Analys av Trunk neurallist cellmigration med en modifierad Zigmond Chamber analys

Summary

Ett tillvägagångssätt att analysera migration av explanterade celler (stam neurallisten celler) beskrivs. Denna metod är billig, mild och kan särskilja kemotaxi från både kemokines och andra influenser av flyttande polaritet såsom de härledda från cell-cell-interaktioner inom den primära stammen neurallisten cellodling.

Abstract

Neurala crest celler (NCC) är en övergående population av celler närvarande i vertebrat utveckling som emigrera från den dorsala neuralröret (NT) efter att ha genomgått en epitelial-mesenkymala övergång ^1,2. Efter EMT, NCC migrera stora avstånd längs stereotypa vägar tills de når sina mål. NCC differentierar till ett brett spektrum av celltyper inklusive nervceller, glia, melanocyter och kromaffinceller ^1-3. Förmåga NCC att nå och erkänna deras rätt målplatser är grundläggande för lämplig bildning av alla strukturer som innehåller stammen NCC-härledda komponenter ^3. Belysa mekanismerna för vägledning för bål NCC migrationen har därför varit en fråga av stor betydelse. Talrika molekyler har visats styra NCC migrering ^4. Till exempel, är trunk NCC känt att repelleras av negativa vägledning ledtrådar såsom semaforin, ephrin, och ligander Slit ^5-8. Men intetills nyligen har kemoattrahenter av bålen NCC identifierats ^9.

Konventionell in vitro metoder för att studera kemotaktiska beteende vidhäftande celler fungerar bäst med odödliggjorda fördelade likartad celler, men är mer utmanande att på vissa primära stamcellskulturer som initialt saknar en homogen fördelning och snabbt skilja (såsom NCC). Ett sätt att homogenisera fördelningen av bålen NCC för kemotaxi studier är att isolera trunk NCC från primära NT explantation kulturer lyft och förnyad utbredning dem att vara nästan 100% sammanflytande. Detta kräver dock plätering metod stora mängder tid och ansträngning att explantera tillräckligt många celler, är hård, och distribuerar trunk NCC på ett olik sätt som finns i in vivo förhållanden.

Här rapporterar vi en in vitro metod som kan utvärdera kemotaxi och andra flyttande svar bålen NCC utan requiringa homogen cellfördelning. Denna teknik utnyttjar time-lapse avbildning av primära, ostörda trunk NCC i en modifierad Zigmond kammare (en vanlig Zigmond kammare beskrivs på annat håll ^10). Genom att exponera trunk NCC vid periferin av kulturen till en chemotactant lutning som är vinkelrät mot deras förutsagda naturligt riktverkan, kan förändringar i flyttande polaritet inducerade av den pålagda chemotactant gradienten detekteras. Denna teknik är billig, kräver odling av endast två NT explantat per replikat behandling, undviker hårda celler lyft (såsom trypsinering), lämnar trunk NCC i en mer likartad distribution till in vivo förhållanden, skär ner den tid mellan explantation och experiment (vilket minskar troligen risken för differentiering), och tillåter tidsförlopp utvärdering av ett stort antal vandrande egenskaper.

Protocol

1. Dag 1: Isolering av bålen neurala rör för övernattning kultur på täckglas

1. Inkubera chick ägg för 56 timmar vid 38 ° C. Ta bort ägg från inkubation milt spraya dem med 70% etanol, och låt dem torka. Bryt äggen öppna i en UV-steriliserad glastallriken.
2. Utdrag varje embryo från sin äggula och placera den i chick Ringers. Gör detta genom att först skära runt dess blod öar med böjda sax, sedan med trubbiga pincett, plocka embryot upp av dess extraembryonic membran och placera den i en steril plast petriskål innehållande chick Ringers lösning.
3. Isolera stammen av varje embryo genom att klippa bort överflödigt extraembryonic membran samt kranium, vagala, och sakrala axiella nivåer med hjälp av en volfram nål (fig. 1). Välj först omkring 9 embryon som är mellan stegen HH15-17 ^11. För stegen HH15 och upp, framhjärnan och bakhjäman axlar bildar en spetsig vinkel och därför huvudet verkar luta kaudalt. Vidsteg HH17 är svansen knopp närvarande och lutar ventralt men ännu inte innehåller somiter. Med en volfram nål, trimma bort extraembryonic membran till ungefär 2 mm från embryot och skära av eventuella embryonala vävnader anterior till somit 10. Ta också bort alla caudal embryonala vävnader från och runt den femte mest nybildade somit.
4. Placera de isolerade embryonala trunkar i Dispas (0,24 U / ml DMEM) och inkubera dem under 1 h 15 min vid 37 ° C och 5% COj _2. När stammarna börjar inkubation börja förbereda 6 täckglas (CS) för odling NT explantat (steg från 1,5 till 1,8).
5. Skölj 6 CS i 70% etanol (utspädd i sterilt, ultrarent vatten) och låt dem torka. Med hjälp av ett labb markör, rita en cirkel i mitten av varje CS som är ca 1 cm i diameter (denna cirkel kommer senare att hjälpa dig att identifiera var en fibronektin päls har tillämpats). På samma sida av varje CS skriver ordet "vara" (eller någon annan asymmetrisk ord eller form) utanför dras cirkeln (detta kommer att hjälpa you identifiera om den markerade sidan av CS uppåt eller nedåt).
6. Placera varje CS i en separat 40 x 10 mm steril skål med den markerade ytan nedåt och låt skålen sitta öppet under en bakteriedödande UV-lampa i 10 min.
7. Applicera 60 | il fibronektin (FN, 10 pg / ml DMEM) till den omärkta ytan av CS samtidigt se hela området inom 1 cm cirkeln är belagd. Placera skålarna inkubera vid 37 ° C under 30 minuter och sedan försiktigt aspirera fibronektin från varje CS.
8. Tillsätt 250 pl "kultur"-medium [DMEM med L-glutamin (2 mM), penicillin (100 U), streptomycin (100 mcg / ml), och 8% fetalt bovint serum (FBS)] till FN-belagda området CS. Placera skålarna innehållande varje CS vid 37 ° C och 5% CO ₂ igen förrän NTS har isolerats.
9. Överföra alla de inkuberade embryot trunkar till en 5 cm glas petriskål innehållande L15 medium och börja dissekera ut varje NT med fina tänger och en volfram nål (fig. 1). Carefully snitt längs gränsen till NT och somiter med en vass volfram nål samtidigt vara försiktig att inte skada NT. Det är ofta lättare att börja isolera varje NT från kaudala längst änden av stammen.
10. Välj 6 av de rakaste och längsta NT till kultur natten (NTS mellan ungefär 8 och 15 somiter lång rekommenderas). Med hjälp av en mikropipett spets primas med odlingsmedium, överföra alla de 6 NT till sin egen tidigare framställd CS (från steg 1,5 genom 1,8). Se till att NT inte förblir flytande på ytan. Om NT är flytande, droppar medium på den tills den sjunker med en mikropipett.
11. Placera varje skål vid 37 ° C och 5% CO ₂ natten. Var noga med att se till att varje NT är inom FN-belagda inom sitt respektive CS omedelbart före placera skålen i inkubatorn (med hjälp av cirkeln dras i steg 1,5 som referens). En mikropipett kan användas för att bättre justera läget för varje NT om det behövs.
12. Placera påminst 2 ml odlingsmedium (utan serum) i en steril 15 ml centrifugrör och inkubera över natten vid 37 ° C och 5% COj _2. Låt locket skruvas något för att tillåta mediets pH att justera natten. Pre-inkubering av mediet är viktigt för att förhindra bubbelbildning i kammare, vilket kan störa inrättandet av en molekylär lutning. Sådan "förinkuberade" medium bör användas i alla framtida steg. När den inte används, bör detta medium vara inkubering vid 37 ° C.

2. Dag 2: Ladda modifierade Zigmond kammaren och Time-lapse analys av cellmigration

1. Av de 6 NT odlade väljer 3 kulturerna bäst lämpade för analys. I allmänhet bör NCC kulturer som har åtminstone en lång, rak kant väljas (fig. 2A). De 3 bästa kulturerna ska användas för att ladda och film 3 modifierade Zigmond kammare hela dagen, var och en med en annan behandling. Av de 3 kulturer, välj en för loading den första kammaren och återlämna de andra till inkubatorn för senare användning.
2. Med hjälp av en bomullspinne, applicera ett tunt, jämnt lager av vaselin kring behållarna och Bridge of en modifierad Zigmond kammare.
3. Med en volfram nål försiktigt bort NT från CS, medan de omgivande NCC knutna till ytan av CS. Markera skålen med en penna för att minnas orientering den rakaste kanten av NCC kulturen.
4. Placera några droppar förinkuberade medium på bron. Plocka upp CS med fin pincett, sandskädda kanten av CS mot Kimwipe att ta bort det mesta av den gamla odlingsmedium, sedan omedelbart placera CS på den modifierade Zigmond kammaren så att den raka kanten av kulturen som ska filmas är centrerad över längden av bron och ungefär vinkelrät mot bryggan-reservoaren gränsen (figur 2A, B).
5. Användning av ett inverterat mikroskop, flytta den raka NCC gränsen att vara på den sida av bryggan närmast till the reservoar som innehåller den misstänkta chemotactant (Fig. 2B, för kontroll kommer detta att motsvara beroende behållare laddas sekund). Dessutom, mer fint anpassa den raka kanten av kulturen att vara vinkelrät mot bryggan-reservoaren gränsen.
6. Försiktigt, men säkert trycka CS i vaselin närvarande på Zigmond kammaren, se till att det är helt tätad på kammaren, sedan placera ytterligare vaselin längs kanten av CS för att ytterligare säkerställa att det kommer att vara lufttät. Finjustera vinkeln på NCC gränsen igen för att korrigera för varje rörelse under tätning processen.
7. Ladda reservoaren som inte kommer att innehålla den misstänkta chemotactant första (fig. 2B). Göra det genom att läsa in en 1 ml spruta (25 G x 1,5 tum nål) med ungefär 300 ul förinkuberade medium och injicera mediet i behållaren tills full (medan du är försiktig att inte generera några bubblor i behållaren). Anslut behållaren på båda sidor med en sufficient mängd vaselin före lastning nästa reservoaren.
8. Upprepa steg 2,7, men den här gången med förinkuberade medium innehållande kandidat chemotactant. Det är viktigt vid generering en molekylär gradient över kulturen att alltid ladda reservoaren innehållande den molekyl som skall testas efter laddning behållaren saknar testade molekylen.
9. Placera den laddade Zigmond kammare vid 37 ° C för att inkubera under 1 h före filmning. Bild den rakaste gräns NCC kulturen under 3 h vid 90 s intervaller under inkubering vid ungefär 37 ° C (fig. 2A, B). Innan att skapa någon film, se till att rikta in kameran så att kanten på bilderna som skall erhållas är i linje med och vidrör kanten av bron som gränsar till sista reservoaren laddade (Fig. 2B, övre panelen, streckad ruta representerar ideal ställning för avbildning). Detta kommer att underlätta senare programvara analys genom att standardisera riktningen på den applicerade molekylära lutning och the avstånd från behållaren filmades i varje film som produceras.
10. För kontroller, upprepa steg 2,2-2,9 för de två andra NCC kulturer utvalda (i steg 2,1), men fyll varje behållare med ett lämpligt medium. För en typ av kontroll fylla båda reservoarerna med förinkuberade medium inte innehållande den molekyl som skall testas. För en andra kontroll behandling, Prime bron med några droppar förinkuberade medium som innehåller den misstänkta chemotactant före montering CS. Sedan laddar båda behållarna med samma medium innehållande det misstänkta chemotactant.
11. Använd ImageJ (NIH) Manuell spårning (rsb.info.nih.gov / ij / plugins / spår / track.html) och kemotaxi och Migration Tool v1.01 (www.ibidi.de / applications / ap_chemo.html) plugins för att spåra migration av perifera NCC längs den raka kanten av kulturen just avbildas och att analysera olika parametrar för de erhållna flyttande banor (fig. 2B-C).

3. Representativa resultat:

Ett prov av cell banor från en film där många trunk NCC var mottaglig för en kandidat kemoattraherande användning av ovan teknik visas (fig 2D). De flesta cellerna i detta exempel på ett positivt svar visas en nettorörelse upp kemoattraherande gradienten (såsom visas i rött). Bandata kan användas för att analysera andra egenskaper av cell migration.

För att visuellt bedöma en tillämpad gradient i en modifierad Zigmond kammare, en Alexa Fluor 488 IgM-konjugat (MW ~ 900 kDa) laddades in den andra behållaren av en modifierad Zigmond kammare (på ungefär 40 ng / ml _H2O). En gradient grundades av 1 timme och fortfarande något kvar efter 26 timmar, men i hög grad minskat med 50 timmar (Fig. 3). Om den molekyl som skall testas är mindre, då den tillämpade gradienten will försämra snabbare än vad som visas.

Figur 1. Explantation av bålen nivå NT för natten odling på fibronektinbelagda täckglas. Eftersom stammen NCC delamineras från den dorsala NT ligger intill somiter 8-28, är detta segment av NT isoleras genom mikrodissektion och odlades över natten på en fibronektinbelagda CS för att möjliggöra utvandring av NCC från NT explantatet. Isolerade NT som är mellan 8-15 somiter lång och relativt rak passar bäst för natten odling eftersom de tenderar att ge NCC kulturer med längre raka gränser. Regioner av neuralrörsdefekter som ger upphov till andra neurala nivåer crest axiella visas i en mindre teckensnitt. s, somit.

Figur 2. Metod för utvärdering av migreringen av explanterade trunk NCCmed hjälp av en modifierad Zigmond kammare. (A) Avlånga stam NCC kulturer framställs genom natten odling av NT och resulterande NCC kulturer med minst en lång, rak gräns väljs för experiment. Den längsta raka kanten av en utvald kultur placeras därefter vinkelrätt mot bryggan-reservoaren gränsen, och därför parallellt med vektorn av den applicerade framtida gradienten. (B) Efter fin justering av NCC kultur på Zigmond kammaren och tätning täckglaset till kammaren, är kammaren laddad. Vid testning kemotaxi, reservoaren som inte kommer att innehålla den misstänkta chemotactant (-) läses in först och förseglad. Därefter är den andra reservoaren laddad med den misstänkta chemotactant (+) och förseglad. Perifera NCC längs den tidigare valda gränsen kan sedan avbildas och spåras med hjälp av manuell spårning plugin för ImageJ (nedre panelen). (C) Många vandrande egenskaper som svarden som tillämpas gradienten kan bedömas utifrån spårningsdata. Till exempel, kan en kemotaxi-index härledas genom att dividera en cells förskjutning längs x-axeln med den totala sträcka den har migrerat. (D) Ett exempel på ett attraktivt svar visas genom en cell bollflykt tomt initialt genereras av Kemotaxi och migration Verktyg plugin för ImageJ. Utgångspunkten för varje bana är satt till origo (0,0). Notera hur många fler celler vandrar mot kemoattraherande source.The masscentrum av alla celler i sin slutliga position (blå korset, alla celler lika viktade) är också närmare den kemoattraherande källan. NCC, neurala crest celler, röda spår, celler som migrerade mot behållaren laddad med en misstänkt kemoattraktant, svarta spår, celler som migrerade bort, (+), högre chemotactant koncentration, (-), lägre chemotactant koncentration.

intensitetsprofiler över bron av en modifierad Zigmond kammare vid olika tidpunkter efter tillägg av en Alexa Fluor 488 IgM-konjugat. Kammaren fylldes på liknande sätt som beskrivits i protokollet med de viktigaste undantagen som förinkuberad vatten (i stället för förinkuberade medium) användes för att späda antikroppen till 40 | ig / ml, och små luftfickor var närvarande vid ändarna av bryggan (bort från skivan där de ovan intensitetsprofiler där tas). Inledningsvis var ingen lutning närvarande över större delen av bron. Genom 1 ha lutning bildades och förblev närvarande fram till 26 timmar. Genom 50 timmar närvaron av gradienten var inkonsekvent i olika delar av bron, och när närvarande, var lutning av gradienten kraftigt minskat. Alla profiler genererades från en identisk skiva över bron (från en brygga reservoar gränsen till den andra) med AxioVision 4,6 programvaran. Observera att även när luftfickor var närvarande, var gradienten inte störs. Hög, hög intensitet, låg, låg intensitet, x-axel, avståndet tvärs hela bredden av bro (2 mm), (+), reservoar laddad med Alexa Fluor 488 IgM-konjugat, (-), behållare laddad inte med konjugatet.

Figur 4. Modifierade Zigmond kammare specifikationer. Visas ett diagram över den modifierade Zigmond kammaren används här tillsammans med sina dimensionella specifikationer (± 0,2 mm). Mätningar kan måttligt justeras för att matcha individuella preferenser.

Kompletterande protokoll: Tillverkning av en modifierad Zigmond avdelning

Se Figur 4 som referens för protokollet nedan:

1. Köp ett ark med 3/16 "tjock polerad akryl (4,45 mm Verklig tjocklek).
2. Med hjälp av en tabell och såga kammare ämnen överdimensionerade förgrova dimensionerna 33,25 mm x 64,57 mm. Detta tillåter 3,175 mm extra material för maskinbearbetning.
3. Ställ kammaren ämnet på ett skruvstäd. Med en fräsmaskin och en 6,35 mm (1/4 ") pinnfräs bit, färdigbearbetning sidorna av kammaren till deras exakta mått: 30,07 mm x 61,39 mm.
4. Placera kammaren tom på fräsmaskin och lokalisera mitten av ämnet längs både x-och y-axlarna med en kantavkännare, sedan nollställa centrum.
5. Förvärva kammarens höjd (z-axeln) genom att trycka på bit ändfräsen med den övre ytan och nollställa höjden.
6. Med hjälp av en 3,91 mm (0,154 ") pinnfräs lite, kompensera bit 3,03 mm längs x-axeln (positiv riktning) för den första behållaren. Börja bearbetningen i kammaren till ett djup av 2,84 mm, medan rör sig längs y-axeln (positiv riktning) till 7,62 mm (0,300 ") och sedan passera till 7,62 mm (0,300") i motsatt (negativ) riktning till en komplett behållare längd av 15,24 mm (0,600 "). Offsetbiten till 3,03 mm (0,119 ") längs x-axeln (negativ riktning) och upprepa samma process för den andra behållaren.
7. Placera kammaren på sin kant och borra ett hål med en 1,09 mm (0,043 tum) borr på änden av varje behållare (4 totalt) som förbinder änden av behållaren till den sida av kammaren för lastning medium under experiment.
8. Blötlägg kammaren väl i varmt tvålvatten för att ta bort eventuella kemiska föroreningar.
9. Blötlägg och skölj kammaren väl i dubbeldestillerat vatten för att ta bort tvål. Kamrarna är nu redo för användning såsom beskrivits ovan.

Discussion

Genomföra kemotaxi forskning på bål NCC har visat utmanande för en rad skäl. Trunk NCC utgör en heterogen befolkning stamceller som kommer att skilja om odlade lång sikt, därför måste trunk NCC erhållas från primär explantation av stammen nivå NT. Konventionella metoder för att studera den kemotaktiska responsen av homogent fördelade cellpopulationer in vitro är svåra att testa på bålen NCC sedan de först kräver att cellerna är isolerade och homogent återpläterade i kemotaxi kammare (t.ex. en Boyden-kammare ^12). Isolera tillräckligt NCC kan vara långtråkig som explantation av dussintals NT kan krävas för att skapa en homogen fördelning av bålen NCC tillräckliga för ännu ett experiment. Dessutom är NCC aldrig lyfts, blandas och homogent omfördelas i sin naturliga sammanhang. Därför kan NCC som återpläterades för att utföra vissa konventionella kemotaxi analyser beterhelt annorlunda än in vivo förhållanden i fråga om att flyttningsbeteendet.

Här beskriver vi en modifierad teknik för att utvärdera stam NCC kemotaxi i ett mer naturligt sammanhang. En stor utmaning vid utvärdering av kemotaktiska svaret av bålen NCC utan en homogen fördelning är den starka inneboende polaritet NCC i det ursprungliga explantatet kulturen utöver sitt medfödda heterogen identitet. Till exempel trunk NCC tenderar att migrera till stor del vinkelrät (bort) från NT när kultur ^13. De olika faktorer som påverkar stammen NCC polaritet i explantatet kultur kan vara så stark att det är svårt att slutgiltigt identifiera förändringar i cellens polaritet som induceras av en chemotactant gradient. Med vår nya modifierade Zigmond analys är det möjligt att skilja mellan naturliga cellpolaritet inneboende explantera kulturer och förändringar som en chemotactant gradient samtidigt övervakar andra flyttfåglar parameter gor som uthållighet och snabbhet. Vi har observerat att vinkeln var gränsen för en explanterade trunk NCC kulturen står till stor del bestämmer den inneboende riktverkan de ledande stammen NCC vid den gränsen. Till exempel, om en gräns på en NCC kultur vetter mot norr, så den genomsnittliga riktningen på NCC från den gränsen skulle vara nordlig. Vår modifierad analys minimerar variationen orsakas av inneboende riktningen på ledande NCC genom att standardisera vinkeln på NCC gränsen från vilken de vandrar i förhållande till den som tillämpas chemotactant gradient (Fig. 2A). Genom att välja ledande NCC på en relativt rak gräns av stammen NCC kulturen, alltid positionering att raka NCC gränsen vinkelrätt mot tillämpat gradienten, och då endast spåra migration av ledande celler på den gränsen, är en möjlighet att upptäcka förändringar i den genomsnittliga inriktningen av bålen NCC mot eller bort från en chemotactant källa som annars skulle gå oupptäckta.

ENT "> Nedan följer en sammanfattning av de många fördelarna med ovanstående protokoll:

1. Det ger möjlighet att spåra levande cell migration.
2. Den modifierade Zigmond kammaren kan ge en relativt definierad lutning som kan visualiseras med en fluorescerande molekyl (fig 3).
3. Zigmond kammare undviker vissa begränsningar i standarden Boyden-analysen tidigare beskrivits av andra ^10,14.
4. Vår modifierade Zigmond kammare kan hemgjorda till en mycket låg kostnad (material uppskattas till mindre än 1 USD per återanvändbar kammare).
5. Eftersom neurala rören odlas på täckglas och senare förseglas med vaselin, kan man välja lätt orienteringen av kulturen i förhållande till den framtida tillämpad gradienten.
6. Trypsinisering eller cell skrapning krävs inte.
7. Endast en liten mängd av NT isoleringar är nödvändiga.
8. NCC kulturen är mer lik fördelningen av bålen NCC finns in vivo än när cellerlyfts och återutströks med en homogen fördelning.

Dessa fördelar skulle också sannolikt gälla analoga primära explantation kulturer av andra celltyper, och därför kan detta tillvägagångssätt ha en bredare önskvärdheten för användning vid utvärdering av den naturliga flyttningsbeteendet av andra Explanterade stamceller.

Även om fördelarna med den modifierade Zigmond kammarens analys är många, har det vissa begränsningar. Några nackdelar i standarden Zigmond kammaren har redan diskuterats av tidigare forskare ^14. En begränsning hos vår modifierade Zigmond analys är användningen av vaselin för montering av CS och ansluta varje reservoar hål. Vaselin gör en möjlighet att exakt orientera en NCC kultur i förhållande till den chemotactant gradient men leder till variation i avståndet mellan CS och bron som kan orsaka variationer i den applicerade gradienten ^14. Dessutom, monteraCS och täta kammaren med vaselin fällor ofta små fickor av luft i kammaren som kan komprimerar leder till små mängder flöde över bron ^14. Sådant flöde skulle kunna störa den molekylära gradienten under vissa experiment och leda till ökad variabilitet i sina resultat. Även om detta är möjligt, var en svår lutning störningar inte observeras när visualiseras med hjälp av en Alexa Fluor 488 IgM-konjugat (Fig. 3), även när luftfickor var närvarande mot ändarna av bron (bort från området där fluorescensintensiteten mättes) . Även under förhållanden som kunde ha potentiellt störda Alexa Fluor 488 IgM lutning var gradienten inte äventyras i området bron mäts (närmare till mitten av bron). Om en kräver en långsiktig lutning som är både mycket stabil och förutsägbar, så denna analys kommer sannolikt inte att räcka. Emellertid är sådan precision ofta inte behövs och i jämförelse med vissa andravanliga kemotaxi analyser (t.ex. Boyden analyser eller vissa analyser med chemotactant-dränkts pärlor) är gradienten sannolikt mer stabil och förutsägbar.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Omega Scientific	DM-22
Penicillin Streptomycin Solution	Omega Scientific	PS-20	100X Stock Concentration
L-Glutamine	Omega Scientific	GS-60	100X Stock Concentration
Fetal Bovine Serum	Omega Scientific	FB-11	Lot# 105247 (or another that is comparable)
Modified Zigmond chamber	Home made	N/A	Reservoir volume: ~ 160 μl ea; for additional specifications, see Fig. 4 and the supplemental fabrication protocol
Cell culture dish	Denville	T6040	40 x 10 mm
Fibronectin	BD	354008	10X Stock prepped by diluting 1 mg FN in 1 ml H2O and 9 ml DMEM
Coverslips	Fisher	12-548-B	Precleaned; 22 x 22 mm
L15 medium	Thermo Scientific	SH30525.02
Petroleum Jelly	Comforts	011110794642	100%
Centrifuge tube	Biologix	10-9152	15 ml
Dispase	Cell Systems	4Z0-850	10X Stock Concentration
Syringe	BD	309602	1 ml
Needle	BD	305127	25 G x 1.5 in.
Alexa Fluor 488-IgM	Invitrogen	A21042	Stock is 2 mg/ml; 7 moles dye/mole IgM
Dissecting Forceps	FST	Misc.	Dumont #5 or 55; straight tipped; stainless steel or titanium
Tungsten Needle	N/A	N/A	Home made; placed in a pin holder
Blunt Forceps	Tiemann	160-18	Used for transferring embryos to Ringer's from egg yolk
Supplemental Protocol: Fabrication of a Modified Zigmond Chamber
Please refer to Figure 4 as a reference for the protocol below:
Purchase a sheet of 3/16" thick polished acrylic (4.45 mm actual thickness). Using a table saw, cut chamber blanks oversized to the rough dimensions of 33.25 mm x 64.57 mm. This allows 3.175 mm extra material for machining. Set the chamber blank on a vise. With a milling machine and a 6.35 mm (1/4") end mill bit, finish machining the sides of the chamber to their exact dimensions: 30.07 mm x 61.39 mm. Position the chamber blank on the milling machine and locate the center of the blank along both the x and y axes with an edge finder; then zero the center location. Acquire the chamber height (z-axis) by touching the end mill bit to the top surface and zero the height. Using a 3.91 mm (0.154") end mill bit, offset the bit 3.03 mm along the x-axis (positive direction) for the first reservoir. Begin machining into the chamber to a depth of 2.84 mm while moving along the y-axis (positive direction) to 7.62 mm (0.300") and then traverse to 7.62 mm (0.300") in the opposite (negative) direction to a complete reservoir length of 15.24 mm (0.600"). Offset the bit to 3.03 mm (0.119") along the x-axis (negative direction) and repeat the same process for the second reservoir. Position the chamber on its edge and drill a hole using a 1.09 mm (0.043 in.) drill bit on the end of each reservoir (4 total) that connects the end of the reservoir to the side of the chamber for loading medium during experimentation. Soak the chamber well in warm soapy water to help remove any chemical contaminants. Soak and rinse the chamber well in double-distilled water to remove any soap. The chambers are now ready to use as described above.