En metod för att övervaka ubiquitin-proteasom aktivitet i levande celler beskrivs. En degron-destabiliserade GFP-(GFP-DGN) och en stabil GFP-dgnFS fusionsprotein genereras och transduceras in i cellen med användning av en Lentiviral expressionsvektor. Denna teknik gör det möjligt att generera en stabil GFP-dgn/GFP-dgnFS uttryckande cellinje i vilken ubiquitin-proteasom aktivitet kan enkelt bedömas med epifluorescens eller flödescytometri.
Proteasom är den viktigaste intracellulära organell involverade i den proteolytiska nedbrytningen av abnorma, felveckade, skadade eller oxiderade proteiner 1, 2. Underhåll av proteasom aktivitet inblandad i många viktiga cellulära processer, såsom cellens stressrespons 3, cellcykelreglering och cellulär differentiering 4 eller immunsystemet 5. Dysfunktion i den ubikitin-proteasom-systemet har kopplats till utvecklandet av tumörer och neurodegenerativa sjukdomar 4, 6. Dessutom observerades en minskning proteasom aktivitet hittades som en funktion av cellulärt åldrande och organismbiologi åldrande 7, 8, 9, 10. Här presenterar vi en metod för att mäta ubiquitin-proteasom aktivitet i levande celler med hjälp av en GFP-DGN fusionsprotein. För att kunna övervaka ubiquitin-proteasom aktivitet i levande primära celler, konstruerar komplementär DNA som kodar för ett grönt fluorescerande protein (GFP)-DGN fusionsprotein (GFP-DGN, unstable) och en variant som bär en ramskiftesmutation (GFP-dgnFS, stabil 11) sätts in i Lentiviral expressionsvektorer. Vi föredrar denna teknik jämfört med traditionella transfektionstekniker eftersom det garanterar en mycket hög transfektionseffektivitet oberoende av celltyp eller ålder hos givaren. Skillnaden mellan fluorescens visas av GFP-dgnFS (stabil) protein och den destabiliserade proteinet (GFP-DGN) i frånvaro eller närvaro av proteasomhämmare kan användas för att uppskatta ubiquitin-proteasom aktivitet i varje enskilt cellstam. Dessa skillnader kan övervakas genom epifluorescensmikroskopi eller kan mätas genom flödescytometri.
Den första publikationen med grönt fluorescerande protein (GFP) som reporter substrat för ubiquitin-proteasom aktivitet publicerades 2000 12. Sedan dess har GFP blivit ett vanligt verktyg för att visualisera cellulära aktiviteter, speciellt ubiquitin-proteasom process. För att övervaka ubikitin-proteasom aktivitet in vivo en transgen musmodell med en GFP-baserad reporter har införts 13. Ytterligare in vivo-forskning, inrättat en transgen musmodell med en liknande degron-d…
The authors have nothing to disclose.
Denna studie har finansierats av: National Research Network on Aging (NFN S93) av den österrikiska Science Foundation (FWF), Europeiska kommissionen integrerade projekt MiMAGE och PROTEOMAGE, Nederländerna Genomics Initiative / Nederländerna organisationen för vetenskaplig forskning (NGI / NWO, 05.040.202 och 050 – 060-810 NCHA), det EU-finansierade Network of Excellence Lifespan (FP6 036.894) och innovationsinriktade forskningsprogram om Genomics (SenterNovem, IGE01014 och IGE5007).
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
pEGFP-C1 Vector | BD Bioscience Clontech | 6084-1 |
pENTR Directional TOPO Cloning Kit | Invitrogen | K2400-20 |
pLenti6/V5 Directional TOPO Cloning Kit | Invitrogen | V496-10 |
Lipofectamine 2000 Reagent | Invitrogen | 11668019 |
DMEM | Sigma | D5546 |
PVDF filter (Rotilabo-Spritzenfilter) | Roth | P667.1 |
Polyethylene glycol | Sigma | P2139 |
NaCl | Merck | 1.06404.1000 |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline 1x (PBS) | Invitrogen | 14190 |
hexadimethrine bromide | Sigma | 10,768-9 |
Blasticidin | Invitrogen | R21001 |
Crystal violet | Sigma | C3886 |
FACS tubes | BD Biosciences | |
Penicillin Streptomycin (Pen-Strep) | Invitrogen | 15140130 |
L-glutamine 200 mM | Invitrogen | 25030024 |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Biochrom AG | S0115 |
MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) 100x | Invitrogen | 11140035 |
MEM Sodium Pyruvate 100 mM | Invitrogen | 11360039 |
D-(+)-Glucose (45%) | Sigma | G8769 |
Geneticin | Invitrogen | 11811023 |
CaCl2 | Merck | C5080 |
Hepes | Sigma | H3375 |
Trypsin-EDTA (0.05%) | Invitrogen | 25300054 |