Análise de Tronco de Migração da crista neural celular usando uma modificação Zigmond Ensaio Câmara

Summary

Uma abordagem para analisar a migração de células explantadas (células tronco da crista neural) é descrita. Este método é barato, suave, e é capaz de distinguir a quimiotaxia tanto de quimiocinese e outras influências sobre a polaridade migratórias tais como aqueles derivados de interacções célula-célula dentro da cultura de células primária tronco da crista neural.

Abstract

Células da crista neural (CBCs) são uma população transitória de células presentes no desenvolvimento de vertebrados que emigram do tubo neural dorsal (NT) depois de passar por um ^1,2 transição epitelial-mesenquimal. Após EMT, NCCs migrar grandes distâncias ao longo de caminhos estereotipados até que eles atinjam seus alvos. NCCs diferenciar em uma vasta gama de tipos de células incluindo neurónios, glia, melanócitos e células cromafins ^1-3. A capacidade do NCC para chegar e reconhecer os seus locais de destino adequados é fundamental para a formação adequada de todas as estruturas que contêm NCC-tronco derivadas de componentes ^3. Elucidar os mecanismos de orientação para o tronco NCC migração tem sido, portanto, uma questão de grande importância. Numerosas moléculas têm sido demonstrados para orientar a migração NCC ^4. Por exemplo, os CBCs tronco são conhecidos por ser repelida por pistas de orientação negativas, tais como Semaforina, Efrina, e ligandos de fenda ^5-8. No entanto, nãoaté recentemente tem quimioatractivos de NCCs tronco foram identificados ^9.

Convencional em abordagens in vitro para estudar o comportamento quimiotática de células aderentes trabalhar melhor com imortalizados, homogénea células distribuídas, mas são mais difíceis de aplicar a certas culturas primárias de células-tronco que, inicialmente, não possuem uma distribuição homogênea e rapidamente diferenciar (como NCC). Uma abordagem para homogeneizar a distribuição dos CBCs tronco para quimiotaxia estudos é isolar NCCs tronco a partir de culturas de explantes primários NT, em seguida, levantar e replate-los a ser quase 100% confluentes. No entanto, esta abordagem de revestimento requer quantidades substanciais de tempo e esforço para explantar células suficientes, é duro, e distribui NCCs tronco de um modo diferente daquele que foi encontrado em condições in vivo.

Aqui, apresentamos uma abordagem in vitro que é capaz de avaliar quimiotaxia e outras respostas migratórios de tronco sem NCC requiringa distribuição celular homogênea. Esta técnica utiliza lapso de tempo de imagem de principal, imperturbável NCCs tronco dentro de uma câmara de Zigmond modificado (uma câmara Zigmond padrão é descrito em outra parte ^10). Ao expor NCCs tronco na periferia da cultura a um gradiente chemotactant que é perpendicular à sua direccionalidade previu natural, alterações na polaridade migratório induzidas pelo gradiente chemotactant aplicada pode ser detectado. Esta técnica é pouco dispendioso, requer a cultura de apenas dois explantes por tratamento NT replicate, evita levantamento célula dura (tal como tripsinização), deixa NCCs tronco de uma distribuição mais semelhante a condições in vivo, reduz a quantidade de tempo entre o explante e experimentação (o que provavelmente reduz o risco de diferenciação), e permite a avaliação de lapso de tempo de numerosas características migratórias.

Protocol

1. Dia 1: O isolamento de tubos de tronco neurais para a cultura durante a noite em lamelas

1. Incubar os ovos de pintainho para 56 h a 38 ° C. Retirar os ovos de incubação, levemente pulverizá-los com etanol a 70%, e, em seguida, permitir que sequem. Quebre os ovos abertos em uma bandeja de vidro UV-esterilizado.
2. Extraia cada embrião a partir da sua gema e colocá-lo no pinto de Ringer. Faça isso primeiro corte em torno de suas ilhas de sangue com tesoura curva, em seguida, com uma pinça sem corte, escolher o embrião por sua membrana extraembryonic e colocá-lo em uma placa de Petri estéril plástico contendo solução de Ringer garota.
3. Isolar o tronco de cada embrião por aparando o excesso de membranas extra-embrionário, bem como cranianos, vagal, e sacral níveis axiais, utilizando uma agulha de tungsténio (Fig. 1). Primeiro, selecione cerca de 9 embriões que estão entre os estágios HH15-17 ^11. Para fases HH15 e para cima, os eixos do prosencéfalo e rombencéfalo formar um ângulo agudo e, por conseguinte, a cabeça parece inclinar caudalmente. Emestágio HH17, o broto da cauda está presente e inclina ventralmente mas ainda não conter somitos. Com uma agulha de tungstênio, corte Membranas Extra-Embrionárias para cerca de 2 mm a partir do embrião e cortar todos os tecidos embrionários anteriores a somito 10. Também remover todos os tecidos embrionários a partir de caudais em torno do quinto somito mais recentemente formado.
4. Colocar os troncos isolados embrionárias em Dispase (0,24 U / ml de DMEM) e incubar durante 1 h 15 min a 37 ° C e 5% CO _2. Uma vez que os troncos de começar a incubação, começar a preparar 6 lamelas (CS) para explantes NT (passos 1,5-1,8).
5. Enxaguar 6 CS em etanol a 70% (diluído em água, estéril ultrapura), e, em seguida, permitir que sequem. Usando um marcador de laboratório, desenhar um círculo no centro de cada CS que é de cerca de 1 cm de diâmetro (este círculo, mais tarde, ajudá-lo a identificar onde um casaco de fibronectina foi aplicada). Na mesma face de cada CS, escrever a palavra "ser" (ou alguma outra palavra assimétrico ou forma) fora do círculo desenhado (isso vai ajudá-yOU identificar se o lado marcado do CS está voltada para cima ou para baixo).
6. Colocar cada CS em um 40 x 10 mm separado prato esterilizado com a superfície marcada voltada para baixo e permitir que o prato de sentar aberto por baixo de uma lâmpada de UV germicida, durante 10 min.
7. Aplicar 60 ul a fibronectina (FN, 10 ug / ml de DMEM) para a superfície não marcada do CS assegurando ao mesmo tempo toda a área dentro do círculo de 1 cm é revestido. Colocar as placas a incubar a 37 ° C durante 30 min e, em seguida, cuidadosamente aspirado a partir de cada fibronectina CS.
8. Adicionar 250 ul de "cultura" medium [DMEM com L-glutamina (2 mM), penicilina (100U/ml), estreptomicina (100 mcg / ml), e 8% de soro fetal bovino (FBS)] à área de FN revestido o CS. Colocar as cápsulas contendo cada CS a 37 ° C e 5% CO _2, até que os NTs têm sido isolados.
9. Transferir todos os troncos de embriões incubados a um centímetro de vidro de 5 placa de Petri contendo meio L15 e começar dissecando cada NT utilizando uma pinça fina e uma agulha de tungsténio (Fig. 1). Carefully cortar ao longo da fronteira do NT e somitos com uma agulha de tungstênio afiada ao ser cauteloso para não danificar o NT. Muitas vezes, é mais fácil começar isolando cada NT a partir do final caudal-a maior parte do tronco.
10. Selecione 6 dos NTs retas longas e para a cultura durante a noite (NTs entre cerca de 8 e 15 somitos prazo é recomendado). Utilizando uma ponta de micropipeta preparado com meio de cultura, transferir cada um dos 6 NTs ao seu próprio CS previamente preparado (a partir de 1,5 por meio de etapas de 1,8). Certifique-se de que o NT não permanece flutuando na superfície. Se o NT é flutuante, gotejamento meio para ele até que ele afunda usando uma micropipeta.
11. Colocar cada prato a 37 ° C e 5% CO ₂ durante a noite. Ter cuidado para assegurar que cada NT está dentro da área de FN revestido da sua respectiva CS imediatamente antes de se colocar o prato na incubadora (usando o círculo desenhado no passo 1.5 como uma referência). A micropipeta pode ser usado para ajustar melhor a posição de cada NT, se necessário.
12. Lugar nopelo menos 2 ml de meio de cultura (sem soro) para um tubo de centrífuga estéril de 15 ml e incubar durante a noite a 37 ° C e 5% CO _2. Deixe a tampa ligeiramente desenroscada para permitir que o pH do meio de ajustar a noite. Pré-incubar o meio é importante para ajudar a prevenir a formação de bolhas na sua câmara, o que pode perturbar o estabelecimento de um gradiente molecular. Tal meio de "pré-incubadas" deve ser utilizado em todas as etapas futuras. Quando não está a ser utilizada, esta deve ser meio de incubação a 37 ° C.

2. Dia 2: Carregamento da câmara modificado Zigmond e lapso de tempo de análise da migração celular

1. Dos 6 NTs cultivadas, selecione as três culturas mais adequadas para análise. Em geral, as culturas de NCC que têm pelo menos uma aresta longa, linear deve ser seleccionado (Fig. 2A). Os 3 melhores culturas irão ser usados ​​para carregar e filme 3 câmaras modificados Zigmond ao longo do dia, cada uma com um tratamento diferente. Fora das três culturas, escolher um para loading câmara o primeiro e retornar os outros para a incubadora para uso posterior.
2. Usando um cotonete, aplique uma camada fina e uniforme de vaselina ao redor dos reservatórios e pontes de uma modificação Zigmond câmara.
3. Com uma agulha de tungsténio, retire o NT do CS, enquanto deixa os CBCs circundantes que aderem à superfície do CS. Marcar o recipiente com uma caneta para lembrar a orientação da reta borda da cultura NCC.
4. Coloque algumas gotas de meio de pré-incubado na ponte. Pegar o CS com uma pinça fina, dab a borda do CS contra um Kimwipe para remover a maior parte do meio de cultura anterior, então colocar imediatamente o CS na câmara Zigmond modificado de modo que a vara de a cultura a ser filmado está centrada sobre o comprimento da ponte e aproximadamente perpendicular à borda ponte reservatório (Fig. 2A, B).
5. Utilizando um microscópio invertido, mova a borda NCC directamente para estar no lado da ponte mais próxima threservatório e que irá conter o chemotactant suspeita (Fig. 2B; para controles isto irá corresponder a qualquer reservatório é carregado segundo). Além disso, mais finamente alinhar a vara da cultura a ser perpendicular à borda ponte reservatório.
6. Cuidadosamente, mas firmemente apertar o CS em vaselina líquida presente na câmara Zigmond, certificando-se que seja completamente selada para a câmara e, em seguida colocar vaselina adicional ao longo da extremidade do CS para assegurar, além disso, será estanque ao ar. Fino-ajustar o ângulo da borda NCC novamente para corrigir qualquer movimento durante o processo de selagem.
7. Carregar o reservatório que não irá conter o suspeito chemotactant primeira (Fig. 2B). Fazê-lo através do carregamento de uma seringa de 1 ml (25 G x 1,5 pol agulha), com cerca de 300 ul de meio pré-incubado e injectar o meio para dentro do reservatório até completa (tendo cuidado para não gerar quaisquer bolhas no reservatório). Ligue o reservatório em ambos os lados com um sufficient quantidade de vaselina antes de carregar o próximo reservatório.
8. Repita o passo 2.7, só que desta vez com o meio-incubadas contendo o chemotactant candidato. É crítico ao gerar um gradiente molecular através da cultura para sempre carregar o reservatório que contém a molécula a ser testado após o carregamento do reservatório sem a molécula testada.
9. Coloque a câmara Zigmond carregada a 37 ° C a incubar durante 1 h antes da filmagem. Imagem a reta borda da cultura NCC durante 3 horas a 90 s intervalos de tempo de incubação a cerca de 37 ° C (Fig. 2A, B). Antes de criar qualquer filme, certifique-se de alinhar a câmera para que a borda das imagens a serem obtidos estão alinhados com e tocar a borda da ponte que faz fronteira com o último reservatório carregado (Fig. 2B, painel superior, caixa tracejada representa ideal posição para geração de imagens). Isto irá facilitar a análise de software mais tarde, padronizando a direção do gradiente molecular aplicada e thdistância a partir do reservatório e filmado em cada filme produzido.
10. Para os controlos, repetir as etapas de 2,2-2,9 para cada uma das duas outras culturas NCC seleccionados (no passo 2.1), mas cada encher o reservatório com um meio apropriado. Para um tipo de controlo preencha os dois reservatórios previamente incubado com meio não contendo a molécula a ser testada. Para um tratamento de controle de segunda, primeiro a ponte com algumas gotas de meio-incubadas contendo o chemotactant suspeita antes da montagem do CS. Em seguida, carrega ambos os reservatórios com o mesmo meio contendo o chemotactant suspeita.
11. Use ImageJ (NIH) Tracking Manual (rsb.info.nih.gov / ij / plugins / faixa / track.html) e Quimiotaxia e Migration Tool v1.01 (www.ibidi.de / aplicativos / ap_chemo.html) plugins para rastrear a migração dos CBCs periféricos ao longo da fronteira reta da cultura just fotografada e analisar vários parâmetros das trajectórias migratórias obtidos (Fig. 2B-C).

3. Resultados representativos:

Uma amostra de trajectórias de células a partir de um filme em que NCCs tronco muitos foram responsivo a um quimioatraente candidato utilizando a técnica acima é mostrado (Fig. 2D). A maioria das células no presente exemplo de uma resposta positiva exibido um movimento líquido se o gradiente chemoattractant (como mostrado a vermelho). Dados da trajectória pode ser utilizado para analisar outras propriedades de migração celular, bem.

A fim de avaliar visualmente um gradiente aplicado numa câmara Zigmond modificado, um Alexa Fluor 488 conjugado IgM (MW ~ 900 kDa) foi carregado para o segundo reservatório de uma câmara Zigmond modificado (a cerca de 40 ug / ml de H ₂ O). Um gradiente foi estabelecida por 1 h e ainda um pouco presente após 26 horas, mas fortemente diminuída em 50 h (Fig. 3). Se a molécula a ser testada é menor, em seguida, aplicada ao gradiente wivai degradar mais rapidamente do que o que é mostrado.

Figura 1. Explantes de tronco de nível de NTs para cultura durante a noite em fibronectina revestidos lamínulas. Porque delaminate tronco NCCs do NT dorsal localizado adjacente ao somitos 8-28, este segmento do NT é isolado por microdissecção e cultivadas durante a noite em um CS fibronectina revestido para permitir a emigração de NCCs do explante NT. NTs isoladas que estão entre 8-15 somitos longa e relativamente simples são os mais adequados para o cultivo durante a noite, já que tendem a produzir culturas NCC com mais fronteiras retas. Regiões do tubo neural, que dão origem a outros níveis axiais da crista neural são mostrados em uma fonte menor. s, somito.

Figura 2. Método para a avaliação da migração dos CBCs tronco explantadosutilizando uma versão modificada câmara Zigmond. (A) culturas tronco alongados NCC são preparadas por cultura durante a noite de NTs e culturas resultantes NCC com pelo menos uma fronteira longa e reta são selecionadas para experimentação. A maior fronteira reto de uma cultura seleccionada é então posicionado perpendicularmente à borda da ponte-reservatório, e, portanto, paralela ao vector do gradiente aplicado futuro. (B) Depois do ajuste preciso da posição do NCC cultura na câmara de vedação e Zigmond a lamela para a câmara, a câmara é carregada. Ao testar a quimiotaxia, o reservatório que não irá conter o chemotactant suspeita (-) é carregado em primeiro lugar e selado. Em seguida, o outro reservatório é carregado com o chemotactant suspeita (+) e selada. NCCs periféricos ao longo da fronteira previamente selecionados podem ser analisados ​​e monitorados usando o plugin manual de Rastreamento para ImageJ (painel inferior). (C) Numerosas características migratórias em respostapara o gradiente aplicado pode ser avaliado com base nos dados de controle. Por exemplo, um índice de quimiotaxia pode ser calculado dividindo o deslocamento de uma célula ao longo do eixo x pela distância total que migrou. (D) Um exemplo de uma resposta atraente é mostrada por um gráfico de trajectória de células inicialmente gerado pela quimiotaxia e migração plugin de ferramenta para ImageJ. O ponto de partida de cada percurso está definido para a origem (0,0). Observe quantos mais células migram para o centro de massa source.The quimioatraente de todas as células na sua posição final (cruz azul, todas as células igualmente ponderados) é também mais perto da fonte quimioatraente. NCCs, células da crista neural, faixas vermelhas, as células que migraram para o reservatório carregado com uma suspeita chemoattractant; faixas pretas, as células que migraram para longe; (+), a concentração mais elevada; chemotactant (-), a concentração mais baixa chemotactant.

perfis g> Figura 3. Intensidade através da ponte de uma câmara Zigmond modificada em diferentes tempos após a adição de um conjugado de Alexa Fluor 488. IgM A câmara foi carregado de um modo semelhante ao descrito no protocolo, com as excepções de que a água previamente incubado principais (em vez de meio de pré-incubado) foi utilizado para diluir o anticorpo a 40 mg / ml, e as bolsas de ar pequenas estavam presentes nas extremidades da ponte (longe do segmento onde os perfis de intensidade acima foram tiradas). Inicialmente, nenhum gradiente estava presente na maior parte da ponte. Por um gradiente ha foi estabelecida e continuou presente até 26 h. Por 50 h, a presença do gradiente era inconsistente em diferentes áreas da ponte, e, quando presente, o grau de inclinação do gradiente foi grandemente diminuída. Todos os perfis foram gerados a partir de uma fatia idêntico através da ponte (a partir de uma fronteira ponte reservatório para o outro), utilizando o software AxioVision 4.6. Note que, mesmo enquanto o arbolsos estavam presentes, o gradiente não foi interrompida. , Intensidade elevada de altura; baixa, baixa intensidade; eixo x a distância, através de toda a largura da ponte (2 mm), (+), o reservatório carregado com a Alexa Fluor 488 conjugado IgM, (-), o reservatório não carregado com o conjugado.

Figura 4. Modificados especificações da câmara. Zigmond mostrado é um diagrama da câmara de Zigmond modificado usado aqui, juntamente com as suas especificações dimensionais (± 0,2 mm). As medições podem ser moderadamente ajustados de forma a coincidir com as preferências individuais.

Suplementar Protocolo: Fabricação de um Zigmond Modificado Câmara

Por favor consulte a figura 4, tal como uma referência para o protocolo abaixo:

1. Comprar uma folha de 3/16 "de acrílico grosso polido (4,45 mm de espessura real).
2. Usando uma serra de mesa, cortar espaços em branco da câmara de grandes dimensões para adimensões aproximadas de 33,25 milímetros x 64,57 milímetros. Isso permite que 3,175 mm material extra para usinagem.
3. Defina a câmara em branco em um torno. Com uma máquina de moagem e um de 6,35 mm (1/4 ") bit fresa de topo, o acabamento dos lados da câmara, para as suas dimensões exactas: 30,07 milímetros x 61,39.
4. Posicione a câmara em branco na máquina de fresagem e localizar o centro do branco ao longo de ambos os eixos X e Y com um localizador de extremidade, então zero a posição do centro.
5. Adquirir a altura da câmara (eixo z), tocando o bit de fresa de topo com a superfície de topo e de zero a altura.
6. Usando um milímetro 3,91 (0,154 ") bit fresa, compensar a 3,03 milímetros de bits ao longo do eixo x (sentido positivo) para o primeiro reservatório. Comece a maquinagem no interior da câmara, até uma profundidade de 2,84 mm, enquanto se move ao longo do eixo y (sentido positivo) a 7,62 mm (0,300 ") e, em seguida, percorrem a 7,62 mm (0,300") na direcção (negativa), em frente a um reservatório completo comprimento de 15,24 mm (0,600 "). Compensaro bit a 3,03 mm (0,119 ") ao longo do eixo x (sentido negativo) e repetir o processo para o segundo reservatório.
7. Posicionar a câmara na sua extremidade e um furo com um milímetro 1,09 (0,043 polegadas) da broca na extremidade de cada reservatório (4 total) que liga a extremidade do reservatório para o lado da câmara de carga média durante a experimentação.
8. Mergulhe a câmara bem em água morna e sabão para ajudar a remover quaisquer contaminantes químicos.
9. Embeber e enxaguar a câmara poço de água duplamente destilada para remover qualquer sabão. As câmaras estão agora prontos a usar, tal como descrito acima.

Discussion

Realização de pesquisas sobre a quimiotaxia NCCs tronco provou um desafio para uma série de razões. NCCs tronco constituem uma população heterogénea de células estaminais que se diferenciam de cultura de longo prazo, por isso, NCCs tronco deve ser obtido a partir de explante primário do tronco NT-nível. Os métodos convencionais para estudar a resposta quimiotáctica de forma homogénea as populações de células in vitro são distribuídos difícil de testar em NCCs tronco desde que eles exigem que as células são isoladas e homogeneamente novamente plaqueadas na câmara de quimiotaxia (por exemplo, uma câmara de Boyden ^12). Isolando NCCs suficientes pode ser tedioso como o explante de dezenas de NTs pode ser obrigado a criar uma distribuição homogênea do NCC tronco suficientes para um mesmo experimento. Além disso, NCC nunca são levantadas, mista e homogeneamente redistribuída em seu contexto natural. Portanto, NCCs que são novamente plaqueadas a fim de realizar certos ensaios de quimiotaxia convencionais podem comportarbastante diferente de condições in vivo em relação ao comportamento migratório.

Aqui, descrevemos uma técnica modificada para avaliar o tronco NCC quimiotaxia em um contexto mais natural. Um desafio importante na avaliação da resposta quimiotática dos CBCs tronco sem uma distribuição homogénea é a polaridade forte inerente NCCs no âmbito da cultura de explante original, para além da sua identidade inata heterogénea. Por exemplo, os CBCs tronco tendem a migrar em grande parte perpendicular (distância) do NT quando em cultura ^13. Os vários fatores que influenciam tronco polaridade NCC dentro da cultura explante pode ser tão poderosa que é difícil identificar conclusivamente mudanças na polaridade celular induzida por um gradiente chemotactant. Utilizando o nosso novo ensaio modificado Zigmond é possível fazer a distinção entre a polaridade de células natural inerente explantar culturas e as alterações induzidas por um gradiente chemotactant, ao mesmo tempo, monitorando parâmetros migratório outros tros como a persistência e velocidade. Temos observado que o ângulo de cada margem de um explantado cultura tronco NCC enfrenta determina em grande parte a direcionalidade inerente dos CBCs de ponta tronco nessa fronteira. Por exemplo, se uma borda de uma cultura NCC enfrenta o norte, em seguida, a direção média de NCCs de fronteira que seria norte. O nosso ensaio modificado minimiza a variabilidade provocada pela direccionalidade inerente de ponta NCCs padronizando o ângulo da borda NCC desde que eles migram em relação ao gradiente chemotactant aplicado (Fig. 2A). Ao selecionar ponta NCC em uma fronteira relativamente simples da cultura tronco NCC, sempre posicionando que perpendicularmente fronteira reta NCC ao gradiente aplicado, e depois apenas de monitoramento da migração de células de ponta sobre essa fronteira, se é capaz de detectar mudanças na direcionalidade média de NCCs tronco em direção ou para longe de uma fonte chemotactant que poderiam passar despercebidos.

> ent "Abaixo está um resumo dos inúmeros benefícios decorrentes do protocolo acima:

1. Ele oferece a capacidade de controlar a migração de células vivas.
2. A modificação Zigmond câmara pode produzir um gradiente relativamente definida, que pode ser visualizado com uma molécula fluorescente (Fig. 3).
3. Câmaras Zigmond evitar certas limitações do ensaio Boyden padrão descrito anteriormente por outros ^10,14.
4. Nossas câmaras modificados Zigmond pode ser feito em casa a um custo muito baixo (materiais são estimadas em menos de 1 USD por câmara reutilizável).
5. Porque os tubos neurais são cultivadas em lamelas e depois selada com geleia de petróleo, pode-se facilmente escolher a orientação da cultura em relação ao futuro gradiente aplicado.
6. Tripsinização ou raspagem da célula não é necessária.
7. Apenas uma pequena quantidade de isolamentos NT são necessárias.
8. A cultura NCC é mais semelhante à distribuição de NCCs tronco encontradas in vivo do que quando as célulassão levantados e novamente plaqueadas com uma distribuição homogénea.

Estas vantagens também se aplicam a probabilidade análogos culturas de explantes primários de outros tipos celulares e, portanto, esta abordagem pode ter uma maior conveniência para uso na avaliação do comportamento natural migratório das outras células estaminais explantados.

Embora as vantagens do ensaio modificado câmara Zigmond são muitos, tem algumas limitações. Algumas desvantagens da câmara Zigmond padrão já foram discutidas por pesquisadores nos últimos ^14. Uma limitação do nosso ensaio Zigmond modificada é a utilização de vaselina para a montagem do CS e ligando cada furo do reservatório. Vaselina permite uma flexibilidade de orientar com precisão uma cultura NCC relativa ao gradiente chemotactant, mas leva a variabilidade na distância entre o CS e a ponte que pode causar variabilidade no gradiente aplicado ^14. Além disso, a montagem doCS e vedar a câmara com vaselina muitas vezes armadilhas pequenas bolsas de ar no interior da câmara, que poderia comprimir levando a pequenas quantidades de fluxo através da ponte ^14. Esse fluxo poderia perturbar o gradiente molecular durante algumas experiências e levar ao aumento da variabilidade no resultado de cada um. Embora isto seja possível, a uma ruptura gradiente grave não foi observado quando visualizada utilizando um Alexa Fluor 488 conjugado IgM (Fig. 3), mesmo quando estavam presentes bolsas de ar na direcção das extremidades da ponte (fora da área de onde a intensidade de fluorescência foi medida) . Portanto, mesmo em condições que poderiam ter potencialmente perturbaram o Alexa Fluor 488 gradiente de IgM, o gradiente não foi comprometida na zona da ponte de medição (para mais perto do meio da ponte). Se se requer um gradiente de longo prazo, que é ao mesmo tempo altamente estável e previsível, em seguida, este ensaio não será provavelmente suficiente. No entanto, tal precisão muitas vezes não é necessário e, em comparação com alguns outrosOs ensaios de quimiotaxia comuns (tais como ensaios de Boyden ou ensaios determinados utilizando chemotactant embebidos grânulos), o gradiente é provável que seja mais estável e previsível.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Omega Scientific	DM-22
Penicillin Streptomycin Solution	Omega Scientific	PS-20	100X Stock Concentration
L-Glutamine	Omega Scientific	GS-60	100X Stock Concentration
Fetal Bovine Serum	Omega Scientific	FB-11	Lot# 105247 (or another that is comparable)
Modified Zigmond chamber	Home made	N/A	Reservoir volume: ~ 160 μl ea; for additional specifications, see Fig. 4 and the supplemental fabrication protocol
Cell culture dish	Denville	T6040	40 x 10 mm
Fibronectin	BD	354008	10X Stock prepped by diluting 1 mg FN in 1 ml H2O and 9 ml DMEM
Coverslips	Fisher	12-548-B	Precleaned; 22 x 22 mm
L15 medium	Thermo Scientific	SH30525.02
Petroleum Jelly	Comforts	011110794642	100%
Centrifuge tube	Biologix	10-9152	15 ml
Dispase	Cell Systems	4Z0-850	10X Stock Concentration
Syringe	BD	309602	1 ml
Needle	BD	305127	25 G x 1.5 in.
Alexa Fluor 488-IgM	Invitrogen	A21042	Stock is 2 mg/ml; 7 moles dye/mole IgM
Dissecting Forceps	FST	Misc.	Dumont #5 or 55; straight tipped; stainless steel or titanium
Tungsten Needle	N/A	N/A	Home made; placed in a pin holder
Blunt Forceps	Tiemann	160-18	Used for transferring embryos to Ringer's from egg yolk
Supplemental Protocol: Fabrication of a Modified Zigmond Chamber
Please refer to Figure 4 as a reference for the protocol below:
Purchase a sheet of 3/16" thick polished acrylic (4.45 mm actual thickness). Using a table saw, cut chamber blanks oversized to the rough dimensions of 33.25 mm x 64.57 mm. This allows 3.175 mm extra material for machining. Set the chamber blank on a vise. With a milling machine and a 6.35 mm (1/4") end mill bit, finish machining the sides of the chamber to their exact dimensions: 30.07 mm x 61.39 mm. Position the chamber blank on the milling machine and locate the center of the blank along both the x and y axes with an edge finder; then zero the center location. Acquire the chamber height (z-axis) by touching the end mill bit to the top surface and zero the height. Using a 3.91 mm (0.154") end mill bit, offset the bit 3.03 mm along the x-axis (positive direction) for the first reservoir. Begin machining into the chamber to a depth of 2.84 mm while moving along the y-axis (positive direction) to 7.62 mm (0.300") and then traverse to 7.62 mm (0.300") in the opposite (negative) direction to a complete reservoir length of 15.24 mm (0.600"). Offset the bit to 3.03 mm (0.119") along the x-axis (negative direction) and repeat the same process for the second reservoir. Position the chamber on its edge and drill a hole using a 1.09 mm (0.043 in.) drill bit on the end of each reservoir (4 total) that connects the end of the reservoir to the side of the chamber for loading medium during experimentation. Soak the chamber well in warm soapy water to help remove any chemical contaminants. Soak and rinse the chamber well in double-distilled water to remove any soap. The chambers are now ready to use as described above.