लक्ष्य आईडी लाइब्रेरी एक प्लाज्मिड आधारित, जीनोम चौड़ा क्लोन miRNA लक्ष्यों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया सीडीएनए का संग्रह है. यहाँ हम इसके उपयोग और आवेदन प्रदर्शित करता है.
लक्ष्य आईडी पुस्तकालय के लिए खोज और microRNA की पहचान (miRNA) के लक्ष्य में सहायता करने के लिए डिज़ाइन किया गया है. लक्ष्य आईडी लाइब्रेरी एक प्लाज्मिड आधारित, जीनोम चौड़ा सीडीएनए से दोहरे चयन संलयन प्रोटीन, thymidine kinase – zeocin के (TKzeo) से 3'UTR अनुप्रवाह में क्लोन पुस्तकालय है. चुनाव के पहले दौर स्थिर transformants के लिए है, ब्याज की एक miRNA की शुरुआत के साथ पीछा किया, और अंत में, miRNA लक्ष्य युक्त cDNAs के लिए चयन. चयनित cDNAs अनुक्रमण (चित्रा लक्ष्य आईडी लाइब्रेरी कार्यप्रवाह और जानकारी के लिए 1-3 देखें) की पहचान कर रहे हैं.
मानव transcriptome की व्यापक कवरेज सुनिश्चित करने के लिए, लक्ष्य आईडी पुस्तकालय cDNAs oligo-dt भड़काना कई मानव ऊतकों और सेल लाइनों से तैयार कुल शाही सेना के एक पूल का उपयोग कर के माध्यम से उत्पन्न किया गया. सीडीएनए रेंज 0.5 से 4 केबी करने के लिए जिसके परिणामस्वरूप, 1.2 केबी के एक औसत आकार के साथ, और थे p3TKzeo दोहरे चयन प्लाज्मिड में क्लोन (चित्रा 4 के लिए प्लाज्मिड नक्शा देखें). जीन ली में प्रतिनिधित्व लक्ष्यbrary सिग्मा Aldrich वेबपृष्ठ पर पाया जा सकता है. Illumina (तालिका 3) अनुक्रमण, से परिणाम बताते हैं कि पुस्तकालय UCSC RefGene में 21,518 अद्वितीय जीन (79%) 16,922, या 10 या पढ़ता अधिक (66%) के साथ 14,000 जीन शामिल हैं.
microRNAs 20-24 nucleotide RNAs कि जीन की अभिव्यक्ति के बाद transcriptionally बाधा mRNA अनुवाद, विनियमित और अक्सर, लक्षित mRNA के [6] समीक्षा को अस्थिर कर रहे हैं. एक एकल miRNA कई सौ mRNAs को विनियमित करने के लिए एक सेल विकास और पर्यावरण के संकेत के लिए प्रतिक्रिया को नियंत्रित कर सकते हैं. पहचान करना और लक्ष्य mRNAs मान्य एक miRNA और इन रास्ते में भूमिका समारोह का निर्धारण करने में आवश्यक है. हालांकि, लक्ष्य पहचान सरल है, क्योंकि पशुओं में, miRNAs और उनके लक्षित साइटों को पूरी तरह से पूरक नहीं कर रहे हैं नहीं है. "बीज" क्षेत्र, के माध्यम से 7-5'miRNA के अंत से 2 कुर्सियां, आमतौर पर अपने लक्ष्य को पूरक है. हालांकि, वहाँ बीज नियम के कई अपवाद हैं, और बहाव के आधार – बाँधना एक अपूर्ण बीज मैच के लिए क्षतिपूर्ति कर सकते हैं. कंप्यूटर एल्गोरिदम के एक संख्या miRNA बीज मिलान और बहाव मुआवजा, लक्ष्य संरचना पर आधारित लक्ष्य की भविष्यवाणी एक विकसित किया गया हैघ स्थिति, अनुक्रम संरक्षण, और विभिन्न अन्य मानकों कि प्रयोगात्मक मान्य लक्ष्यों [7] समीक्षा के लिए मनाया गया है. जबकि सिलिको में भविष्यवाणी सुविधाजनक है और पहचान कई वैध miRNA लक्ष्य करते हैं, सबसे भविष्यवाणी जीन प्रयोगात्मक सत्यापन परीक्षण विफल, और कई वास्तविक लक्ष्य नहीं की भविष्यवाणी कर रहे हैं. इसके अलावा, के बाद से कंप्यूटर एल्गोरिदम पहले से निर्धारित लक्ष्य सुविधाओं पर आधारित हैं, वे लक्ष्य है कि क्या पहले से ही जाना जाता है से विचलित की खोज नहीं की अनुमति नहीं है.
प्रायोगिक प्रणाली के एक नंबर सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है की पहचान करने या जीवित कोशिकाओं में कार्यात्मक miRNA लक्ष्य की खोज. इन वैश्विक स्क्रीनिंग तरीकों डीएनए और शाही सेना अनुक्रमण, शाही सेना सह immunoprecipitation (आरआईपी), और स्थिर आइसोटोप सेल संस्कृति में एमिनो एसिड के साथ लेबल (SILAC), एक प्रोटिओमिक विधि ([7] समीक्षा) शामिल हैं. प्रत्येक विधि फायदे और नुकसान है. लक्ष्यीकरण miRNA के बाद से अक्सर एक mRNA के destabilizes और उसके क्षरण, नुकसान ओ की ओर जाता हैmRNA के स्तर में शुरू एक miRNA नकल या अवरोध करनेवाला, क्रमशः के बाद आर लाभ, miRNA लक्ष्यों की पहचान कर सकते हैं. इस mRNA की हानि या लाभ माइक्रोएरे या गहरी अनुक्रमण द्वारा आसानी से पता चला है. जबकि mRNA के तरीकों का पता लगाने के रूप में सरल और प्रोटीन का पता लगाने के तरीकों की तुलना में अधिक संवेदनशील हैं, mRNA का पता लगाने के किसी भी miRNA लक्ष्य है कि अपमानित नहीं कर रहे हैं याद आएगी. Bartell प्रयोगशाला से हाल की रिपोर्ट आरएनए का पता लगाने से SILAC से उन लोगों के साथ miRNA लक्ष्य परिणामों की तुलना [8] या ribosome रूपरेखा [9] संकेत मिलता है कि स्तनधारी miRNAs मुख्य रूप से लक्ष्य mRNA स्तर को कम करने से काम करते हैं. हालांकि, कई अन्य व्यक्ति miRNA लक्ष्य के साथ काम कर रहे प्रयोगशालाओं प्रोटीन में परिवर्तन पर mRNA के स्तर में कोई परिवर्तन नहीं पाया है. क्या नहीं detectable mRNA हानि के साथ translational विनियमन होना दिखाई देते हैं की रिपोर्ट में शामिल हैं: मीर-10b HOXD10 पर [10], p27kip1 पर miR221/222 [11], Pdcd4 पर मीर-21 [12], मीर -126 p85β पर [13] SIRT1 पर मीर-34 [14], PTEN [15], मीर 302d Arid4b पर [16], मीर 200C JAG1 पर [17], और मीर 299, 297, 567, एक को मीर-21VEGFA पर एन डी 609 [18] इसके अलावा, Clancy है एट अल [19] हाल ही में खबर दी है कि चलो – 7 translational विनियमन ही पता चला था जब व्यक्ति mRNA के isoforms कि चलो-7 लक्ष्य साइट होते चुनिंदा पाया गया. बाद पता चलता है कि, कुछ मामलों में कम से कम, translational विनियमन एक समग्र प्रोफ़ाइल में अनदेखा किया जा सकता है – कि है, जब सभी mRNA के isoforms एक mRNA के रूप में पाया जाता है – के रूप में कई माइक्रोएरे और अनुक्रम विश्लेषण के साथ प्राप्त की. Argonaute (Ago2 आमतौर पर) या अन्य जुड़े प्रोटीन (आरएनए, immunoprecipitation, या आरआईपी) के माध्यम से miRNA mRNA के परिसरों के सह immunoprecipitation miRNA लक्ष्य विनियमन तंत्र की परवाह किए बिना अलग होगा. इसके अलावा, चीर अंतर्जात, और संभाव्यतः biologically प्रासंगिक पता लगाता है, बातचीत. हालांकि, यह ज्ञात नहीं है कि सभी miRNA mRNA के बातचीत कार्य कर रहे हैं, और चीर किसी भी mRNA का लक्ष्य है कि केवल अस्थायी रूप से, क्षणिक रूप से सहयोगी या तेजी से अपमानित कर रहे हैं याद होगा. इसके अलावा, विशिष्ट miRNA mRNA के भागीदारों bioinformati inferred किया जाना चाहिए हैबड़ी सफाई क्योंकि सभी miRNA mRNA के जोड़े के साथ सह उपजी. अंत में, SILAC सीधे miRNA विनियमन, प्रोटीन ही अंतिम उत्पाद को दिखाता है, लेकिन असंवेदनशील है और इसलिए दुर्लभ प्रोटीन और प्रोटीन के स्तर में छोटे गुना परिवर्तन को याद करते हैं.
वर्तमान miRNA लक्ष्य पहचान तरीकों के साथ सीमाओं के प्रकाश में, हमें लगा कि एक अतिरिक्त वैश्विक परख के लिए एक वैकल्पिक तंत्र द्वारा कार्यात्मक miRNA लक्ष्यों की पहचान की जरूरत थी. इस जरूरत को पूरा करने के लिए, हम एक – Joop Gaken और किंग्स कॉलेज लंदन के अजीम Mohamedali द्वारा आविष्कार प्रौद्योगिकी लाइसेंस. उनके आविष्कार एक दोहरी चयन संलयन प्रोटीन है, विशेष रूप से, thymidine kinase – zeocin संलयन, अपने 3'UTR में संभावित miRNA लक्ष्य दृश्यों का एक सीडीएनए लाइब्रेरी द्वारा विनियमित. Stably और व्यक्त करने के साथ TKzeo – सीडीएनए constructs ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं zeocin साथ चुना जा सकता है, के रूप में 2 चित्र में सचित्र. ब्याज की एक miRNA व्यक्त करने के बाद, कि miRNA लक्ष्य वाई चुना जा सकता हैवें ganciclovir, के रूप में 3 चित्र में सचित्र. Ganciclovir thymidine kinase, कि, किसी भी कोशिकाओं है TKzeo सीडीएनए व्यक्त ब्याज की miRNA के लिए एक लक्ष्य की कमी व्यक्त की कोशिकाओं को मारता है. लक्षित कि ganciclovir का उपयोग प्राइमरों कि पार्श्व सीडीएनए, पीसीआर और उत्पादों के लिए लक्ष्यों की पहचान अनुक्रम किया जा सकता है बच कोशिकाओं से डीएनए के पीसीआर प्रवर्धन के सीडीएनए अलग किया जा सकता है.
मिशन का लक्ष्य आईडी लाइब्रेरी – हम वैश्विक और कार्यात्मक मानव miRNA लक्ष्यों की पहचान की खोज के लिए एक नए उपकरण में कॉलेज के राजा तकनीक विकसित की है. लक्ष्य आईडी पुस्तकालय के साथ, उपयोगकर्ताओं को स्तनधारी सेल संस्कृति अभिकर्मक और दवा चयन चरणों की एक श्रृंखला के द्वारा miRNA लक्ष्य को अलग कर सकते हैं. लाइब्रेरी व्यापक है, और मानव जीन की 66-79% होता है. प्रारंभिक परिणामों से संकेत मिलता है कि दोनों पहले के रूप में के रूप में अच्छी तरह से पता चला नए लक्ष्य मिशन लक्ष्य आईडी लाइब्रेरी से अलग किया जा सकता है.
हालांकि कुछ लंबाई के प्रोटोकॉल है,स्तनधारी सेल संस्कृति, अभिकर्मक, दवा चयन, पीसीआर, और अनुक्रमण – लक्ष्य आईडी पुस्तकालय का उपयोग मानक आणविक प्रयोगशाला तकनीकों की आवश्यकता होती है और इसलिए, अच्छी तरह से अधिकांश जीव के मतलब के भीतर होना चाहिए. हमारा सुझाव है कि पर्याप्त ध्यान उचित प्रयोगात्मक डिजाइन करने के लिए भुगतान किया जाएगा, संस्कृति की स्थिति के अनुकूलन, और सबसे महत्वपूर्ण बात, प्रत्येक नया सेल प्रकार चयन कदम (निकम्मा घटता) लक्ष्य आईडी पुस्तकालय के साथ सफलता सुनिश्चित करने के लिए इष्टतम दवा का स्तर निर्धारित पूर्व परीक्षण.
सभी miRNA लक्ष्य पहचान तरीकों के साथ के रूप में, यह अत्यधिक की सिफारिश की है कि लक्ष्य आईडी लाइब्रेरी स्क्रीनिंग के ठिकानों की पहचान माइक्रोएरे, qRT-पीसीआर, संवाददाता परख (यानी, luciferase) के, या पश्चिमी विश्लेषण के रूप में एक दूसरी विधि के साथ मान्य किया जा.
The authors have nothing to disclose.
हम उसे समर्थन और उपयोगी समस्या निवारण चर्चा में भाग लेने के लिए पूरे सिग्मा लाइफ साइंस मिशन लक्ष्य आईडी पुस्तकालय विकास टीम, प्रौद्योगिकी खोज और लाइसेंस शर्तों को बातचीत के लिए विशेष रूप से केविन Gutshall, और हीथ Holemon के धन्यवाद. हम भी स्वतंत्र रूप से यह क्लोन में सीडीएनए का एक बड़ा बैच और उसके हठ की तैयारी के लिए अप्रकाशित परिणाम और सुझाव, और RxBiosciences काजी हामिद साझा करने के लिए किंग्स कॉलेज लंदन के डॉ. Joop Gäken धन्यवाद. हम SAFC से नेन लिन और स्कॉट बह्र सीडीएनए arrays और डेटा विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए स्वीकार करना होगा.
मिशन सिग्मा Aldrich जैव प्रौद्योगिकी एल.पी. के एक पंजीकृत ट्रेडमार्क है
Name of the reagent | Company | Catalog Number | Comments |
JumpStart REDTaq ReadyMix | Sigma-Aldrich | P0982 | |
Ganciclovir | Sigma-Aldrich | G2536 | |
G418 | Sigma-Aldrich | G8168 | |
Puromycin | Sigma-Aldrich | P9620 | |
Topo TA | Invitrogen | KNM4500-01 | |
GenElute Mammalian Genomic DNA Miniprep Kit | Sigma-Aldrich | G1N10 | |
Cell Specific Nucleofection kit | Lonza | ||
Nucleofector | Lonza | AAD-1001 | |
Zeocin | Invitrogen | R250-01 | |
Target ID Library | Sigma-Aldrich | MREH01 |