Summary
生きた細胞内でユビキチン - プロテアソーム活性をモニターするための方法が記載されている。デグロン - 不安定化のGFP（GFP-DGN）と安定したGFP-dgnFS融合タンパク質が生成され、レンチウイルス発現ベクターを用いて細胞内に伝達される。この手法は、ユビキチン - プロテアソーム活性を容易に落射蛍光またはフローサイトメトリーを用いて評価することができる安定したGFP-dgn/GFP-dgnFS発現する細胞株を生成することができます。
Abstract
プロテアソームは異常、誤って折り畳まれた、破損したり、酸化されたタンパク質1、2のタンパク質分解に関与する主な細胞内小器官である。プロテアソーム活性の維持は、細胞のストレス応答3、細胞周期の調節と細胞分化4または免疫システムの応答5のように、多くの重要な細胞プロセスに関与していた。ユビキチン-プロテアソーム系の機能不全は、腫瘍および神経変性疾患4、6の開発に関係している。さらに、プロテアソーム活性の低下は、細胞老化と生物の老化7、8、9、10の特徴として見出された。ここで、我々は、GFP-DGN融合タンパク質を用いて、生細胞におけるユビキチン - プロテアソーム活性を測定する方法を提案する。初代培養細胞を生体内でユビキチン - プロテアソーム活性をモニターすることができるように、相補的DNA（緑色蛍光タンパク質（GFP）-DGN融合タンパク質をコードする構築物のGFPDGN、不安定な）とフレームシフト突然変異を運ぶバリアント（GFP-dgnFS、安定した11）レンチウイルス発現ベクターに挿入されます。それは細胞のタイプやドナーの年齢とは無関係非常に高いトランスフェクション効率を保証しますので、我々は伝統的なトランスフェクション技術を介して、この手法を好む。プロテアソーム阻害剤の非存在下または存在下でGFP-dgnFS（安定した）タンパク質と不安定化タンパク質（GFP-DGN）によって表示される蛍光の差は、それぞれの特定の細胞株ではユビキチン - プロテアソーム活性を推定するために使用することができます。これらの違いは、落射蛍光顕微鏡によって監視することができますまたはフローサイトメトリーで測定することができる。
Protocol
1。プラスミド構築
- オーダーカスタムオリゴヌクレオチドDGN（ACKNWFSSLSHFVIHL 11）とdgnFS（HARTGSLACPTSSSICE）のエンコードおよびDGN / dgnFS（ 図1）とGFPの融合を得るためのpEGFP-C1ベクターにそれを連結。
- pENTR方向性TOPOクローニングキットのプロトコールに従ってPCRにより、GFP-DGNおよびGFP-dgnFSのコード配列を増幅し、pLenti6/V5方向性TOPOクローニングキット（ 図6）に進みます。
2。ウイルス産生
- 彼らはトランスフェクションの日に90〜95％コンフルエントになるようにT75フラスコのHEK 293FT細胞外にトランスフェクションの前日（1日目）はシード。
- トランスフェクション当日に血清および15mlファルコンで抗生物質を含まないDMEM 1.5mlにリポフェクトアミン2000試薬36μlを希釈します。別の15mlファルコンを使用し、いずれかのGFPを相補的なDNA構築物を運ぶ3μgのpLenti6/V5を薄める -DGNまたはGFP-dgnFS、血清および抗生物質を含まないDMEM 1.5mlに2.5μgのエンベロープのエンコードプラスミドpMD2.Gと7.5μgのベクターバックボーンpsPAX2。 5分後、希釈したDNAは、希釈されたリポフェクトアミン2000試薬と結合されます。
- 形成するために、DNA-リポフェクタミン複合体を許可するように室温で20分間混合物をインキュベートする。
- HEK 293FT細胞の培養液を除去し、培地の7ミリリットル（抗生物質なしで）慎重にそれを交換して、ミキシング用フラスコ、前後にロックして（2日目）にDNA-リポフェクタミン混合物を追加します。加湿した5％CO 2インキュベーター内で37℃で一晩フラスコをインキュベートする。
- 翌日、培地を変更します（抗生物質なしの10 mlの培地、3日目）。
- 48時間後（5日目）収穫上澄み、室温で5分間、300×gで遠心分離し、0.45μmPVDFフィルターを通って上清をフィルターします。
培地- DMEM（HEK 293FT）
テント "> DMEM10％のFBS
0.1mMのMEM NEAA
6 mM L-グルタミン
1mMのMEMピルビン酸ナトリウム
1パーセントペンストレプトマイシン（オプション）
500μg/ mlのジェネティシン（オプション）
3。ポリエチレングリコール（PEG）沈殿によるウイルス濃度
- 4℃で2時間インキュベートした上清の4つのボリュームに℃、1ボリュームのポリエチレングリコール溶液（PEG 50mMのポリエチレングリコール、41 mMのNaCl、オートクレーブは、pH = 7.2）を追加慎重にそれを反転させて20〜30分毎に混ぜる。
- 4℃で30分間1500 xgでスピンダウンホワイトペレットが見えるはずです。
- 上清を吸引除去し、4℃で5分間1500 xgで再度遠心操作残りのPEG溶液を吸引します。
- 媒体またはでペレットを再懸濁し、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）でピペッティングし、ダウンしてから、20〜30秒間激しくボルテックスすることによって。ガイドラインとして1 T75フラスコとアリコートそれ100μlに、500μlを使用しています。 -80℃でウイルス℃で保存
- うち5種×6ウェルプレートの各ウェルに10 4 U2-OS細胞トランスフェクションの前日。
- トランスフェクションの日に培地を除去し、8μg/ mlのポリブレンを（ヘキサジメトリンブロマイド）を含むDMEMを1ミリリットルでそれを交換してください。濃縮ウイルス上清1:10〜1:100に希釈し、よく一つに1μlのそれぞれに追加します。高いウイルス濃度の場合は1μL、5μLと残りのウェルのために濃縮したウイルス上清10μlを使用しています。一つは、よくポジティブコントロールとして残されます。
- 次の日は、DMEM 2 mlで培地を交換してください。
- 選択翌日から始まります。各ウェルに10μg/ mlのブラスチシジンを適用します。一日おきに抗生物質を含む媒体を交換してください。
- 非形質導入細胞の選択を開始した後、約6-7日で死んでいる。染色のために、PBSで細胞を3回洗浄し、クリスタルバイオレット（10 mg / lのクリスタルバイオレットで細胞をカバー20％エタノール）を加え、室温で5〜10分間インキュベートする。吸引クリスタルバイオレットを（数回再利用できます）と蒸留H 2 Oで2回ウエルを洗浄し、プレートを乾燥させます。
- コロニーをカウントし、千と対応する希釈（ 図7）で乗算します。この手順では、ウイルス/ mlのトランスフェクションユニット（TU）を計算することができます。
培地- DMEM（HFF-2/U2-OS）
DMEM
10％のFBS
6mMのL-グルタミン
1パーセントペンのStrep
5。ヒト二倍体線維芽細胞の形質導入（この手順は、任意の細胞型にも使用できます。）
- うち5種×10 4個のヒト二倍体線維芽細胞（HDFS）6ウェルプレートに伝達前日。
- 1ミリリットルの合計で伝達エンハンサーとして8μg/ mlのポリブレンとともに2つの感染多重度を使用しています。
- 翌日、培地を変更します。
- 時細胞がコンフルエントの70〜80％にある10μg/ mlのブラストサイジンを使用して、選択を開始します。選択が完了したら（これ以上トランスフェクトしていない細胞が死なない）細胞の増殖を開始することができ、細胞は実験のための準備が整いました。ブラストによる慢性選択がプロテアソーム活性を測定する準備ができ、安定した細胞株を過剰発現するGFP-DGNまたはGFP-dgnFS融合タンパク質を生成することができます。この手順では、細胞型の独立した非常に高いトランスフェクション効率を保証します。
6。フローサイトメトリーによる測定
- うち1種×10 5個の細胞（GFP-DGNまたはGFP-dgnFSどちらを運ぶ）実験の前日。
- コントロール細胞の前で3時間プロテアソーム阻害剤を用いた測定、 例えば、100μg/ mlのLLNLを扱う。
- PBSで2回洗浄し、トリプシンの0.5mlを用いて細胞を収穫します。トリプシン処理を停止するには培地の4.5mlを使用し、15mlファルコンにセルを転送します。
- スピントン室温で5分間、300×gで彼は細胞。
- 、培地を吸引除去し、PBSに細胞を再懸濁し、37℃で5分間300 xgで再びスピンダウン℃に
- FACS緩衝液（10mMのHepes、140mMのNaCl、2.5 mMのCaCl 2、pH = 7.4）中の400μlに再懸濁し、PBSを吸引除去し、FACSチューブに細胞を移す。
- フローサイトメトリーによって氷と測定試料に対して細胞を維持。細胞は4℃でより長い30分を保存するべきではありません
7。代表的な結果
GFP-DGN融合タンパク質は、タンパク質従ってプロテアソームを標的とする配列を担持し、すぐに分解され、それはGFP蛍光シグナルの減少に対応しています。フレームシフト突然変異体（GFP-dgnFS）このシーケンスの変異バージョンを運び、プロテアソームによって分解されない、それは、より高い緑色蛍光につながる。これらの理由から、期待の高いプロテアソーム活性を持つ若いHDFSとGFP-DGで形質導入n個のフローサイトメトリー測定の両方でと落射蛍光（ 図2AおよびB、図3）の低（6％陽性細胞）の蛍光シグナルを示す。同じHDFSは陽性細胞の39.7パーセントを表示し、GFP-dgnFSで形質導入した。プロテアソーム阻害剤LLNL（N-アセチル-L-ロイシル-L-ロイシル-L-norleucinal）で細胞を処理するには、GFP-DGNおよびGFP-dgnFS細胞（ 図2AおよびBの両方で62.9％の最高に信号を発生させた）。
老化ヒト皮膚試料におけるプロテアソーム活性の可能性低下を判定するには、若い中年と古いドナーから単離し真皮線維芽細胞は、GFP-DGNおよびGFP-dgnFSに感染していた、上記のようにし、フローによる分析前に、同じ継代数に培っメトリ。これらの実験では、若い人（11.2±0.88パーセントGFP陽性細胞）と中年のドナー（20.4±2.27パーセントGFP陽性細胞は、P = 0.003）の間にGFPシグナルで明確な増加が示す、観察されているプロテアの減少高齢ドナー7（ 図4）から得られた試料でOME活動。プロテアソーム活性のさらなる減少は最古の個体（ 図4）から単離された線維芽細胞では観察されなかった。 GFP-dgnFSの蛍光強度は、すべてのケースであった〜3年齢別グループのために高いトランスフェクション効率を示している90％（データは示さず）。
図1。 GFP-DGNおよびGFP-dgnFSシーケンス。表示は、GFP（緑色）のpEGFP-CL1はベクトル（灰色）とDGN / dgnFSシーケンス（赤）のマルチクローニング部位の3 '末端である。
図2。 GFP-DGNおよびGFP-dgnFSヒト二倍体線維芽細胞のフローサイトメトリー分析。 A. Youngにヒト包皮線維芽細胞（HFF-2）は、緑色蛍光タンパク質を運ぶレンチウイルスベクターを感染させた（GFP）-DGN遺伝子またはGFP-dgnFS（フレームシフト）は、フローサイトメトリー（FACS CantoのⅡ、Becton Dickinson）を用いてGFP蛍光のために示され、分析、構築します。示される場合、細胞はまた、プロテアソーム阻害剤N-アセチル-L-ロイシル-L-ロイシル-L-norleucinal（LLNL）で3時間処理した。非感染細胞を対照として用いた。実験は3連で行った。Bのデータは、3つの独立した実験の代表である。数字はGFP陽性細胞の量を反映しています。 拡大図を表示するにはここをクリック 。
図3。 GFP-DGNおよびGFP-dgnFS HFF-2細胞の蛍光顕微鏡分析。HFF-2ヤングは、 図2と同様に処理した。感染後9日目に、細胞はvであった蛍光および位相差顕微鏡によりisualized。
図4。人間の皮膚の老化におけるプロテアソーム活性の変化。指示の年齢層で9つの異なるドナーからのヒト包皮線維芽細胞が最小限拡大およびGFP-DGNをコードするレンチウイルスコンストラクトで感染させた。感染後9日目に、細胞をフローサイトメトリーによって分析した。データが重複での年齢グループごとに3つのサンプル（±SE）で得た。
図5。 DGNとdgnFSのための実験的なアプローチ。カスタムオリゴヌクレオチドはのpEGFP-C1ベクターにクローン化され、ウイルスをHEK 293FT細胞を用いて、各構築物のために生産されています。ウイルスの力価が決定される。細胞がウイルスで形質導入と展開されます。有利な治療の後、細胞を分析したフローサイトメトリーによる蛍光シグナルのために。
図6。 pLenti GFP-DGNの地図。GFP-DGN配列を含むpLenti6/V5-DESTベクターのマップが表示されます。略語：PCMV（CMVプロモーター）、GFP-DGN（GFP-DGNのシーケンス）、P SV40（SV40初期プロモーター）、EM7（EM7プロモーター）、ブラスチシジン（ブラストサイジン耐性遺伝子）とΔU3/ 3'LTR（3'LTR削除されたU3領域）、SV40 PA（SV40ポリアデニル化シグナル）、アンピシリン（アンピシリン耐性遺伝子）、pUC系ORI（PUC由来）、PRSV / 5'LTR（RSV / 5'LTRハイブリッドプロモーター）、Ψ（HIV-1Ψパッケージングシグナル）、RRE（HIV-1のRev応答要素）。
図7。 U2-OSのタイタープレート。U2-OSを6ウェルプレート上に播種し、異なるウイルス濃度（COの1/100と1/10、1、5、10μlの希釈を用いてトランスフェクトした）ウイルス上清をncentrated。一つはよくトランスフェクトしていないコントロール（NT）として使用した。 6-7日後、細胞をクリスタルバイオレットと空気乾燥で染色した。
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Discussion
ユビキチン-プロテアソーム活性のためのレポーター基質として緑色蛍光タンパク質（GFP）を用いた最初の出版は2000年12年に出版された。それ以来、GFPは細胞の活動、特にユビキチン - プロテアソームプロセスを可視化するための共通のツールとなっています。 in vivoでのユビキチン-プロテアソーム活性をモニターするために、GFP-ベースのレポータートランスジェニックマウスモデルが13を導入されました。 in vivoでの研究での追加は、本書14で使用したのと同様デグロン-不安定化GFPレポーターを持つ別のトランスジェニックマウスモデルを確立した。
残念なことに、レポーターとしてGFPがDantuma らによって示されているいくつかの欠陥を持っています。およびBowman ら 12,15。まず、不安定化GFPは未知の理由のためのプロテアソーム阻害することなく、蓄積することができます。ユビキチン - プロテアソーム機械であって、その機能を複数のステップに依存しているシステムは、広告です劣化する前にisturbanceはレポーター基質と偽陽性の効果12の結果の蓄積につながることができます。第二に、GFPをベースレポーター基質は、転写および翻訳の変化に敏感で半減期が短いことに起因しています。 GFP蛍光の変化は、したがって、減少または増加合成と翻訳15の結果である場合があります。これらの問題は、次のようにGFPの改変によって、他の研究で対処されました。
プロテアソーム活性は、細胞老化と生物の老化7、8、9、10に減少していることがわかった。研究高齢化の分野では、焦点は主にプロテアソームが重要な役割を果たして酸化されたタンパク質の除去であり、タンパク質のユビキチン化は、この場合は2の劣化の前にあることを決定的な証拠はありません。前の仕事は、変異uncleavableユビキチン部分とGFPの使用は、pの複雑な過程を研究するのに適していることが示されているroteinの低下16。このGFPを構築ユビキチン機械の障害を介して、その活動への潜在的な影響を受けることなく、プロテアソーム活性をモニターするための可能性を与えます。
本研究では、ヒト二倍体線維芽細胞を生体内でユビキチン - プロテアソーム活性をモニターするためにデグロン - 不安定化GFPベースレポータータンパク質（GFP-DGN）を使用しました。トランスフェクション効率の概要、機能、およびGFP-DGNレポーターの転写/翻訳レベルを持っているために、いくつかの適切なコントロールが含まれていた。我々は、ほとんどない緑色蛍光可視およびプロテアソームの機能が影響を受けることはありませんが存在しないことを示すために若い未処理のGFP-トランスフェクトされたDGN線維芽細胞を用いた。信号はプロテアソームの阻害に増加すること、検証するために、我々は阻害した後GPFの蓄積を見るために、プロテアソーム阻害剤である、GFP-トランスフェクトされたDGN線維芽細胞を治療した。第三の制御として、我々は、GFP-dgnFSを使用していました。この構築物で、我々はoveraを表示することができます細胞株由来の細胞株に、我々は細胞内の構造物の合成率の概要を持っているすべての3つのコントロールと異なることがllのトランスフェクション効率。
ここで紹介する方法は、ユーザが容易にかつ迅速に、生細胞におけるユビキチン - プロテアソーム活性を測定することができます。 GFPレポーター基板の安定過剰発現は、さまざまなテクニック17を達成することができます。このマニュアルでは、細胞へのGFP-DGN cDNAのトランスフェクションは、安定な発現を提供するレンチウイルスシステムによって達成される。さらに、このシステムの使用は、細胞の種類、細胞代謝条件またはドナーの年齢7から独立し、高いトランスフェクション効率を可能にします。我々は、正常にトランスフェクションの他の方法は18に失敗している内皮細胞にDNAを導入するために、このプロトコルを使用している。それにもかかわらず、以前の実験では、培養中に長く展開され、細胞が低い蛍光を表示することを示したもはや淘汰圧が原因の可能性新たにトランスフェクトされた細胞よりも信号。
PEG沈殿、1ml当たり変換ユニット（TU / ml）の力価を高めるために使用されています。良い価は（5×10 5 TU / ml以上）に達している場合は、PEG沈殿を省略することができます。 PEG沈殿中に重要なステップは、積極的な中断や気泡を生成するピペッティングを避けるためです。これは、ウイルス粒子を不活性化し、トランスフェクション効率を有意に減少させることができます。
プロテアソーム阻害剤を使用する場合は先験的な実験が行われるべきである。最終濃度が使用され、インキュベーション時間は細胞の種類に依存しており、実験的に決定されなければならない。 HFF-2細胞上の以前の観察では、LLNLと3Hのインキュベーションが長いティム以上プロテアソーム阻害の副作用が）ので、この1の毒性達することができる高すぎるGFPシグナル阻害剤2の効果）、または3）を超えてはならないことを明らかにしたeの期間。
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Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Acknowledgments
この研究はによって資金を供給された：オーストリア科学財団（FWF）によるエージング（NFN S93）、欧州委員会の統合プロジェクトMiMAGEとPROTEOMAGE、科学研究費オランダゲノミクスイニシアティブ/オランダ機構（NGI / NWOの国立研究ネットワーク、05040202と050 - 060から810 NCHA）、優秀寿命（FP6 036894）、およびゲノミクスのイノベーション指向研究プログラム（SenterNovemのEUの資金ネットワーク; IGE01014とIGE5007）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pEGFP-C1 Vector | BD Bioscience Clontech | 6084-1 | |
| pENTR Directional TOPO Cloning Kit | Invitrogen | K2400-20 | |
| pLenti6/V5 Directional TOPO Cloning Kit | Invitrogen | V496-10 | |
| Lipofectamine 2000 Reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5546 | |
| PVDF filter (Rotilabo-Spritzenfilter) | Carl Roth Gmbh | P667.1 | |
| Polyethylene glycol | Sigma-Aldrich | P2139 | |
| NaCl | Merck & Co., Inc. | 1.06404.1000 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x (PBS) | Invitrogen | 14190 | |
| hexadimethrine bromide | Sigma-Aldrich | 10,768-9 | |
| Blasticidin | Invitrogen | R21001 | |
| Crystal violet | Sigma-Aldrich | C3886 | |
| FACS tubes | BD Biosciences | ||
| Penicillin Streptomycin (Pen-Strep) | Invitrogen | 15140130 | |
| L-glutamine 200 mM | Invitrogen | 25030024 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biochrom AG | S0115 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) 100x | Invitrogen | 11140035 | |
| MEM Sodium Pyruvate 100 mM | Invitrogen | 11360039 | |
| D-(+)-Glucose (45%) | Sigma-Aldrich | G8769 | |
| Geneticin | Invitrogen | 11811023 | |
| CaCl2 | Merck & Co., Inc. | C5080 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Invitrogen | 25300054 |
References
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