i 40 minutter ved 37 ° C. Vask afsnittene igen i PBS, tørrer i en ethanol-serien, og derefter montere og dækglas dias. Den COX / SDH dobbelt-mærket sektioner er klar til at se under lyse-felt mikroskopi inden for 1-2 timer.

Figur 3
Figur 3. Repræsentative eksempler på COX / SDH dobbelt-mærkning. Brain sektioner af wild-type og tidlig aldring mtDNA mutator mus var sekventielt mærket for COX-og SDH aktiviteter. (Skala bar:. 200 μm) Normal COX aktivitet (markeret med mørk brun farve) blev vist i hippocampus af wild-type mus (til venstre). COX mangler (angivet med blå farve) blev afsløret i hippocampus fra mtDNA mutator mus (i midten og højre). Der var et yderligere fald i COX aktivitet med 46 ugers alderen i mtDNA mutator mus, hvilket tyder på udbredt forværring af respiratoriske kæde dysfunktion. Den observerede Mitochondrial dysfunktion i mtDNA mutator mus 12 er forårsaget af høje niveauer af mtDNA punktmutationer samt forhøjet indhold af lineære sletninger 5.

Figur 4
Figur 4. Eksempler på uhensigtsmæssige COX / SDH dobbelt-mærkning. Brain sektioner af wild-type mus var sekventielt mærket for COX-og SDH aktiviteter. (Skala bar:. 200 μm) Utilstrækkelig inkubationstider (10 og 25 minutter) til demonstration af COX aktivitet resulterede i en reduceret deposition af de brune DAB reaktionsprodukt, sammenlignet med 40-minutters inkubation tid (venstre og midten). Den forkortede inkubationstider tilladt for dannelsen af ​​den blå formazan slutproduktet under SDH inkubation, misvisende tyder på tilstedeværelsen af ​​celler med COX mangler. Dækglas objektglassene i løbet af COX inkubation også resulterede i unøjagtige dannelse og deposition af de DAB reagererion produkt (til højre).

Figur 5
Figur 5. Jeg ndividual COX og SDH mærkning og specificitet kontrol. Brain sektioner af wild-type mus var særskilt mærket for COX-og SDH aktiviteter, angivet ved den mørke brune farve og den blå farve, hhv (venstre og midten). Selvom COX og SDH aktiviteter kan være individuelt mærket, har den sekventielle mærkning viste sig at være fordelagtig i lokalisering celler med mitokondriel dysfunktion. Et eksempel på en specificitet kontrol for COX-og SDH aktiviteter i hjernen fra en vild-type mus viste mangel på mærkning (til højre). (Skala bar:. 200 μm)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den kombinerede COX / SDH histokemiske metode gør det muligt for visualisering af celler med mitokondriel dysfunktion. Denne teknik, med tidlige undersøgelser helt tilbage til 1968, er stadig populær, og mange overvejer det "gold standard" for at identificere mitokondrielle sygdomme hos patienter, 14,19,26,27. Det er nu ofte bruges til at undersøge mtDNA-mutation-drevet aldring og aldersrelaterede sygdomme 12,13,18,20,21,24. Den COX / SDH dobbelt-mærkning metode anvendes ofte parallelt med andre teknikker til at identificere specifikke mtDNA mutationer, og for yderligere at undersøge mitokondrie respiratoriske enzymer, såsom oximetric målinger og spektrofotometrisk enzym analyse 28,29.

På trods af sin mangeårige brug, har vigtige detaljer, enkle specificitet kontrol, og fremskridt for at forbedre metoden endnu ikke blevet præsenteret. I forhold til håndtering af væv, er det vigtigt at bruge frisk frosset væv med denne technique, for selv om COX vil overleve formalin fiksering, vil SDH ikke. Selvom dette er en begrænsning af den teknik, har ingen post mortem forsinkelse fundet at forstyrre denne metode 24, men det foreslås, til hurtigt at fjerne organer fra interesse at bevare morfologi. Dog bør en løbende fryse-tø cykler af væv og sektioner undgås. Vævsprøver kan fryses på tøris, men kan nogle væv kræve frysning i isopentan eller propan nedkøles med flydende kvælstof for at opnå optimal morfologi og for at undgå frysning artefakter. Den passende tykkelse kryostat afsnit, afhængigt af vævs-type, bør også bestemmes. Det anbefales at indsamle mellem 8 - 14-μm sektioner, tynd nok til penetration af de løsninger, men tyk nok til at bevare anatomiske funktioner efter dehydrering. Den foreslåede kryostat temperatur på -21 ° C skal muligvis justeres ± 1-2 ° C. Hvis prøven er for koldt, kan sektionen krølle, hvisdet er for varmt, kan det afsnit holde sig til kniven. Med hensyn til håndtering af dias, brug af fedt pen, som ofte er gavnligt at holde inkuberingsmedium på objektglasset bør undgås. Brug i stedet fra 150 til 200 μl af inkuberingsmedium per slide, afhængig af antallet af sektioner. Brugen af ​​et dækglas under inkubation bør også undgås, indtil slæden er klar til at blive monteret, da molekylær ilt skal være til stede under COX mærkning trin (Figur 4). Endelig foreslås det at anvende de kommercielt tilgængelige DAB-løsning (fx Sigma), et mere sikkert alternativ til at forberede DAB-løsning fra krystallinsk fast stof. DAB-løsning kan også foretages ud fra de tilgængelige tabletter, men inkonsekvent COX mærkning resultater blev fundet, når denne tablet-baserede DAB-løsning blev brugt.

For at opnå konsistente og pålidelige resultater fra denne biokemiske analyse er følgende punkter anbefales. Brug frisklavede PBS og ethanol i hvert eksperit. Forbered stamopløsninger af cytokrom c, NBT, PMS (skjold mod lys), natrium succinat, natriumazid, og malonate i 0,1 M PBS pH = 7,0, justering af pH til 7,0 med 0,1 M HCl eller 0,1 M NaOH. Portion og opbevar stamopløsningerne ved -20 ° C, og hurtigt tø de løsninger lige før brug. For at opnå ensartede resultater i hvert enkelt eksperiment, anbefales det at behandle en højst ti dias pr eksperiment for at minimere forsinkelser. Der er en vis variation mellem forsøgene, og derfor bør afsnit fra hvert emne / dyr gentages mindst tre-til-fire gange, og passende kontrol bør anvendes i hvert forsøg. Endelig, da inkubationstiderne har indflydelse på mængden af ​​COX-mærkning (Figur 4, venstre og midten paneler) og SDH-mærkning, er det ikke anbefales at variere inkubationstiderne med mere end 5% (2 min).

Den kombinerede COX / SDH-protokollen præsenteres her, er baseret på principper tidligere beskrevet 9,22,23,25. Som medmange technqiues, variationer af denne protokol, som bortset fra tilføjelsen af ​​PMS og natriumazid, ved hjælp af en vandig indlejringsolie, og varierende inkubation og skyl gange, der findes og kan arbejde lige så godt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklæret.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af National Institute of Aging (AG04418), National Institute on Drug Abuse, National Institute of Health-Karolinska Institutet Graduate Partnerskaber Program, Karolinska Institutet, svensk Research Council, svenske Brain Power, og svenske Brain Foundation. Mange tak til Mattias Karlen og Dr. Giuseppe Coppotelli til kreativ støtte med figur 1 og 2, henholdsvis Karin Pernold for teknisk bistand og DRS. Barry J. Hoffer, Lars Olson, og Nils-Göran Larsson til meget nyttige råd og diskussion.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dry Ice AGA Gas AB block form
Isopentane (2-methylbutane) Sigma-Aldrich 277258 CAS: 78-78-4
Cyrostat embedding solution Sakura Finetek Tissue Tek 4583
Cryostat Microm International Microm Model HM 500M
Slides Thermo Fisher Scientific, Inc. Super Frost Plus Menzel Gläser J1800AMWZ
Cover glasses Borosilicate glass VWR international 16004-098 24 x 50 mm
Filter Paper Munktell Filter AB Quality: 1350 Article Number: 242 001 430 x 430 mm
3,3′-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) Sigma-Aldrich Sigma Liquid Substrate System, D7304
Cytochrome c (Type III, from equine heart) Sigma-Aldrich C2506 CAS: 9007-43-6
Bovine catalase (from liver) Sigma-Aldrich C9322 CAS: 9001-05-2
Nitroblue tetrazolium (NBT) Sigma-Aldrich N6876 CAS: 298-83-9
Sodium succinate Sigma-Aldrich S2378 CAS: 6106-21-4
Phenazine methosulfate (PMS) Sigma-Aldrich P9625 CAS: 299-11-6 PMS is light sensitive. Shield from light.
Sodium azide Sigma-Aldrich S8032 CAS: 26628-22-8
Xylene VWR international EM-XX0060-4
Entellan VWR international 100503-870
Malonate (Malonic acid) Sigma-Aldrich M1296 CAS: 141-82-2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Larsson, N. G. Somatic mitochondrial DNA mutations in mammalian aging. Annu. Rev. Biochem. 79, 683-706 (2010).
  2. Cottrell, D. A. Role of mitochondrial DNA mutations in disease and aging. Ann. NY Acad. Sci. 908, 199-207 (2000).
  3. Harman, D. The biologic clock: the mitochondria. J. Am. Geriatr. Soc. 20, 145-147 (1972).
  4. Wallace, D. C. Mitochondrial genetics - a paradigm for aging and degenerative diseases. Science. 256, 628-632 (1992).
  5. Trifunovic, A. Premature ageing in mice expressing defective mitochondrial DNA polymerase. Nature. 429, 417-423 (2004).
  6. Ameur, A. Ultra-deep sequencing of mouse mitochondrial DNA: mutational patterns and their origins. PLoS Genet. 7, e1002028-e1002028 (2011).
  7. Safdar, A. Endurance exercise rescues progeroid aging and induces systemic mitochondrial rejuvenation in mtDNA mutator mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 4135-4140 (2011).
  8. DiMauro, S., Bonilla, E., Zeviani, M., Nakagawa, M., DeVivo, D. C. Mitochondrial myopathies. Ann. Neurol. 17, 521-538 (1985).
  9. Old, S. L., Johnson, M. A. Methods of microphotometric assay of succinate dehydrogenase and cytochrome c oxidase activities for use on human skeletal muscle. Histochem. J. 21, 545-555 (1989).
  10. Chaturvedi, R. K. Impaired PGC-1alpha function in muscle in Huntington's disease. Hum. Mol. Genet. 18, 3048-3065 (2009).
  11. Edgar, D. Random point mutations with major effects on protein-coding genes are the driving force behind premature aging in mtDNA mutator mice. Cell. Metab. 10, 131-138 (2009).
  12. Ross, J. M. High brain lactate is a hallmark of aging and caused by a shift in the lactate dehydrogenase A/B ratio. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 20087-20092 (2010).
  13. Crugnola, V. Mitochondrial respiratory chain dysfunction in muscle from patients with amyotrophic lateral sclerosis. Arch. Neurol. 67, 849-854 (2010).
  14. Nonaka, I. Muscle pathology in cytochrome c oxidase deficiency. Acta. Neuropathol. 77, 152-160 (1988).
  15. DiMauro, S. Mitochondrial encephalomyopathies. Neurol. Clin. 8, 483-506 (1990).
  16. Bonilla, E. New morphological approaches to the study of mitochondrial encephalomyopathies. Brain. Pathol. 2, 113-119 (1992).
  17. Brierley, E. J., Johnson, M. A., Lightowlers, R. N., James, O. F., Turnbull, D. M. Role of mitochondrial DNA mutations in human aging: implications for the central nervous system and muscle. Ann. Neurol. 43, 217-223 (1998).
  18. Borthwick, G. M., Johnson, M. A., Ince, P. G., Shaw, P. J., Turnbull, D. M. Mitochondrial enzyme activity in amyotrophic lateral sclerosis: implications for the role of mitochondria in neuronal cell death. Ann. Neurol. 46, 787-790 (1999).
  19. Gellerich, F. N. Mitochondrial respiratory rates and activities of respiratory chain complexes correlate linearly with heteroplasmy of deleted mtDNA without threshold and independently of deletion size. Biochim. Biophys. Acta. 1556, 41-52 (2002).
  20. Larsson, N. G. Mitochondrial transcription factor A is necessary for mtDNA maintenance and embryogenesis in mice. Nat. Genet. 18, 231-236 (1998).
  21. Ekstrand, M. I. Progressive parkinsonism in mice with respiratory-chain-deficient dopamine neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 1325-1330 (2007).
  22. Seligman, A. M., Karnovsky, M. J., Wasserkrug, H. L., Hanker, J. S. Nondroplet ultrastructural demonstration of cytochrome oxidase activity with a polymerizing osmiophilic reagent, diaminobenzidine (DAB). J. Cell. Biol. 38, 1-14 (1968).
  23. Dubowitz, V., Brooke, M. Muscle Biopsy: A Modern Approach. , Saunders. (1973).
  24. Cottrell, D. A. Cytochrome c oxidase deficient cells accumulate in the hippocampus and choroid plexus with age. Neurobiol. Aging. 22, 265-272 (2001).
  25. Blanco, C. E., Sieck, G. C., Edgerton, V. R. Quantitative histochemical determination of succinic dehydrogenase activity in skeletal muscle fibres. Histochem. J. 20, 230-243 (1988).
  26. Moraes, C. T., Ricci, E., Bonilla, E., DiMauro, S., Schon, E. A. The mitochondrial tRNA(Leu(UUR)) mutation in mitochondrial encephalomyopathy, lactic acidosis, and strokelike episodes (MELAS): genetic, biochemical, and morphological correlations in skeletal muscle. Am. J. Hum. Genet. 50, 934-949 (1992).
  27. Petruzzella, V. Extremely high levels of mutant mtDNAs co-localize with cytochrome c oxidase-negative ragged-red fibers in patients harboring a point mutation at nt 3243. Hum. Mol. Genet. 3, 449-454 (1994).
  28. Tulinius, M. H., Holme, E., Kristiansson, B., Larsson, N. G., Oldfors, A. Mitochondrial encephalomyopathies in childhood. I. Biochemical and morphologic investigations. J. Pediatr. 119, 242-250 (1991).
  29. Haas, R. H. The in-depth evaluation of suspected mitochondrial disease. Mol. Genet. Metab. 94, 16-37 (2008).

Tags

Cellebiologi aldring hjerne COX / SDH histochemistry mitochondrier mitokondrier sygdom mitokondriel dysfunktion mtDNA mtDNA mutationer respiratorisk kæde
Visualisering af Mitokondriel Respiratorisk funktion ved hjælp af cytochrom<em> C</em> Oxidase / succinat dehydrogenase (COX / SDH) Dobbelt-mærkning Histochemistry
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ross, J. M. Visualization of… More

Ross, J. M. Visualization of Mitochondrial Respiratory Function using Cytochrome C Oxidase / Succinate Dehydrogenase (COX/SDH) Double-labeling Histochemistry. J. Vis. Exp. (57), e3266, doi:10.3791/3266 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter