Summary
シトクロムcオキシダーゼ/ナトリウム脱水素酵素（COX / SDH）二重標識法では、新鮮凍結組織切片におけるミトコンドリアの呼吸酵素の欠乏の直接可視化することができます。これは簡単な組織化学的手法であり、ミトコンドリア病、老化、および老化関連疾患を検討する上で有用です。
Abstract
ミトコンドリアDNA（mtDNA）の欠陥は、病気の重要な原因であり、変化の1,2の高齢化や老化に関連する根底にある。老化のミトコンドリア説は、老化プロセス3で、生体エネルギーの恒常性と細胞機能を変化させることができるミトコンドリアDNA変異、の役割を示唆している。豊富な証拠は、この理論の1,4、mtDNAの突然変異誘発マウス5にする例のサポートでコンパイルされているが、高齢化のmtDNAの損傷の正確な役割は、6,7完全には理解されていない。
呼吸酵素の活性を観察することによりミトコンドリアの機能障害を調査するための簡単なアプローチです。複雑なIV、またはシトクロム c オキシダーゼ （COX）は、ミトコンドリアの機能に不可欠です。 COXの触媒サブユニットはミトコンドリアDNAによってエンコードされ、複合体の構築（図1）のために必須であるされています。従って、適切な合成と機能は、主にミトコンドリアDNAの完全性2に基づいています。他の呼吸器複合体を調査することもできますが、複合体IVとIIは、組織化学的検査8,9に最も適しています。増加はミトコンドリアの生合成10-12を示すかもしれませんが、複雑なII、またはコハク酸脱水素酵素（SDH）は、完全に核DNA（図1）によってエンコードされ、その活性は、通常、障害のあるミトコンドリアDNAの影響を受けません。障害ミトコンドリア病で観察されるミトコンドリア、老化、そして加齢に伴う病気は、しばしば低いか不在のCOX活性2,12-14と細胞の存在につながる。 COXおよびSDHの活動を個別に調査することができますが、連続した二重標識法15,16は、ミトコンドリア機能障害12,17-21で細胞を見つけるのに有利で あることが証明されている。
アッセイの最適な憲法の多くは、基質濃度、電子受容体/供与体、中間の電子キャリア、pHの影響、及び反応のtとして、決定されているIME 9,22,23。 3,3' -ジアミノベンジジン（DAB）は、効果的かつ信頼性の高い電子供与体22です。機能COXを持つ細胞では、茶色のインダミンポリマー生成物は、ミトコンドリアのクリステに局在し、細胞22を飽和します。機能不全にCOXとそれらの細胞は、青色ホルマザンの最終製品9,24に、ニトロブルーテトラゾリウム（NBT）、電子受容体の減少により、SDH活性の可視化を可能にする、DABの製品で飽和されることはありません。 シトクロム cとコハク酸ナトリウムの基板は、制御および変異型/疾患組織から9までの内因性レベルを標準化するために追加されます。カタラーゼペルオキシダーゼ活性9,22から可能な限り汚染反応を避けるための予防措置として追加されます。フェナジンメトサルフェート（PMS）、中間電子伝達体は、最終の反応生成物9,25の形成を高めるために、呼吸鎖阻害剤、アジ化ナトリウムと組み合わせて使用されます。これは、通知にもかかわらずationは、この上品な簡単なアッセイの結果に影響を及ぼすいくつかの重要な詳細は、特異性のコントロールやテクニックの進歩に加えて、まだ提示されていない。
Protocol
1。 cryosectioningのための組織の準備
- 利用可能な倫理的な許可証に基づき、頸椎脱臼または断頭のいずれかの方法で動物を生け贄に捧げる。
- 迅速に関心の組織（ 例えば 、脳）を収集し、迅速に（組織の最適な形態を得るために液体窒素で冷やしイソペンタンまたはプロパンで凍結が必要になる場合があります）ドライアイスで凍結。セクションに-80℃アルミホイルで店の組織は、° Cまでの準備。
- cryosectioningの準備のために凍結組織を埋め込みます。
- -21で14μmの凍結切片を収集° C（温度を調整する必要があります± 1〜2 ° C）。使用する準備ができるまで-20℃で封入することなく加熱ブロック、および店舗のスライドを使用してスライド上のセクションを解凍します。
2。 COXの組織化学
- スライドは、1時間室温で乾燥することができます。湿った濾紙を持つスライド染色室でスライドを入れ、ストリップに切断。 consistenを取得するには各実験におけるtの結果、それは時間の遅延を最小限に抑えるため、実験ごとに10個のスライドの最大値を処理することをお勧めします。
- 化学フード1X DAB、0.1 M PBSのpH = 7.0で100μM シトクロム cの下準備。すぐに渦。
- （2μgのml -1のまたは約4 IU ml -1の ）カタラーゼ、ウシ2μgのを追加。カタラーゼのすべての穀物を分割してボルテックスでよく混和する。
- 150適用 - インキュベーション培地200μLを各スライドに、すべてのセクションの上に均等に分散するためにピペットチップを使用してください。
- 37℃で40分間スライドをインキュベート℃に
- スライド上の過剰な溶液を除去。洗浄は、0.1 M PBSのpH = 7.0の4倍、10分ごとに時間を、スライド。
- 湿紙のストリップをスライド染色室にスライドを返します。
3。 SDHの組織化学
- 1.5mMのNBT、130mMのコハク酸ナトリウム、0.2mMのPMS、および0.1MのPBSのpH = 7.0の1.0 mMのアジ化ナトリウムは、化学物質のボンネットの下準備。遮蔽するために十分注意してください光からPMS。すぐに渦。
- 各スライドにインキュベーション培地の150〜200μLを適用し、すべてのセクションの上に均等に分散するためにピペットチップを使用してください。
- 37℃で40分間スライドをインキュベート℃に
- スライド上の過剰な溶液を除去。洗浄は、0.1 M PBSのpH = 7.0の4倍、10分ごとに時間を、スライド。
- エタノールの下記の濃度で2分間スライドを脱水：70％、70％、95％、95％、99.5％。その後は、追加の99.5％の段階で10分の時間を要します。
- 10分間、キシレンのスライドを置きます。 Entellanとカバースリップをマウントします。スライドは、換気の良い場所で一晩、または少なくとも1〜2時間乾燥することができます。
4。ミトコンドリア機能障害の定量
- ミトコンドリア機能障害の量は、細胞ブルー染色の量で示されます。これらの金額を半定量するために、スライドはコード化し、明視野顕微鏡下で可視化されるべきである。半定量は、ブラインドで実行する必要がありますスケールを使用して基礎は、0 - 4（0、青なし染色、4、唯一青色の染色）から、例えば。各被験者/動物の平均値を計算するために与えられた件名（subject）/動物からいくつかのセクションで半定量化のこの種類を実行するのが最善です。
- 統計は、マン - ホイットニーまたはKruskal - Wallisのような非パラメトリックテストを、使用して実行する必要があります。
5。適切な特異性のコントロール
- COX活性のための特異性のコントロールについては、"COXの組織化学"の手順を繰り返し、および2.5 mMのアジ化ナトリウム、ターミナルの呼吸鎖阻害剤を加える。
- SDH活性のための特異性のコントロールについては、コハク酸ナトリウムの除去し、50mMマロン酸、SDHの競合阻害剤を加えて"SDHの組織化学"の手順を繰り返します。
- 洗い、エタノール系列でセクションを脱水してから、などの手順3.4で説明したスライドにマウントし、カバースリップ - 3.6。
6。代表的な結果：
テント"> COX / SDH二重標識組織化学的アッセイの全体的なスキームを図2に示されています。野生型と年不相応に老けているmtDNAの突然変異誘発のマウスからの脳切片における適切なCOX / SDH二重標識組織化学の代表的な例が図に示されている（3）野生型マウス（図3、左パネル）の暗褐色の染色は、通常のCOXの活性を示した。青色染色によって示される呼吸鎖の欠陥を持つ細胞は、12週齢のミトコンドリアDNAの突然変異誘発のマウスでは明らかに、これらの欠陥は、となった46週間（図3、中央と右のパネル）に歳のmtDNAミューテータマウスとして普及。不十分なCOXラベリングのために野生型マウスの脳切片における不適切なCOX / SDH二重標識の例を図4に示されています。不十分なインキュベーションのCOX活性のデモンストレーションのための時間、またはインキュベーション中にスライドを封入により、分子状酸素の利用を減らすことは、DAB反応するの低下沈着をもたらしたしたがって、イオン積、とは、SDHのインキュベーション中に、青色のホルマザンの最終製品の形成を可能にした。
COXとSDH活性はまた（図5、左と中央）別々に調べることができますが、系列ラベリングには、COXの不足で細胞の同定に有用であり、SDHのインキュベーション（図3中の青い沈殿が形成されるため、中心をと右）。 COXおよびSDH活動のための特異性のコントロールも（図5、右）に行うことができます。
図1。ミトコンドリア呼吸複合体IV。ミトコンドリア呼吸鎖は、内膜内に位置し、5つの複合体を含んでいます。呼吸鎖の目的は、複雑なIからIVにして、ATPを生産する複合V（ATPアーゼ）で使用されている内側の膜を横切るプロトン勾配を作るそうすることで電子を輸送することです。赤い六角形represeNTのサブユニットはミトコンドリアDNAによってコードさ。白い六角形は、核DNA（複合体IIが完全に核ゲノムからエンコードされていることに注意）でエンコードされたサブユニットを表しています。従って、ミトコンドリアゲノムの変異は、呼吸鎖複合体のサブユニットの変異に起因する呼吸鎖の機能障害を引き起こす可能性があります。
図2。COX / SDH二重標識組織化学アッセイのフローチャート 。興味の器官を分析、急速にドライアイス上で組織を凍結し、そして、それらを保存する - 80℃をクリオスタット切片を収集し備え置かなければならない - 20 ° Cまでの使用を。 1時間室温で空気乾燥のセクションを許可する。 、COXの組織化学のためのインキュベーション培地を準備したスライドに適用し、37℃で40分間インキュベート℃を10分各洗浄用PBS 4倍のセクションを洗ってください。 SDHの組織化学のために培養培地を調製、SLIに適用DESは、再度37℃で40分間インキュベートPBSでもう一度セクションを洗浄、エタノール系列で脱水し、マウントしてスライドをカバースリップ。 COX / SDH二重標識のセクションでは、1〜2時間以内に明視野顕微鏡下で表示する準備ができました。
図3。COX / SDH二重標識の代表例 。野生型と年不相応に老けているmtDNAの突然変異誘発のマウスの脳切片を順次COXおよびSDH活動のために標識した。 （スケールバー：200μmの）通常のCOX活性は、（ダークブラウン色で示される）野生型マウス（左）から海馬に示す通りであった。 COXの欠陥は、（青い色で示される）のmtDNAミューテータマウス（中央と右）から海馬において明らかにされた。 mtDNAの突然変異誘発マウスの年齢の46週までにCOX活性のさらなる減少は、呼吸鎖の機能障害の広範な悪化を示唆し、そこにあった。観測された水戸mtDNAの突然変異誘発マウス12のchondrial機能障害は、ミトコンドリアDNAの点突然変異だけでなく、リニア失5の増加したレベルの高レベルによって引き起こされる。
図4。不適切なCOX / SDH二重標識の例 。野生型マウスの脳切片を順次COXおよびSDH活動のために標識した。 （スケールバー：200μmの）不適切なインキュベーション時間（10〜25分）COX活性のデモンストレーションのためには、40分間のインキュベーション時間（左と中央）と比較して、茶色のDABの反応生成物の削減堆積をもたらした。 SDHのインキュベーション中に、青色のホルマザンの最終製品を形成するために許可されて短縮されたインキュベーション時間は、誤解を招くCOXの欠陥を持つ細胞の存在を示唆している。 COXのインキュベーション中にスライドを封入することも、DAB反応するの不正確な形成と沈着をもたらしたイオン製品（右）。
図5。私ndividual COXおよびSDHのラベリングと特異性の制御 。野生型マウスの脳切片を別々にCOXとSDH活動のために標識した、（左と中央）がそれぞれ、ダークブラウン色とブルー色で示されます。 COXおよびSDHの活動が個々にラベルを付けることができますが、系列ラベリングは、ミトコンドリア機能障害を有する細胞を見つけるのに有利であることが証明されている。野生型マウスから脳内COXおよびSDH活動のための特異性の制御の例は、ラベルの有無を（右）を示した。 （スケールバー：200μmの）
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Discussion
複合COX / SDH組織化学的方法では、ミトコンドリア機能障害を有する細胞の可視化を可能にします。この手法は、初期の研究、1968年にさかのぼると、多くはそれの患者14,19,26,27のミトコンドリア病を識別するための"ゴールドスタンダード"を考慮して、人気を保っています。それは今頻繁にmtDNA変異主導老化や老化関連疾患12,13,18,20,21,24を調査するために使用されます。 COX / SDH二重標識法は、しばしば特定のミトコンドリアDNAの変異を同定し、さらにそのようなoximetric測定や分光光度酵素の解析28,29のようなミトコンドリアの呼吸酵素を、調査する他の技術と並行して使用されています。
その長年の使用にもかかわらず、方法を改善するための重要な詳細、シンプルな特異性のコントロール、そして進歩はまだ発表されていない。組織の取扱いに関しては、このtechniqと新鮮凍結組織を使用することが重要です。UEは、COXはホルマリン固定後も存続しますが、ため、SDHはしません。これは技術の限界ですが、何事後遅延は、このメソッドを24と干渉することが見つかっていないが、それはすぐに形態を維持するために興味の臓器を削除することが提案されている。しかし、組織やセクションの連続的な凍結融解は避けてください。組織サンプルはドライアイスで凍結されることがありますが、一部の組織は、最適な形態を得るために、凍結アーチファクトを避けるために液体窒素で冷却したイソペンタンまたはプロパンで凍結が必要になる場合があります。組織型に応じて、凍結切片、、の適当な厚さも決定する必要があります。 14μmのセクション、ソリューションが脱水した後、解剖学的特徴を維持するために十分な厚さの浸透のための十分な薄 - それは8の間に収集することをお勧めします。 -21 ° Cの調整は必要な場合があります± 1-2の推奨されるクライオスタットの温度℃に試料が低すぎる場合、セクションは、以下の場合、カールができるそれはあまりにも暖かいです、セクションでは、ナイフに付着することがあります。スライドの取扱いに関しては、多くの場合、スライドのインキュベーション培地を維持するのに有益であるグリースのペンの使用は、避けるべきである。スライドあたりのインキュベーション培地200μl、セクションの数に応じて - その代わりに、150を使用してください。分子状酸素は、COXのラベリングステップ（図4）中に存在する必要があるため、スライドは、マウントする準備ができるまでインキュベーション中にカバースリップの使用も避けるべきである。最後に、それは市販のDAB溶液（ 例えばSigma）、結晶性固体からDAB溶液を調製するより安全な代替手段を使用することを推奨します。 DAB溶液は、使用可能な錠剤から行うこともできますが、矛盾したCOXのラベリング結果は、このタブレットベースのDAB溶液が使用されたときに発見された。
この生化学的アッセイから、一貫した信頼できる結果を得るために、以下の点が推奨されます。各experimenで作りたてのPBSおよびエタノールを使用して、T. 0.1 M HClまたは0.1 M NaOHでpHを7.0に調整し、 シトクロム c、NBT、PMS（光からシールド）、コハク酸ナトリウム、アジ化ナトリウム、および0.1MのPBS、pHのマロン酸= 7.0のストック溶液を準備します。分注して-20℃でストック溶液を保存し、急速に使用直前にソリューションを解凍。各実験で一貫性のある結果を得るためには、それは時間の遅延を最小限に抑えるために、実験ごとに10個のスライドの最大値を処理することをお勧めします。実験の間にいくつかのばらつきがありますので、各被験者/動物からの切片は、少なくとも3〜4回繰り返すことが必要、そして適切なコントロールは、各実験で使用する必要があります。インキュベーション時間は、COX -標識（図4、左と中央のパネル）およびSDH -ラベリングの量に影響を与える同様最後に、、それが5％以上（2分）でインキュベーション時間を変化させることは推奨されません。
複合COX / SDHプロトコルで提示されている以前に9,22,23,25を説明した原則に基づいています。と同様になど、PMSとアジ化ナトリウムの添加を除く水溶性封入液を使用して、そしてインキュベーションを変えるなど、多くのtechnqiues、このプロトコルのバリエーション、そして、時間をすすぎ存在せず、同様に同じように動作する場合があります。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
この作品は、老化の国立研究所（AG04418）、国立薬物乱用研究所、健康、カロリンスカ研究所大学院のパートナーシッププログラムの国立研究所、カロリンスカ研究所、スウェーデン研究評議会、スウェーデンの頭脳パワー、およびスウェーデンの脳の財団によってサポートされていました。多くの、それぞれ図1と2、創造的サポートのためのマティアスカーレンと博士ジュゼッペCoppotelliのおかげで、技術支援のためのPernoldカリン、と博士。バリーJ.ホッファー、非常に有益な助言と議論するためのラースオルソン、そしてニルス-ゴランラーション。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dry Ice | AGA Gas AB | block form | |
| Isopentane (2-methylbutane) | Sigma-Aldrich | 277258 CAS: 78-78-4 | |
| Cyrostat embedding solution | Sakura Finetek | Tissue Tek 4583 | |
| Cryostat | Microm International | Microm Model HM 500M | |
| Slides | Thermo Fisher Scientific, Inc. | Super Frost Plus Menzel Gläser J1800AMWZ | |
| Cover glasses Borosilicate glass | VWR international | 16004-098 | 24 x 50 mm |
| Filter Paper | Munktell Filter AB | Quality: 1350 Article Number: 242 001 | 430 x 430 mm |
| 3,3′-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) | Sigma-Aldrich | Sigma Liquid Substrate System, D7304 | |
| Cytochrome c (Type III, from equine heart) | Sigma-Aldrich | C2506 CAS: 9007-43-6 | |
| Bovine catalase (from liver) | Sigma-Aldrich | C9322 CAS: 9001-05-2 | |
| Nitroblue tetrazolium (NBT) | Sigma-Aldrich | N6876 CAS: 298-83-9 | |
| Sodium succinate | Sigma-Aldrich | S2378 CAS: 6106-21-4 | |
| Phenazine methosulfate (PMS) | Sigma-Aldrich | P9625 CAS: 299-11-6 | PMS is light sensitive. Shield from light. |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 CAS: 26628-22-8 | |
| Xylene | VWR international | EM-XX0060-4 | |
| Entellan | VWR international | 100503-870 | |
| Malonate (Malonic acid) | Sigma-Aldrich | M1296 CAS: 141-82-2 |
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