Summary
この記事では、胚性皮膚や胸腺、血管を標識する方法を説明します。
Abstract
機能的な血管のネットワークの設立は、器官形成の本質的な部分であり、そして最適な臓器の機能に必要です。例えば、胸腺適切な血管の形成とパターニングに臓器と周辺への成熟T細胞の出口への胸腺細胞のエントリには不可欠です。胸腺の血管の空間的な配置は、局所微小環境からの信号、すなわち胸腺上皮細胞（TEC）に依存します。いくつかの最近の報告では、胸腺血管の欠陥の1,2にこれらの信号の結果のその中断を示唆している。これまでの研究では、新生児と成人の胸腺の血管系の1,2にラベルを付けるために使用されるテクニックを説明してきました。ここでは、胎児胸腺内の血管を標識するためのテクニックを示しています。このメソッドは、FITC -デキストランまたはGriffonia（Bandeiraea）SimplicifoliaレクチンI（GSL 1 -イソレクチンB 4）の使用を組み合わせて顔の静脈注射とCD31抗体染色胸腺血管構造と胸腺の血管周囲の間充織3-5をラベル付けするためにPDGFR -βを識別する。凍結切片またはビブラトームセクションを使用するオプションも用意されています。このプロトコルは、胸腺血管形成にTEC -由来分子の役割を定義するために重要な胸腺血管の欠陥を、識別するために使用することができます。メソッドが全体の血管をラベルとして、それはまた、皮膚や心臓60から10を含む胚全体の複数の臓器や組織に血管のネットワークを分析するために使用することができます。
Protocol
1。フルオレセインデキストランとGSL I -イソレクチンB 4顔面静脈注射は胎児の血管系にラベルを付けるラベルが付い
- 生理食塩水（PBS）またはGSL 1リン酸緩衝FITC -デキストランを（50ug/mL）の準備- 1.5mlのエッペンドルフチューブにPBSでイソレクチンB 4（20ug/200uL）と37℃くらいまで温めC. FITC -デキストラン溶液（総体積1mLの）と株式1.25ファストグリーンの180uL / PBSにGSL 1株1.25ファストグリーン/ PBSの100uL追加-ソリューションが小さくなるようにイソレクチンB 4（合計ボリューム200uL）を、目に見えて青。
- 尿膜茎（臍動脈と静脈が）そのままにして、一緒にE14.5 - E18.5胚と卵黄嚢を解剖。
- 新しいペトリ皿（60 × 15 mm）に胚を移し、室温でPBSでそれらを浸す。
- 頭/顔の矢ビューを提供するために胚を置きます。優しく頭で胚を把握するためにマイクロ解剖ピンセットを使用してください。
- 30Gの針を使用して、50UL FITC -デキストラン（50ug/mL）またはGSL 1を注入する-イソレクチンB 4（200uLのPBS中20ug）を頭の後ろに向かって針を指す顔面静脈に。
- 染料は、臍静脈に表示されているときに、針を除去し、尿膜茎（臍動脈と静脈）から胚を分離。
- 注射後、胚は、色素が胚全体に循環するように2〜3分間室温でPBS中に残さないように。
2。皮膚の血管系のホールマウントの解析
- 色素が胚全体に循環させた後、バック、手足の地域から皮膚サンプルを削除し、胃、など8,9。
- 冷PBSで皮膚のサンプルを洗浄し、2時間8,9を4％PFA / PBSで固定してください。 2mLの冷PBSで4mlの透明なバイアルで10分間ずつ3回洗浄する。
- 顕微鏡スライド上に皮膚のサンプルを配置し、各スライドとカバーガラスにマウントメディアの100μlを加える。
- スライドは暗い記憶領域に乾燥することができます。
- 2'イメージの取得"セクションに進みます。
3。凍結切片のための胸腺および心臓血管系と血管周囲細胞のマルチカラーラベル（セクション1、手順7から続行）
- 液体窒素で"フラッシュフリーズ"全胚。胚は、分析するまでになると-80℃で保存できます。
- また、、胸腺をばらばらにする4℃のPBSですすぎ、そして2時間2mLの4％パラホルムアルデヒド（PFA）/ PBSで固定してください。冷PBS、OCTでの場所thymusの複数形、および-80℃で使用するまで凍結保存℃で10分間3回洗浄
- cryosectioningの場合は、セクション"ブロック"にOCTを広げ、セクショニングの胚や解剖の臓器/組織をマウントします。
- 厚さ10μmのセクションに凍結組織を切り取り、スライド上に収集する。
- 5〜10分間アセトンでセクションを修正。冷たいTBSで3回洗浄する。
- 室温で湿度チャンバ内の10％ロバ血清/ TBSでブロックする。
- 4℃湿度チャンバ内の一次抗体を100μlで1時間、一晩のためのセクションをインキュベート° C：この例では、我々は、ラット抗マウスCD31（1:100）ラベルの内皮へ、そしてヤギ抗マウスPDGFR -βを使用してください（1:100）血管周囲細胞を標識する。それは抗体が均一にセクションにまたがっていることを保証するために個別にカットパラフィルムストリップではスライドをカバーするために有用です。
- 一次抗体とのインキュベーション後、切片を冷たいTBSで3回洗浄する。最短で30分のための適切な二次抗体を100μlとインキュベートする。
- 冷たいTBSで3回洗浄する。各スライドとカバーガラスにマウントメディアの100μlを追加します。
- スライドは暗い記憶領域に乾燥することができます。
- "画像取り込み"セクションに進んでください。
4。ビブラトームセクションの胸腺血管と血管周囲細胞のマルチカラーラベル（セクション1、手順7から続行）
- 胚から胸腺葉を摘出し、冷PBSでリンス。
- 2時間、室温で4％PFA / PBSで胸腺を修正。
- アガロース/ PBS（〜4℃）溶融低い4％の小さなプラスチック製のカートリッジと水没のPBS -トリトンX（0.15％）3回、10分および場所のthymusの複数形で洗う。胸腺は、カートリッジの底部に接触している必要があります。
- アガロースが氷（3〜5分）で固化することができます。余分なアガロースを遮断するカミソリの刃を使用。ビブラトームブロックに接着剤を追加し、ブロックするためにサンプルを付着する。
- サンプルとブレードが浸されるまでビブラトームの水浴に冷PBSを追加。
- 速度を設定し、振幅（高振幅、低中程度の速度はソフト胸腺のセクションに理想的です）。のセクションでは、過剰な攪拌による解散場合振幅が低減されるべきである。
- 50人のUMセクションをカット。
- 絵筆を使って、冷PBSで24ウェルマイクロプレートのセクションを収集する。
- 30分間PBS -トリトンX（0.15％）の10％ロバ血清を500μlのブロックのセクション。
- などの一次抗体と一晩に8時間、切片をインキュベート抗CD31および抗PDGFR -β、覆われた24ウェルマイクロプレートインチ
- 4℃8時間の合計℃以上PBS -トリトンX（0.15％）で3回洗浄する
- 30分間PBS -トリトンX（0.15％）の10％ロバ血清中のブロックのセクションを参照してください。
- 4℃との適切な二次抗体で一晩に8時間のためのセクションをインキュベートする。
- 4℃8時間の合計℃以上PBS -トリトンX（0.15％）で3回洗浄する
- 4％PFA / PBSで再修正のサンプルを氷上で30分間。
- 氷上で30分間にわたってPBS -トリトンX（0.15％）で3回洗浄する。
- 25パーセントメタノール、50％メタノール、75％メタノール、および各ステップのための10分で100％のメタノール：等級メタノール/ PBS -トリトンXシリーズを通して試料を脱水する。 10分後に新鮮なメタノールと100％のメタノールを交換し、室温で1時間インキュベートします。
- 1:2の比率で：ガラス容器、ミックスBABB（安息香酸ベンジルベンジルアルコール）で。 50％のBABBと50％のメタノールの最終濃度MeOHでBABBを組み合わせる。 10〜15分のMeOH：BABBのサンプルをインキュベートする。
- 室温で、10〜15分間またはクリアされるまで100パーセントBABBとインキュベートしたガラス容器にサンプルを移す。
- 新鮮な100％BABBでうつ病のスライド（0.7ミリメートルの深さ）を記入し、側にサンプルを移す。マニキュアの2-3コートとガラス（第1.5）とシールをカバーに追加します。室温で暗所で固めるにマニキュア爪を許可し、4でサンプルが格納℃に
注：スライドが完全に共焦点画像の取得前に封印されている必要があります。蛍光色素はBABBでフェードインできるように画像は、12〜24時間以内に取得しておく必要があります。 - "画像取り込み"セクションに進んでください。
5。画像の取得
- 画像10μmの488プラン-アポクロマート20X/0.8目標（512 × 512ピクセル）を使用して共焦点顕微鏡で凍結切片- （FITC-dextran/GSL 1 -イソレクチンB 4）、543 - 、、633 nmのレーザーラインが。
- 共焦点取得全体のマウントの皮膚と50μmの488プラン-アポクロマート10X/0.4目的を（512 × 512ピクセル）を使用してアガロース包埋切片のzセクション- （FITC-dextran/GSL 1 - B 4イソレクチン）、543 - 、 、633 nmのレーザーライン。シリアルZ -セクションは、それぞれのチャネルに対して1ミクロンで連続して収集する必要があります。
- ツァイスAxioVisionの4.6または他の画像解析ソフトウェアを使用してシリアルZ -セクションを再構築。
6。代表的な結果：
胚の血管系の効率のよいラベリングには、マウス胎児の血管の欠陥を評価するために重要です。図1は、それぞれ、右と左心室（1E - F）の染色に加えて、CD31（1B）で特定のE16.5胸腺の血管（1A - B）のラベルとの共同ラベルを示しています。 GSL I -イソレクチンBなどのセクション1,3、および5に記載された凍結切片のための4プロトコルは、これらの実験で使用されていた。ホールマウントのE16.5マウスの皮膚の血管のネットワークのラベル、セクション1、2に記載されているプロトコルを使用して、そして5は図1C - Dに示されています。
1凡例を示しています。 FITC GSL I - E16.5マウス胚にイソレクチンB 4顔面静脈注射。胎児の皮膚の血管系は、次の注射の注射後の胚の胸腺のA.の凍結切片。イソレクチンB 4とCD31の共ラベルのB.マージします。c.及び d.ホールマウント。E.と胎児心eのfの凍結切片（右心室）F.（左心室）、次の注入。
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Discussion
セクションの全体のマウントおよびPECAM - 1（CD31）染色は、マウス胎児の血管系を標識するための従来の方法です。これらのメソッドは、直接および/または間接免疫蛍光法、およびマウスの組織を透過性に洗剤を使用する必要があります。これはかなりタイムリーなプロセスであることが分かる。ここで、我々はそれによって抗体のラベリング手順の必要性を取り除きました、B 4顔面静脈注射は直接胚の血管系にラベルを付けるためにFITC -デキストランまたはイソレクチンを採用している。 "漏れ"表現型がこのメソッドではなく、従来の抗体染色法によって明らかにされるとさらに、この方法は、血管系の機能状態を評価することができます。
我々は、胚の胸腺のセクションを分析し、心臓だけでなく、まもなく顔面静脈注射後の皮膚の血管系の全体のマウントでは、この手法の効率性を検証しています。さらに、我々はCD31以下FITC -デキストランまたはそのFITCは特に胚の血管構造を標識する実証するためにイソレクチンB 4注射のためのステンド胸腺セクションがあります。したがって、胚におけるFITC -デキストランまたはイソレクチンB 4顔面静脈注射は、急速に発展を通じて、複数の臓器の血管の表現型を評価するために利用することができます。さらに、この方法では、研究者は血管新生を介して、末梢胚の血管系は関心の臓器に接続するには、開発中に特定の時間を決定することができます。我々は、このFITC -デキストランまたはイソレクチンB 4プロトコルと互換性のある抗体標識プロトコルが含まれています。このプロトコルを使用して、血管の構造部品にラベルを付けるPDGFR -β、SMA -α、および他の抗体は、、さらに胚の血管の欠陥の性質を評価するために用いることができる。
重要な注意事項：このようなファストグリーンなどの色素がFITC-dextran/GSL 1に追加することができます-イソレクチンB 4ソリューションを、それが顔面静脈に注入される混合物を視覚化するために。まもなくFITC -デキストラン注入後、色素が卵黄嚢および胎盤を通じて臍帯静脈や血管の観察することができます。この時点では、臍帯は、胚から削除する必要があります。色素が尿膜茎（臍動脈と静脈）で検出されていないことをイベントでテクニックはおそらく失敗しました。我々は、針が直接顔面静脈を入力しない場合は、FITC -デキストラン/フルオレセインGSL 1というラベルの付いたことを観察した-イソレクチンB 4は、顔の隣接した領域に蓄積する。イソレクチンB 4のラベルほとんどの胚性血管構造だけでなく、非血管細胞を肝臓に-我々はまた、FITC -デキストランはGSL 1一方、全体の血管をラベルすることを観察した。蛍光解剖顕微鏡は、注入が成功したかどうかをテストするために使用することができます。
マウス
C57BL6 / Jマウスは、ジャクソン研究所（バーハーバー、ME）から購入した。胚は野生型、時限交配によって生成されました。実験は、ジョージア州の動物実験の大学および使用委員会によって承認された。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
この作品は、NIAIDからNRMとJLBにSREBの博士論文フェローシップ賞への助成金番号R01AI055001とR01AI082127によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FITC-dextran | Sigma-Aldrich | FD150S-1G | |
| Fluorescein labeled GSL 1 - isolectin B4 | Vector Laboratories | FL-1201 | |
| Fast Green | MP Biomedicals | 195178 | |
| PFA | Fluka | 76240 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| Optimal Cutting Temperature Compound (O.C.T. | VWR international | 25608-930 | |
| Acetone | JT Baker | 9006-33 | |
| Donkey Serum | Jackson | 017-000-121 | |
| rat anti-mouse CD31, | BD Biosciences | 558736 | |
| goat anti-mouse PDGFR-β | R&D Systems | AF1042 | |
| donkey anti-rat CD31 Alexa 647 (Invitrogen) | Biolegend | 102516 | |
| donkey anti-goat Alexa 594 (Invitrogen) | Invitrogen | A11058 | |
| Triton X -100 | Sigma-Aldrich | X-100 | |
| Low melt agarose/PBS | Sigma-Aldrich | A9414-25G | |
| Methanol | Fisher Scientific | A413-4 | |
| Benzyl Alcohol | Acros Organics | 148390010 | |
| Benzyl Benzoate | Acros Organics | 105860010 | |
| Depression slides | Fisher Scientific | S175201 | |
| Fluorogel | Electron Microscopy Sciences | 17985-10 | |
| Cover Glass (22X22)-1.5 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 152222 | |
| Zeiss LSM 510 Meta Confocal Microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Micro dissecting forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5135 | |
| Parafilm No. OM992 | Fisher Scientific | 13-374-16 | |
| 12 and 24 well microplates | Evergreen Scientific | 222-8044-01F | |
| Superfrost/PlusMicroscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| 4mL clear vials | National Scientific Company | B7800-2 |
References
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