Summary
시토크롬 C 산화 효소 / 나트륨 탈수소 효소 (COX / SDH)를 두 번 라벨링 방법은 신선한 - 냉동 조직 섹션에서 mitochondrial 호흡 효소 결함의 직접적인 시각화를위한 수 있습니다. 이것은 간단한 histochemical 기법입니다 mitochondrial 질병, 노화, 그리고 노화 관련 질환을 조사하는 데 유용합니다.
Abstract
Mitochondrial DNA (mtDNA) 결함이 질병의 중요한 원인이며, 변경의 1,2를 노화와 노화 관련 기초 수 있습니다. 노화의 mitochondrial 이론은 노화 3, bioenergetics의 항상성 및 세포 기능을 변경할 수 있습니다 mtDNA 변이에 대한 역할을 제안합니다. 증거가 풍부한이 이론 1,4, mtDNA mutator 마우스 오되는 예제를 지원하도록 컴파일되어 있지만, 노화의 mtDNA 손상의 정확한 역할은 6,7 완전히 이해되지 않습니다.
호흡 효소의 활동을 관찰하는 것은 mitochondrial 장애를 조사하는 간단한 방법입니다. 복잡한 IV 또는 시토크롬 C 산화 효소 (COX)는 mitochondrial 기능에 대한 필수적입니다. COX의 촉매 subunits는 mtDNA에 의해 인코딩과 복잡한 조립 (그림 1) 필수입니다. 그러므로, 적절한 합성과 기능을 크게 mtDNA 무결성 2 기반으로합니다.다른 호흡 단지가 조사 될 수 있지만, 단지 IV와 II는 histochemical 시험 8,9 가장 의무가 있습니다. 증가 mitochondrial biogenesis 10-12을 나타내는 수도 있지만, 복잡한 II, 또는 호박산 탈수소 효소 (SDH)는, 완전히 핵 DNA (그림 1)에 의해 인코딩되어, 그 활동은 일반적으로 장애인 mtDNA에 의해 영향을받지 않습니다. 장애 mtDNA는 노화, mitochondrial 질환에서 관찰하고, 연령 관련 질병은 종종 낮은 값이나 COX 활동 2,12-14과 함께 세포의 존재에 이르게한다. COX와 SDH 활동 개별적으로 조사 수 있지만, 순차적 이중 라벨 부착 방법 15,16은 mitochondrial 장애 12,17-21와 세포를 찾는데 유리한 것으로 입증되었습니다.
분석의 최적의 체질의 대부분은 이러한 기판 농도, 전자 acceptors / 기증자, 중급 전자 통신 사업자, 산도의 영향, 그리고 반응 t으로 결정되었습니다IME 9,22,23. 3,3 '- diaminobenzidine (DAB)은 효과적이고 신뢰할 수있는 전자 기증자 22. COX 기능과 세포에서 갈색 indamine 폴리머 제품은 mitochondrial cristae에 집중하고 세포에게 22 포화 것입니다. 장애 COX있는 사람 세포 따라서 파란색 formazan 엔드 제품 9,24에 nitroblue tetrazolium (NBT), 전자 수용체의 감소에 의한 SDH 활동의 시각화에 대한 허용, DAB 제품에서 포화되지 않습니다. 시토크롬 C와 나트륨 호박산 기판은 제어와 돌연변이 / 병에 걸린 조직 구 사이의 내생적인 수치를 정상화에 추가됩니다. 카탈 라 아제 퍼옥시데이즈 활동 9,22에서 가능한 오염 반응을 피하기 위해 예방책으로 추가됩니다. Phenazine의 methosulfate (PMS), 중간 전자 운반체는 최종 반응 제품 9,25의 형성을 증가 나트륨 azide, 호흡 사슬 억제제와 함께 사용됩니다. 이 통보에도 불구하고ation,이 알맞은 간단 분석의 결과에 영향을 미치는 몇 가지 중요한 세부 사항은, 특이성 컨트롤과 기술의 진보뿐만 아니라, 아직 제시되지 않았습니다.
Protocol
1. cryosectioning을위한 조직 준비
- 가능한 윤리적 허가에 따라 자궁 경부 전위 또는 잘린에 의해 동물을 희생.
- 신속 관심 조직 (예 :. 뇌를) 수집, 그리고 신속하게 드라이 아이스 (조직이 최적의 형태를 얻을 액체 질소로 냉각 이소펜탄 또는 프로판의 동결을 요구할 수 있습니다)에 고정. 섹션 -80시 알루미늄 호일의 상점 조직은 ° C까지 준비.
- cryosectioning에 대비하여 냉동 조직을 삽입할 수 있습니다.
- -21에서 14 μm의 그라 이오 스탯 섹션을 모아서 ° C (온도를 조정해야 할 수도 있습니다 ± 1-2 ° C). 사용할 때까지 -20 ° C에서 coverslipping하지 않고 가열 블록 및 저장 슬라이드를 사용하여 슬라이드에 녹여 섹션.
2. COX의 histochemistry
- 슬라이드는 1 시간 동안 상온에서 건조하도록 허용합니다. 서부 유럽 표준시 필터 종이 슬라이드 얼룩 챔버에 슬라이드를 넣고, 스트립으로 절단. consisten을 얻으려면각 실험에서 t 결과, 그것은 시간 지연을 최소화하기 위해 실험을 한 사람당 10 슬라이드의 최대 처리하는 것이 좋습니다.
- 화학 후드 1X DAB에 따라 준비, 100 μm의는 0.1 M PBS 산도 = 7.0에서 C를 시토크롬. 빠르게 소용돌이.
- 카탈 라 아제 소 2 μg (2 μg ML -1 또는 약 4 IU ML -1) 추가합니다. 카탈 라 아제의 모든 곡식을 깨고 vortexing하여 잘 섞는다.
- 150 적용 - 배양 배지 200 μL를 각 슬라이드에, 골고루 모든 부분에 확산 피펫 팁을 사용합니다.
- 37 40 분 슬라이드를 품어 ° C.
- 슬라이드에서 여분의 솔루션을 제거합니다. 워시는 0.1 M PBS 산도 = 7.0에서 4 번, 매번 10 분, 슬라이드.
- 서부 유럽 표준시 종이 스트립과 함께 슬라이드 얼룩 챔버로 슬라이드를 반환합니다.
3. SDH의 histochemistry
- 화학 후드 1.5 MM NBT 130 MM 나트륨 호박산, 0.2 MM PMS, 그리고 0.1 M PBS 산도 = 7.0에서 1.0 MM 나트륨 azide에 따라 준비합니다. 받아가를 보호하기 위해주의빛과 PMS. 빠르게 소용돌이.
- 각 슬라이드에 부화 매체 150-200 μL를 적용, 골고루 모든 부분에 확산 피펫 팁을 사용합니다.
- 37 40 분 슬라이드를 품어 ° C.
- 슬라이드에서 여분의 솔루션을 제거합니다. 워시는 0.1 M PBS 산도 = 7.0에서 4 번, 매번 10 분, 슬라이드.
- 70 %, 70 %, 95%, 95 %, 99.5 % 에탄올 다음과 같은 농도에서 2 분 동안 슬라이드를 탈수. 그런 다음 추가 99.5 %의 단계에서 10 분 수 있습니다.
- 장소는 10 분 크실렌에서 슬라이드. Entellan 및 coverslip로 마운트합니다. 슬라이드가 통풍이 지역에서 숙박하거나, 적어도 1-2 시간 건조하도록 허용합니다.
4. mitochondrial 장애의 결정
- mitochondrial 장애의 양은 세포 푸른 얼룩의 양을로 표시됩니다. 이 금액을 반 수치, 슬라이드는 코드와 밝은 필드 현미경 아래에서 시각해야합니다. 세미 부량은 눈먼에서 수행되어야합니다 눈금을 사용하여 기초, 0-4 (0, 아니 파란 얼룩, 4, 오직 파란색 얼룩)에서 예를 들어. 그것은 각 과목 / 동물에 대한 의미 가치를 계산하기 위해 주어진 주제 / 동물의 여러 섹션으로 세미 - 부량 이런 종류의를 수행하는 것이 좋습니다.
- 통계는 이러한 맨 - 휘트니 또는 Kruskal - 월리스와 같은 비 파라메 트릭 테스트를 사용하여 수행해야합니다.
5. 적절한 특이성 컨트롤
- COX 활동에 대한 특이성 컨트롤 "COX의 histochemistry"단계를 반복하고, 2.5 MM 나트륨 azide, 터미널 호흡 체인 억제제를 추가합니다.
- SDH 활동에 대한 특이성 컨트롤, 나트륨 호박산의 제거 50 MM 말로 네이트, SDH의 경쟁 억제제의 추가와 함께 "SDH의 histochemistry"단계를 반복합니다.
- 씻고 에탄올 시리즈 섹션을 탈수 다음과 같은 단계를 3.4에서 설명하는 슬라이드 마운트 coverslip - 3.6.
6. 대표 결과 :
십t는 "> 야생 유형과 조기 노화 mtDNA의 mutator 마우스의 뇌 부분에서 적절한 COX / SDH 이중 라벨 histochemistry의 COX / SDH 이중 라벨 histochemical 분석 것은 그림 2에서 그림입니다. 대표 예제의 전체 구조는 그림에 표시됩니다 3. 야생 형 생쥐의 어두운 갈색 얼룩 (그림 3, 왼쪽 패널)은 파란색 얼룩으로 표시 호흡 연쇄 결함과 함께 셀을. 정상적인 COX 활동을 보여주 12주 된 mtDNA의 mutator 마우스에 발표되었고,이 결함이되었습니다 46주 (그림 3, 센터 및 오른쪽 패널)에 세 mtDNA의 mutator의 생쥐로 더 널리.부족 COX 라벨로 인해 야생 형 마우스의 뇌 부분에서 부적 절한 COX / SDH 이중 라벨링의 예는 그림 4에 표시됩니다. 부적 절한 배양 COX 활동의 시연 시간, 또는 부화 중에 슬라이드를 coverslipping하여 분자 산소의 가용성을 줄일 수는 DAB 반응의 감소 증착 결과따라서 이온 제품 및 SDH 보육 동안 파란 formazan 엔드 제품의 형성있었습니다.
COX와 SDH 활동도 (왼쪽 그림 5와 센터) 개별적으로 조사 수 있지만, 순차 라벨은 SDH 보육 동안 파란색 침전물의 형성 (그림 3, 센터에 의한 COX의 결함과 세포를 식별 도움이됩니다 오른쪽). COX와 SDH 활동에 대한 특이성 컨트롤도 (그림 5, 오른쪽) 할 수 있습니다.
그림 1. Mitochondrial 호흡 단지 IV. mitochondrial 호흡 사슬은 내부 멤브레인 내에있는 다섯 단지를 포함하고 있습니다. 호흡 사슬의 목적은 I IV로하고 ATP를 생산하는 복합 V (ATPase)에 의해 사용되는 내부 막에 걸쳐 양성자 그라디언트를 만듭니다 이렇게에서 복잡한에서 전자를 전송하는 것입니다. 레드 hexagons의 represeNT의 subunits는 mtDNA로 인코딩. 화이트 hexagons는 핵 DNA (단지 II가 완전히 핵 게놈에서 인코딩됩니다)로 인코딩된 subunits을 나타냅니다. 따라서, mitochondrial 게놈의 돌연변이가 호흡 체인 단지의 subunits의 돌연변이에 의한 호흡 사슬의 장애를 일으킬 수 있습니다.
그림 2. COX / SDH 이중 라벨링 histochemical 분석의 플로우 차트. 관심의 장기를 해부하다, 빠르게 드라이 아이스에 조직을 동결하고,에 그들을 저장할 - 80 ° C를 그라 이오 스탯 섹션을 수집하고 감시 - 20 ° C까지 사용할 수 있습니다. 1 시간 동안 실온에서 공기 건조에 섹션을 허용합니다. COX의 histochemistry에 대한 배양 매체를 준비, 슬라이드에 적용, 37 40 분 품어 ° C. 십분마다 세척을 위해 PBS에서 4 번 섹션을 씻으십시오. SDH의 histochemistry에 대한 배양 매체를 준비, SLI에 적용DES는 다시 37 ° C. 40 분 알을 품다 PBS에 다시 섹션을 씻고, 에탄올 시리즈 탈수, 그리고 마운트와 슬라이드를 coverslip. COX / SDH를 두 번 표시 부분은 1-2 시간 이내에 밝은 필드 현미경 아래에서 볼 준비가되었습니다.
그림 3. COX / SDH 이중 라벨의 대표 사례. 야생 유형 및 조기 노화 mtDNA의 mutator 마우스의 뇌 부분이 순차적으로 COX와 SDH 활동에 분류했다. (스케일 바. 200 μm의) 일반 COX 활동 (어두운 갈색 색상으로 표시) 야생 형 마우스 (왼쪽)에서 해마에 표시되었다. COX의 결함은 (파란색으로 표시) mtDNA mutator 마우스 (중앙 오른쪽)에서 해마에서 공개되었습니다. mtDNA mutator 마우스의 나이 46주에 의해 COX 활동에 더욱 감소는 호흡 사슬 기능 장애의 확산 악화를 제안,가 발생했습니다. 관찰된 미토mtDNA mutator 생쥐 12 chondrial 장애는 mtDNA 포인트 돌연변이뿐만 아니라 직선 삭제 5 증가 레벨 높은 수준의로 인해 발생합니다.
그림 4. 부적 절한 COX / SDH 이중 라벨의 예. 야생 형 마우스의 뇌 부분이 순차적으로 COX와 SDH 활동에 분류했다. (스케일 바. 200 μm의) COX 활동의 시범에 대한 불충 분한 부화 시간은 (10 25 분) 40 분 배양 시간 (왼쪽 센터)에 비해, 갈색 DAB 반응 생성물의 감소 증착 결과. SDH 보육 동안 파란 formazan 엔드 제품의 형성 허용 단축 부화 시간은 misleadingly COX의 결함과 세포의 존재를 몰랐다. COX 보육 동안 슬라이드를 Coverslipping하면 DAB 반응의 부정확 형성 및 증착 결과이온 제품 (오른쪽).
그림 5. I ndividual COX와 SDH 라벨 및 특이성 제어. 야생 형 마우스에서 뇌 섹션이 별도로 어두운 갈색 색상과 블루 색상, 각각 (왼쪽과 가운데)로 표시 COX와 SDH 활동에 대한 분류했다. COX와 SDH 활동 개별적으로 분류 될 수 있지만, 순차 상표는 mitochondrial 장애와 세포를 찾는데 유리한 것으로 입증되었습니다. 야생 형 마우스 뇌에서 COX와 SDH 활동을위한 특이성 컨트롤의 예제는 상표의 부재를 (오른쪽)했다. (스케일 바. 200 μm의)
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Discussion
통합 COX / SDH histochemical 방법은 mitochondrial 장애와 세포의 시각화 수 있습니다. 이 기법은, 초기 연구는 1968까지 거슬러 올라가는와 함께, 많은이에게 환자 14,19,26,27에서 mitochondrial 질병을 식별에 대한 "황금 표준"을 고려와 함께 인기가 남아있다. 그것은 지금 자주 mtDNA 변이 기반 노화와 노화 관련 질환 12,13,18,20,21,24을 조사하는 데 사용됩니다. COX / SDH 이중 라벨 부착 방법은 종종 특정 mtDNA 변이를 식별하고 더 이상 이러한 oximetric 측정과 분광 효소 분석 28,29로 mitochondrial 호흡 효소를 조사하기 위해 다른 기술을 병렬로 사용됩니다.
그 오랜 사용에도 불구하고, 방법을 개선하기 위해 중요한 세부 정보, 간단한 특이성 컨트롤, 그리고 발전은 아직 제시되지 않았습니다. 조직의 취급에 관해서는,이 techniq 신선한 - 냉동 조직을 사용하는 것이 중요합니다UE는, 콕스는 포르말린 고정 살아남을 수 있겠지만 때문에 SDH가되지 않습니다. 이것은 기술의 한계이지만, 아무 사후 지연이 방법은 24 방해를 찾을 수 없습니다 왔지만, 그것은 신속하게 형태를 유지하기 위해 관심의 장기를 제거하는 제안입니다. 그러나, 조직 및 섹션의 연속 동결 - 해동주기는 피해야한다. 조직 샘플은 드라이 아이스에 냉동 수 있지만, 일부 조직은 이소펜탄 또는 최적의 형태를 얻을하고 냉동 유물을 피하기 위해 액체 질소로 냉각 프로판에서 동결해야 할 수도 있습니다. 조직 유형에 따라 그라 이오 스탯 섹션,의 적절한 두께도 결정되어야합니다. 14 μm의 섹션 솔루션지만, 탈수 후 해부 학적 기능을 유지하기 위해 충분한 두께의 침투 충분히 얇은 - 이것은 8시 사이에 수집하는 것이 좋습니다. -21의 제안 그라 이오 스탯 온도 ° C는 ± 1-2가 ° C. 조정해야 할 수 있습니다 표본이 너무 차가운 경우 섹션 경우, 곱슬 곱슬 수 있습니다너무 따뜻하고이며, 섹션 칼을에 충실 수 있습니다. 슬라이드의 처리와 관련하여, 자주 슬라이드 배양 매질을 유지 도움이되는 그리스 펜의 사용은 피해야한다. 대신 150을 사용 - 슬라이드 당 배양 매질 200 μl를 섹션의 숫자에 따라 다릅니다. 분자 산소는 COX 라벨 단계 (그림 4)에 존재해야하기 때문에 슬라이드가 장착 준비가 될 때까지 배양 중에 coverslip의 사용도 피해야한다. 마지막으로, 그것은 상용 DAB 솔루션 (예 : 시그마), 결정 고체에서 DAB 솔루션을 준비하기 위해보다 안전한 대안을 사용하는 제안입니다. DAB 솔루션도 제공 정제로 만들 수 있지만, 일관성 COX 라벨 결과는이 타블렛 기반의 DAB 솔루션을 사용했을 때 발견되었다.
이 생화 학적 분석의 일관성과 신뢰성있는 결과를 얻으려면 다음 사항을 권장하고 있습니다. 각 experimen에 신선한 PBS와 에탄올을 사용하여T. 0.1 M HCL 또는 0.1 M NaOH와 7.0 산도를 조정 시토크롬 C, NBT, PMS (빛으로부터 방패), 나트륨 호박산, 나트륨 azide와 0.1 M PBS 산도 = 7.0에서 말로 네이트의 재고 솔루션을 준비합니다. 나누어지는 및 -20 ° C에서 재고 솔루션을 저장하고 빠르게 사용하기 직전 솔루션을 해동. 각 실험에서 일관성있는 결과를 얻으려면, 그것은 시간 지연을 최소화하기 위해 실험을 한 사람당 10 슬라이드의 최대 처리하는 것이 좋습니다. 실험 사이 변화가있다, 따라서, 각 과목 / 동물의 섹션은 최소한 3-4 번 반복해야하고, 적절한 제어는 각 실험에 사용해야합니다. 배양 시간이 COX - 라벨 (그림 4, 왼쪽과 가운데 패널) 및 SDH - 라벨의 양을 영향을 미치는처럼 마지막으로, 그것은 이상 5 % (2 분)에 의해 부화 시간을 변경할 권장하지 않습니다.
통합 COX / SDH 프로토콜을 여기 소개는 이전에 다음 ID로 9,22,23,25을 설명한 원리에 기반을두고 있습니다. 과 마찬가지로등, PMS 및 나트륨 azide의 추가를 제외 수성 mountant를 사용하고 부화를 변화와 시간을 린스 많은 technqiues,이 프로토콜의 변형은, 존재와 동등으로 잘 작동됩니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 노화의 국립 연구소 (AG04418), 약물 남용에 국립 연구소, 건강 Karolinska Institutet 연구 협력 프로그램의 국립 연구소, Karolinska Institutet, 스웨덴어 연구위원회, 스웨덴어 브레인 파워, 그리고 스웨덴어 뇌 재단에 의해 지원되었다. 대부분의 각각 그림 1 및 2와 창조에 대한 지원 Mattias Karlen 박사 주세페 Coppotelli 덕분에, 기술 지원 Pernold Karin 및 Drs. 배리 J. Hoffer, 많은 도움이 조언과 토론 라스 올슨, 그리고 닐스 - 고란 라슨.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dry Ice | AGA Gas AB | block form | |
| Isopentane (2-methylbutane) | Sigma-Aldrich | 277258 CAS: 78-78-4 | |
| Cyrostat embedding solution | Sakura Finetek | Tissue Tek 4583 | |
| Cryostat | Microm International | Microm Model HM 500M | |
| Slides | Thermo Fisher Scientific, Inc. | Super Frost Plus Menzel Gläser J1800AMWZ | |
| Cover glasses Borosilicate glass | VWR international | 16004-098 | 24 x 50 mm |
| Filter Paper | Munktell Filter AB | Quality: 1350 Article Number: 242 001 | 430 x 430 mm |
| 3,3′-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) | Sigma-Aldrich | Sigma Liquid Substrate System, D7304 | |
| Cytochrome c (Type III, from equine heart) | Sigma-Aldrich | C2506 CAS: 9007-43-6 | |
| Bovine catalase (from liver) | Sigma-Aldrich | C9322 CAS: 9001-05-2 | |
| Nitroblue tetrazolium (NBT) | Sigma-Aldrich | N6876 CAS: 298-83-9 | |
| Sodium succinate | Sigma-Aldrich | S2378 CAS: 6106-21-4 | |
| Phenazine methosulfate (PMS) | Sigma-Aldrich | P9625 CAS: 299-11-6 | PMS is light sensitive. Shield from light. |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 CAS: 26628-22-8 | |
| Xylene | VWR international | EM-XX0060-4 | |
| Entellan | VWR international | 100503-870 | |
| Malonate (Malonic acid) | Sigma-Aldrich | M1296 CAS: 141-82-2 |
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