ניתוח של נדידת תאים עצביות קרסט טרונק באמצעות Assay השתנה Zigmond הקאמרי

Summary

גישה לנתח את ההגירה של תאים (תאי explanted רכס עצביים גזע) הוא תאר. שיטה זו היא זולה, עדינה, ומסוגלת להבחין chemotaxis משני chemokinesis והשפעות אחרות על קוטביות נדידה כגון אלה נגזרים מאינטראקציות תא תא בתוך התרבות העיקרית הגזע עצבי פסגת התא.

Abstract

תאי רכס עצביים (NCCs) הם אוכלוסייה זמנית של תאים הנמצאים בפיתוח חוליות שלהגר מצינור העצבי הגבה (NT) לאחר שעבר ^1,2 מעבר אפיתל-mesenchymal. בעקבות EMT, NCCs לנדוד מרחקים גדולים לאורך מסלולים סטריאוטיפיים עד שהם מגיעים ליעדיהם. NCCs להתמיין למגוון רחב של סוגי תאים, כוללים תאי עצב, גליה המלנוציטים, תאי ^1-3 chromaffin. היכולת של NCCs להגיע ולהכיר מקומות היעד הנכונים שלהם היא יסוד להיווצרות המתאימה של כל המבנים המכילים תא מטען נגזר ^NCC-3 מרכיבים. הבהרת מנגנוני ההדרכה לגזע NCC הגירה הייתה אפוא עניין בעל חשיבות רבה. מולקולות רבות שהפגינו להדריך NCC הגירת ^4. לדוגמה, NCCs גזע ידוע להיות דחוי על ידי רמזי הדרכה שליליים כגון Semaphorin, Ephrin, וligands חריץ ^5-8. עם זאת, לאעד לאחרונה היה לי chemoattractants של NCCs מטען זוהה ^9.

גישות קונבנציונליות במבחנה ללימוד התנהגות chemotactic של תאי חסיד עבודה הטובה ביותר עם ​​תאים הנציחו, homogenously מופץ, אך מאתגרים יותר לפנות לתרבויות מסוימות העיקריות בתאי גזע שתחילה חסרות הפצה הומוגני ומהירות להבדיל (כגון NCCs). גישה אחת לומוגני חלוקת NCCs מטען ללימודי chemotaxis היא לבודד NCCs גזע מתרבויות explant NT העיקריות, ואז להרים וreplate להיות כמעט 100% confluent. עם זאת, גישה זו דורשת ציפוי כמויות ניכרות של זמן ומאמץ כדי explant מספיק תאים, היא קשה, ומפיצת NCCs מטען באופן שונה מזו שנמצא בתנאי vivo.

כאן, אנו מדווחים גישה במבחנה כי הוא מסוגל להעריך את התגובות נודדות Chemotaxis ואחרות של NCCs מטען ללא requirinGA חלוקת תא הומוגנית. טכניקה זו מנצלת הדמיה זמן לשגות של ראשוני, ואינה נרתעת NCCs מטען בתוך modified Zigmond קאמרי (קאמרי Zigmond סטנדרטי מתואר במקום אחר ^10). על ידי חשיפת NCCs מטען בפריפריה של התרבות לשיפוע chemotactant שניצבת ליווניות הטבעיות חזו, שינויים בקוטביות נודדת הנגרמים על ידי שיפוע chemotactant מיושם ניתן לאתר. טכניקה זו היא זולה, דורשת culturing של רק שני explants NT לטיפול לשכפל, נמנע מהרמת תא קשה (כגון trypsinization), משאיר NCCs מטען בהפצה דומה יותר לתנאי vivo, חותך את כמות הזמן בין explantation וניסויים (שסביר להניח מפחית את הסיכון לבידול), ומאפשר הערכת זמן לשגות של מאפיינים נודדים רבים.

Protocol

1. יום 1: בידוד של צינורות גזע עצביים לתרבות לילה על coverslips

1. דגירת ביצי חומוס ל56 שעות ב 38 ° C. הסר את הביצים מדגירה, מרסס אותם במתינות עם אתנול 70%, ולאחר מכן לאפשר להם לייבוש. שובר את הביצים לרווחה אל תוך מגש זכוכית UV-מעוקר.
2. לחלץ כל עובר מחלמון הביצה ומניח אותו בחומוס של רינגר. עשה זאת על ידי החיתוך הראשון סביב איי דמה עם מספריים מעוגלים, ולאחר מכן עם מלקחיים בוטים, לאסוף את העובר על ידי קרום extraembryonic ומניח אותו בצלחת פטרי פלסטיק סטרילי המכילה הפתרון של האפרוח רינגר.
3. לבודד את תא המטען של כל עובר על ידי זמירה את קרומי extraembryonic עודפים כמו גם רמות ציריות גולגולת, vagal, ועצם העצה באמצעות מחט טונגסטן (1 איור). ראשית, בחר כ 9 עוברים שבין שלבי HH15-17 ^11. לשלבים HH15 ומעלה, צירי המוח הקדמי ומוח האחוריים יוצרים זווית חדה, ולכן מופיע בראש כדי להטות caudally. בשלב HH17, ניצן הזנב הוא הווה ומטה ventrally אך הוא עדיין לא מכיל somites. עם מחט טונגסטן, לקצץ את קרומי extraembryonic כ 2 מ"מ מהעובר ולנתק את כל רקמות קדמיות לsomite 10 עובריות. כמו כן להסיר את כל הרקמות העובריות caudal החל מרחבי ביותר somite 5 שהוקם זה עתה.
4. הנח את הגזעים העובריים המבודדים בDispase (0.24 U / ml DMEM) ו דגירה אותם במשך 15 דקות 1 ש 'ב 37 ° C ו 5% CO _2. ברגע שמתחילים את גזעי דגירה, להתחיל בהכנות 6 coverslips (CS) לexplants NT culturing (1.5-1.8 צעדים).
5. שטוף 6 CS באתנול 70% (בדילול במים סטריליים, ultrapure), ולאחר מכן לאפשר להם לייבוש. באמצעות סמן מעבדה, לצייר עיגול במרכזו של כל CS שהוא כ 1 סנטימטר הקוטר (מעגל זה מאוחר לעזור לך לזהות היכן מעייל פיברונקטין יושם). על אותו הפרצוף של כל CS, לכתוב את המילה "להיות" (או איזו מילה או צורה לא סימטרית אחרת) מחוץ למעגל נמשך (זה יעזור you לזהות אם הצד הבולט של CS פונה כלפי מעלה או מטה).
6. למקם כל CS ב 40 x 10 מ"מ נפרדים צלחת סטרילית עם המשטח המסומן כלפי מטה ולאפשר את הצלחת לשבת פתוחה מתחת מנורת UV קוטל חידקים למשך 10 דקות.
7. החל פיברונקטין μl 60 (FN, 10 מיקרוגרם / המ"ל DMEM) אל פני השטח לא המסומנים של CS תוך הקפדה על כל האזור בתוך עיגול 1 הסנטימטר צופה. הנח את הכלים כדי לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ולאחר מכן לשאוב פיברונקטין מכל CS בזהירות.
8. הוסף 250 בינוניים μl "התרבות" [DMEM עם L-גלוטמין (2 מ"מ), פניצילין (100U/ml), סטרפטומיצין (100 מיקרוגרם / מ"ל), ושל 8% בסרום שור עוברי (FBS)] לאזור FN המצופה של CS. מניח את המנות המכילות כל CS ב 37 ° C ו 5% CO ₂ שוב, עד שנוירוטיפיקלים היו מבודדים.
9. להעביר את כל גזעי עובר מודגרות לצלחת אחת 5 סנטימטר זכוכית פטרי המכילה L15 בינוני ולהתחיל לנתח את כל NT באמצעות מלקחיים עדינים ומחט טונגסטן (1 איור). גarefully יפרוס לאורך הגבול של NT וsomites עם מחט טונגסטן חדה בעת היותו זהיר שלא לפגוע בNT. זה בדרך כלל קל יותר להתחיל בידוד כל NT מהזנב ביותר סוף תא המטען.
10. בחר 6 לנוירוטיפיקלים straightest והארוכים ביותר לתרבות לילה (בין נוירוטיפיקלים בערך 8 ו 15 somites ארוך מומלצים). שימוש בטיפ micropipette דרוך עם מדיום התרבות, תעביר כל אחת מ6 נוירוטיפיקלים לעצמו CS הכין בעבר (משלבים 1.5 עד 1.8). הקפד שהנטורופתי לא יישאר צף על פני השטח. אם NT היא צפה, לטפטף מדיום אליו עד שהיא נקבר באמצעות micropipette.
11. הנח בכל צלחת 37 ₂ הלילה ° C ו 5% CO. להיות זהיר כדי להבטיח לכל NT היא בתוך אזור FN המצופה של CS השייך לו מייד לפני הצבת הצלחת בחממה (באמצעות המעגל נמשך בשלב 1.5 כהפניה). Micropipette יכול לשמש טוב יותר כדי להתאים את המיקום של כל NT במידת צורך.
12. מקום ב2 לפחות מ"ל של מדיום התרבות (ללא סרום) לתוך צינור צנטריפוגות סטרילי 15 מ"ל ו דגירת הלילה בשעת 37 ° C ו 5% CO _2. השאר את הכובע מעט פרקתי לאפשר החומציות של המדיום להתאים בין הלילה. טרום דוגר מדיום הוא חשוב כדי למנוע היווצרות בועה בחדר שלך, שעלול לשבש את הקמת שיפוע מולקולרי. בינוני כגון "preincubated" יש להשתמש בכל אמצעים בעתיד. כאשר לא בשימוש, המדיום הזה יש דוגר על 37 ° C.

2. יום 2: טוען הקאמרי modified Zigmond וניתוח זמן לשגות של נדידת תאים

1. מתוך 6 נוירוטיפיקלים התרבית, בחר את 3 התרבויות המתאימות ביותר לניתוח. באופן כללי, תרבויות NCC כי יש לפחות אחד קצוות ארוכים וישרים יש לבחור (איור 2A). את 3 התרבויות הטובות ביותר, תשמשנה לטעינה ולסרט 3 תאים שונה Zigmond לאורך היום, כל אחד עם יחס שונה. מתוך 3 תרבויות, לבחור אחד לloadinגרמתי לראשונה לחדר ולהחזיר את השאר לחממה לשימוש מאוחר יותר.
2. באמצעות קיסם אוזניים, תחול, גם שכבה דקה של וזלין מקיפה את מאגרי המים והגשר של אחד modified Zigmond קאמרי.
3. עם מחט טונגסטן, בעדינות להסיר NT מ CS, תוך השארת NCCs מקיף מצורף אל פני השטח של CS. סמן את הצלחת עם עט לזכור את הכיוון של הקצה הישר של תרבות NCC.
4. הנח כמה טיפין של מדיום preincubated אל הגשר. הרם את CS עם מלקחיים עדינים, טיפת קצה CS נגד Kimwipe להסיר ביותר של מדיום התרבות הישן, ואז למקם מייד CS על עדכון Zigmond הקאמרי כך שהקצה הישר של התרבות להצטלם מרוכז על אורכו של הגשר ובערך בניצב לגבול גשר המאגר (האיור 2A, B).
5. באמצעות מיקרוסקופ הפוך, להזיז את גבול NCC ישר להיות בצד של הגשר הקרוב ביותר למאגר הדואר שיכיל chemotactant החשד (האיור 2B; לפקדים זה מתאים לאיזה מאגר נטען שני). כמו כן, יותר דק ליישר את הקצה הישר של התרבות להיות ניצב לגבול גשר המאגר.
6. בזהירות, אבל בטוח לחץ CS לוזלין הנוכח בחדר Zigmond, כדי לוודא שהוא אטום לחלוטין לקאמרי, ואז למקם וזלין נוסף בשולי CS נוסף כדי להבטיח שהיא תהיה אטומה. עדין להתאים את הזווית של גבול NCC שוב כדי לתקן את כל תנועה בתהליך האיטום.
7. טען את המאגר שלא יכיל chemotactant 1 החשד (איור 2 ב '). לעשות זאת על ידי טעינת מזרק 1 מ"ל (25 G x 1.5 פנימה מחט מצורפת) עם בערך 300 בינוניים preincubated μl ולהזריק לתוך המאגר הבינוני עד מלא (בזמן נזהר שלא ליצור כל בועות במאגר). חבר את המאגר בשני הצדדים עם suffכמות icient של וזלין לפני טעינת המאגר הבא.
8. חזור על שלב 2.7, אלא שהפעם באמצעות מדיום המכיל preincubated chemotactant המועמד. זה קריטי בעת יצירת שיפוע מולקולרי על פני התרבות תמיד לטעון את המאגר המכיל את המולקולה להיבדק לאחר טעינת המאגר חסר מולקולה הנבדקת.
9. הנח הקאמרי Zigmond הטעון ב 37 ° C כדי לדגור על h 1 לפני צילומים. תמונת הגבול הישר של תרבות NCC למשך 3 שעות במרווחי הזמן של 90 בעוד שדוגר על בערך 37 מעלות צלזיוס (האיור 2A, B). לפני יצירה כל סרט, הקפד ליישר את המצלמה כך שהקצה את התמונות כדי לקבל מיושר עם ונוגע בקצה של הגשר שגובל במאגר הטעון האחרון (האיור 2B, פנל העליון; תיבה מקווקות מייצג אידיאלי עמדה להדמיה). זה יהיה להקל על ניתוח מאוחר יותר על ידי תוכנת תקנון הכיווניות של השיפוע המולקולרי יושם והמרחק דואר מהמאגר שצולם בכל סרט הופק.
10. עבור פקדים, חזור על שלבים 2.2-2.9 לכל אחד משתי תרבויות NCC האחרות שנבחרו (בשלב 2.1), אבל למלא בכל מאגר עם מדיום מתאים. לסוג אחד של שליטה למלא שני המאגרים עם מדיום preincubated לא מכיל את המולקולה כדי להיבדק. לטיפול ביקורת שני, ראש הגשר עם כמה טיפין של מדיום preincubated מכיל chemotactant החשד לפני הרכבת CS. אז, טען שני המאגרים עם אותו המדיום המכיל chemotactant החשד.
11. השתמש ImageJ (NIH) מעקב ידני (rsb.info.nih.gov / ij / תוספים / מסלול / track.html) וChemotaxis וכלי להעברה v1.01 (www.ibidi.de / יישומים / ap_chemo.html) plugins כדי לעקוב אחר ההגירה של NCCs ההיקפי לאורך הגבול הישר של j התרבותust צלם ולנתח את הפרמטרים שונים של מסלולי הנדידה התקבלו (איור 2B-C).

3. נציג תוצאות:

מדגם של מסלולים סלולריים מסרט שבו רב NCCs מטען היה מגיב לchemoattractant מועמד באמצעות טכניקה הנ"ל מוצג (איור 2 ד). רוב התאים בדוגמה זו של תגובה חיובית מוצגים תנועות נטו במעלה שיפוע chemoattractant (כפי שמוצג באדום). נתוני מסלול יכולים לשמש כדי לנתח מאפיינים אחרים של נדידת תאים גם כן.

על מנת להעריך חזותי שיפוע מיושם בmodified Zigmond קאמרי, Alexa פלואוריד 488 IgM המצומד (MW ~ 900 KDA) הוכנס למאגר השני של modified Zigmond קאמרי (בערך 40 מיקרוגרם / המ"ל H ₂ O). שיפוע הוקם על ידי 1 ש 'ועדיין קצת נוכחי לאחר 26 שעות, אך הצטמצם מאוד של 50 שעות (3 איור). אם המולקולה להיבדק היא קטנה יותר, ולאחר מכן להחיל השיפוע will לבזות מהר יותר ממה שמוצג.

איור 1. Explantation של נוירוטיפיקלים תא מטען ברמה לculturing הלילה בcoverslips פיברונקטין המצופה. בגלל delaminate NCCs עורק מNT הגבתה הממוקם בסמוך לsomites 8-28, זה קטע של NT מבודד ידי microdissection ולילה על CS פיברונקטין מצופה תרבותי כדי לאפשר הגירה של NCCs מexplant NT. נוירוטיפיקלים מבודדים שבין 8-15 somites ארוך וישר יחסית, הם מתאימים ביותר עבור culturing הלילה כפי שהם נוטים להניב תרבויות NCC בגבולות ישרים יותר. אזורים של הצינור העצבי שמעוררים רמות ציריות אחרות עצביות רכס מוצגים בגופן קטן יותר. s, somite.

איור 2. שיטה להערכת ההגירה של NCCs המטען explantedבאמצעות תא Zigmond modified. () תרבויות NCC מטען המוארכות שהוכנו על ידי culturing הלילה של נוירוטיפיקלים ותרבויות NCC תוצאה עם אחד לפחות גבול ארוך, ישר נבחרו לניסויים. הגבול הישר הארוך ביותר של תרבות שנבחר לאחר מכן מוצב בניצב לגבול גשר המאגר, ולכן במקביל לווקטור של השיפוע מיושם העתיד. (ב ') לאחר שקנס התאמה-העמדה של תרבות NCC בZigmond הקאמרי והאיטום coverslip לתא, התא טעון. כשבדוק chemotaxis, המאגר שלא יכיל chemotactant החשד (-) נטען ראשון ואטום. ואז, המאגר האחר הוא עמוס chemotactant החשד (+) והאטום. NCCs ההיקפי לאורך הגבול שנבחר בעבר אז יכול להיות צלם ומעקב באמצעות תוסף מעקב הידני לImageJ (פנל תחתון). (C) מאפיינים נודדים רבים בתגובהלשיפוע מיושם ניתן להעריך על סמך נתוני מעקב. לדוגמה, מדד chemotaxis ניתן לגזור על ידי חלוקת העקירה של תא לאורך ציר x במרחק הכולל הוא הגר. (ד ') דוגמה לתגובה אטרקטיבית מוצגת על ידי עלילת מסלול תא שנוצרה בתחילה על ידי Chemotaxis וההגירה תוסף כלי לImageJ. נקודת המוצא של כל מסלול מוגדרת למקור (0,0). שים לב כמה יותר תאים נודדים לכיוון מרכז source.The chemoattractant של מסה של כל התאים בעמדתם הסופית (צלב כחול; כל תאי משקל זהים) הוא גם קרוב יותר למקור chemoattractant. NCCs, תאי רכס עצביים; מסלולים אדומים, תאים שנדדו לכיוון המאגר עמוס בחשד chemoattractant; מסלולים שחורים, תאים שנדדו משם; (+), ריכוז גבוה יותר; chemotactant (-), ריכוז chemotactant תחתון.

פרופילי אינטנסיביות על הגשר קאמרי Zigmond עדכון בזמנים שונים בעקבות תוספת של הצמוד Alexa פלואוריד 488 IgM. החדר היה עמוס באופן דומה לזה מתואר בפרוטוקול עם החריגים העיקריים שמי preincubated (במקום בינוני preincubated) שמש כדי לדלל את הנוגדן עד 40 מיקרוגרם / מ"ל, וכיסי אוויר קטנים נכחו בקצוות של הגשר (מהפרוסה שבו הפרופילים בעצמה מעל בי נלקחו). בתחילה, לא היה נוכח פני שיפוע ביותר של הגשר. ידי השיפוע 1 חה הוקם ונותר בעינה עד 26 שעות. על ידי 50 שעתי הנוכחות של השיפוע לא הייתה עקבית באזורים שונים של הגשר, וכאשר קיים, תלילות השיפוע צומצמה מאוד. כל הפרופילים שהופקו מפרוסה זהה מעבר לגשר (מגבול אחד גשר למאגר האחר) באמצעות 4.6 AxioVision תוכנה. שים לב שגם בזמן אווירכיסים היו נוכחים, השיפוע לא היה משובש. עצמה גבוהה, גבוהה; נמוכה, עצימות נמוכות; ציר x, מרחק על פני כל רוחבו של הגשר (2 מ"מ); (+), מאגר עמוס Alexa פלואוריד 488 IgM הצמוד; (-), מאגר לא עמוסה הצמוד.

איור 4. המפרטים השתנו Zigmond הקאמריים. המוצגים הם תרשים של modified Zigmond הקאמרי משמש כאן יחד עם מפרטי ממדיה (± 0.2 מ"מ). מדידות יכולות להיות מותאמות באופן מתון על מנת שיתאים להעדפותיו.

פרוטוקול משלים: המצאה של שינוי Zigmond קאמרי

אנא עיין באיור 4 כנקודת התייחסות לפרוטוקול שלהלן:

1. לרכוש גיליון "אקריליק המלוטש העבה 3/16 (עובי 4.45 מ"מ בפועל).
2. שימוש בטבלה ראה, לחתוך חסר קאמרי גדול מדי לממדים גסים של 33.25 מ"מ x 64.57 מ"מ. זה מאפשר חומר נוסף 3.175 מ"מ לעיבוד שבבי.
3. הגדרה הריקה הקאמרי בצבת. עם מכונת טחינה ו6.35 מ"מ (1/4 ") קצת טחנת הסוף, עיבוד שבבי לסיים את הצדדים של התא למידות המדויקות שלהם: 30.07 מ"מ x 61.39 מ"מ.
4. מקם את הריק הקאמרי במכונת הטחינה ולאתר את המרכז הריק לאורך שני צירי x ו-y עם מאתר קצה, ואז לאפס את מיקום המרכז.
5. לרכוש את גובה התא (ציר Z-) על ידי נגיעה קצת טחנת הסוף למשטח העליון ולאפס את הגובה.
6. שימוש קצת טחנת סוף 3.91 מ"מ (0.154 "), קוזז 3.03 המ"מ קצת לאורך ציר X (כיוון חיובי) למאגר הראשון. בגין עיבוד לתוך החדר לעומק של 2.84 מ"מ ואילו נע לאורך ציר y (כיוון חיובי) ל7.62 מ"מ (0.300 ") ולאחר מכן לעבור ל7.62 מ"מ (0.300") בכיוון ההפוך (שלילי) למאגר מלא אורך של 15.24 מ"מ (0.600 "). לקזזקצת ל3.03 מ"מ (0.119 ") לאורך ציר X (כיוון שלילי) ולחזור על אותו התהליך למאגר השני.
7. מקם את החדר בקצה שלה ולקדוח חור באמצעות 1.09 מ"מ (0.043 אינץ') מקדח בסיומו של כל מאגר (4 סה"כ) שמחבר את קצו של המאגר לצד של החדר לטעינה בינונית במהלך ניסויים.
8. משרה את החדר היטב במים חמים וסבון כדי לסייע להסיר את כל מזהמים כימיים.
9. משרים ולשטוף היטב במי החדר מזוקקי פעמים כדי להסיר כל סבון. התאים מוכנים כעת לשימוש כמתואר לעיל.

Discussion

מחקר chemotaxis על NCCs הגזע הוכיח מאתגר עבור סדרה של סיבות. NCCs Trunk מהווה אוכלוסייה הטרוגנית של תאי גזע שתתמיין ואם תרבותי לטווח ארוך, ולכן יש לקבל NCCs הגזע מexplantation העיקרי של NT תא מטען ברמה. שיטות מקובלות ללימוד תגובת chemotactic של אוכלוסיות תאים חולקו homogenously במבחנה קשות לבדוק בNCCs הגזע כי הם דורשים ראשונים שהתאים מבודדים וhomogenously replated בchemotaxis התא (לדוגמה, ¹² Boyden קאמרית). בידוד מספיק NCCs יכול להיות משעמם כמו explantation של עשרות נוירוטיפיקלים עשויה להידרש כדי ליצור פיזור הומוגני של NCCs מטען המספיק לעוד ניסוי אחד. בנוסף, הם מעולם לא הרים NCCs, מעורב, וhomogenously מחדש בהקשר הטבעי שלהם. לכן, NCCs שreplated כדי לבצע מבחני Chemotaxis קונבנציונליים מסוימים עשויה להתנהגבאופן שונה לגמרי מתנאי vivo בכל קשור להתנהגות נדידה.

כאן, אנו מתארים טכניקה שונה להערכת הגזע NCC chemotaxis בהקשר טבעי יותר. אתגר גדול בעת הערכת תגובת chemotactic של NCCs מטען ללא חלוקה הומוגנית הוא הקוטביות הטבועה החזקה של NCCs בתוך תרבות explant המקורית בנוסף לזהות הטרוגנית המולדת. לדוגמה, NCCs הגזע נוטה להגר במידה רבה ניצבת (שם) מNT כאשר בתרבות ^13. את הגורמים שוני הקוטביות NCC גזע השפעה בתרבות explant יכול להיות כל כך חזק שקשה לקבוע סופית את זהות שינויים בקוטביות תא מושרה על ידי שיפוע chemotactant. שימוש assay Zigmond העדכון החדש שלנו, ניתן להבחין בין קוטביות תא הטבעית טבועה explant תרבויות ושינויים הנגרמים על ידי שיפוע chemotactant, תוך ניטור parame נודד אחר ters כגון התמדה ומהירות. אנו צפינו שבזווית כל גבול של תרבות explanted גזע NCC פרצופים קובעת במידה רבה יווני הפנימיות של תא המטען NCCs החדשני שבגבול. לדוגמה, אם גבול של תרבות NCC פונה צפונה, אז הכיווניות הממוצעת של NCCs שמהגבול תהיה צפונית. assay השונה ממזער שונות הנגרמות על ידי יווני הפנימיות של NCCs קצה מוביל בתקנון הזווית של גבול NCC שממנו הם נודדים יחסית לשיפוע chemotactant מיושם (איור 2A). על ידי בחירת NCCs חדשני על גבול ישר יחסית של תרבות NCC תא המטען, תמיד מיצוב שניצב גבול NCC ישר לשיפוע המוחל, ולאחר מכן רק מעקב ההגירה של תאים המתקדמים שבגבול, אחד הוא מסוגל לזהות שינויים בכיווניות הממוצעת של NCCs מטען לעבר או הרחק ממקור chemotactant שאחרת לא להתגלות.

> אף אוזן גרון "להלן סיכום של יתרונות הרבים הנגזרים מהפרוטוקול לעיל:

1. הוא מציע את היכולת לעקוב אחר נדידת תאים חייה.
2. עדכון Zigmond התא יכול לייצר שיפוע מוגדר יחסית שניתן דמיין במולקולת ניאון (3 איור).
3. תאי Zigmond למנוע מגבלות מסוימות של assay Boyden הסטנדרטי תואר בעבר על ידי אחרים ^10,14.
4. התאים המהונדסים Zigmond ניתן תוצרת בית בעלות נמוכה מאוד (חומרים מוערכים בפחות מ 1 דולר לחדר לשימוש חוזר).
5. בגלל צינורות עצביים בתרבית על coverslips ומאוחר יותר נחתמו עם וזלין, אפשר בקלות לבחור את הכיוון של התרבות ביחס לשיפוע מיושם בעתיד.
6. Trypsinization או גירוד תא אינו נדרש.
7. רק כמות קטנה של בידודי NT היא הכרחית.
8. תרבות NCC היא יותר דומה להתפלגות של NCCs מטען שנמצא בגוף חי מתאים כאשרהוא מוסר וreplated עם חלוקה הומוגנית.

יתרונות אלה עשויים גם יחולו על תרבויות explant העיקריות המקבילות של סוגי תאים אחרים, ולכן, גישה זו עשויה להיות רחבה יותר כדאיות לשימוש בהערכה של התנהגות הנדידה הטבעית של תאי גזע explanted אחרים.

למרות היתרונות של assay modified Zigmond הקאמרי רבים, זה יש כמה מגבלות. כמה חסרונות של קאמרי Zigmond הסטנדרטי כבר נדון בעבר על ידי חוקרים ^14. מגבלה אחת של assay Zigmond השונה שלנו היא השימוש בוזלין להרכבת CS וחיבור כל חור מאגר. וזלין מאפשר גמישות דווקא להתמצא תרבות NCC יחסית לשיפוע chemotactant, אבל מוביל לשונות במרחק בין CS והגשר אשר יכולה לגרום לשונות בשיפוע מיושם ^14. בנוסף, גוברCS ואיטום הקאמרי עם וזלין לעתים מלכודות כיסים קטנים של אוויר בחדר שיכול לדחוס מוביל לכמויות קטנות של זרימה על פני הגשר ^14. הזרימה כזו עלולה לשבש את השיפוע המולקולרי במהלך ניסויים מסוימים ולהוביל לשונות גדלו בתוצאות של 1. אמנם זה אפשרי, שיבוש שיפוע קשה לא נצפה כאשר דמיינו באמצעות Alexa פלואוריד 488 IgM המצומד (3 איור), אפילו תוך כיסי אוויר נכחו כיוון הקצוות של הגשר (הרחק מהאזור שבו ניאון העוצמת נמדדה) . לכן, גם בתנאים שהיה יכול להיות שבשו את שיפוע Alexa פלואוריד 488 IgM פוטנציאלי, השיפוע לא נפגע באזור של הגשר נמדד (קרוב יותר לאמצע של הגשר). אם אחד דורש שיפוע ארוך טווח, שהוא יציב מאוד והן צפוי, אז assay זה סביר להניח כי לא יספיק. עם זאת, דיוק כזה הוא לעתים קרובות לא יידרש ובהשוואה לחלק שנימבחני Chemotaxis נפוצים (כגון מבחני Boyden או מבחנים מסוימים באמצעות חרוזים chemotactant ספוגים), השיפוע צפוי להיות יותר יציב וצפוי.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Omega Scientific	DM-22
Penicillin Streptomycin Solution	Omega Scientific	PS-20	100X Stock Concentration
L-Glutamine	Omega Scientific	GS-60	100X Stock Concentration
Fetal Bovine Serum	Omega Scientific	FB-11	Lot# 105247 (or another that is comparable)
Modified Zigmond chamber	Home made	N/A	Reservoir volume: ~ 160 μl ea; for additional specifications, see Fig. 4 and the supplemental fabrication protocol
Cell culture dish	Denville	T6040	40 x 10 mm
Fibronectin	BD	354008	10X Stock prepped by diluting 1 mg FN in 1 ml H2O and 9 ml DMEM
Coverslips	Fisher	12-548-B	Precleaned; 22 x 22 mm
L15 medium	Thermo Scientific	SH30525.02
Petroleum Jelly	Comforts	011110794642	100%
Centrifuge tube	Biologix	10-9152	15 ml
Dispase	Cell Systems	4Z0-850	10X Stock Concentration
Syringe	BD	309602	1 ml
Needle	BD	305127	25 G x 1.5 in.
Alexa Fluor 488-IgM	Invitrogen	A21042	Stock is 2 mg/ml; 7 moles dye/mole IgM
Dissecting Forceps	FST	Misc.	Dumont #5 or 55; straight tipped; stainless steel or titanium
Tungsten Needle	N/A	N/A	Home made; placed in a pin holder
Blunt Forceps	Tiemann	160-18	Used for transferring embryos to Ringer's from egg yolk
Supplemental Protocol: Fabrication of a Modified Zigmond Chamber
Please refer to Figure 4 as a reference for the protocol below:
Purchase a sheet of 3/16" thick polished acrylic (4.45 mm actual thickness). Using a table saw, cut chamber blanks oversized to the rough dimensions of 33.25 mm x 64.57 mm. This allows 3.175 mm extra material for machining. Set the chamber blank on a vise. With a milling machine and a 6.35 mm (1/4") end mill bit, finish machining the sides of the chamber to their exact dimensions: 30.07 mm x 61.39 mm. Position the chamber blank on the milling machine and locate the center of the blank along both the x and y axes with an edge finder; then zero the center location. Acquire the chamber height (z-axis) by touching the end mill bit to the top surface and zero the height. Using a 3.91 mm (0.154") end mill bit, offset the bit 3.03 mm along the x-axis (positive direction) for the first reservoir. Begin machining into the chamber to a depth of 2.84 mm while moving along the y-axis (positive direction) to 7.62 mm (0.300") and then traverse to 7.62 mm (0.300") in the opposite (negative) direction to a complete reservoir length of 15.24 mm (0.600"). Offset the bit to 3.03 mm (0.119") along the x-axis (negative direction) and repeat the same process for the second reservoir. Position the chamber on its edge and drill a hole using a 1.09 mm (0.043 in.) drill bit on the end of each reservoir (4 total) that connects the end of the reservoir to the side of the chamber for loading medium during experimentation. Soak the chamber well in warm soapy water to help remove any chemical contaminants. Soak and rinse the chamber well in double-distilled water to remove any soap. The chambers are now ready to use as described above.