تحليل العصبية كريست الهجرة جذع الخلية باستخدام التعديل الفحص غرفة زيجموند

Summary

يوصف هذا النهج لتحليل الهجرة من الخلايا explanted (خلايا الجذع قمة العصبية). هذه الطريقة غير مكلفة، لطيف، وقادرة على التمييز الكيميائي من كلا تنشيط كيميائي والتأثيرات الأخرى على الاستقطاب المهاجرة مثل تلك المشتقة من خلية خلية التفاعلات داخل الجذع العصبية الأولية قمة الثقافة الخلية.

Abstract

الخلايا العصبية قمة (البلدان المساهمة الصافية) هي عابرة السكان من الخلايا موجودة في الفقاريات التي التنمية الهجرة من الأنبوب العصبي الظهري (NT) بعد خضوعه ^ل1،2 الانتقال الظهارية-الوسيطة. بعد EMT، البلدان المساهمة الصافية الهجرة مسافات كبيرة على طول مسارات النمطية حتى وصولها الى اهدافها. البلدان المساهمة الصافية تفرق في مجموعة واسعة من أنواع الخلايا بما في ذلك الخلايا العصبية، الخلايا الدبقية، الخلايا الصباغية، والخلايا أليفة الكروم ^1-3. قدرة البلدان المساهمة الصافية لتصل إلى مواقعها والتعرف على الهدف الصحيح هو التأسيسية لتشكيل المناسب لجميع الهياكل التي تحتوي على الجذع NCC المستمدة من المكونات ^3. توضيح آليات التوجيه لجذع NCC الهجرة كان ذلك مسألة ذات أهمية كبيرة. وقد أظهرت العديد من الجزيئات لتوجيه NCC الهجرة ^4. على سبيل المثال، من المعروف أن البلدان المساهمة الصافية الجذع صده العظة التوجيه السلبية مثل Semaphorin، Ephrin، والشق يغاندس ^5-8. ومع ذلك، لاحتى مؤخرا أي من البلدان المساهمة الصافية chemoattractants الجذع تم تحديد ^9.

التقليدية في النهج المختبر لدراسة السلوك الكيميائي للخلايا ملتصقة تعمل بشكل أفضل مع الخلايا متجانس خلد، توزيع، ولكنها أكثر صعوبة لتطبيق بعض الثقافات الخلايا الجذعية الأولية التي تفتقر في البداية توزيع متجانس وتفرق بسرعة (مثل البلدان المساهمة الصافية). نهج واحد لتحقيق التجانس توزيع البلدان المساهمة الصافية للدراسات الجذع الكيميائي هو عزل البلدان المساهمة الصافية الجذع من المرحلة الابتدائية الثقافات يزدرع NT، ثم ارفع وreplate لها أن تكون ما يقرب من 100٪ متموجة. ومع ذلك، فإن هذا النهج يتطلب الطلاء كميات كبيرة من الوقت والجهد ليزدرع الخلايا بما فيه الكفاية، قاس، وتوزيع البلدان المساهمة الصافية الجذع بطريقة تختلف عن تلك الموجودة في الجسم الحي في ظروف.

هنا، ونحن التقرير نهجا في المختبر قادر على تقييم ردود المهاجرة الكيميائي وغيرها من البلدان المساهمة الصافية دون الجذع requirinالجا متجانسة التوزيع الخلية. هذه التقنية تستخدم الوقت الفاصل بين التصوير الأولية، رابط الجأش البلدان المساهمة الصافية الجذع داخل غرفة زيجموند المعدلة (يوصف غرفة زيجموند القياسية في أماكن أخرى ^10). من خلال تعريض البلدان المساهمة الصافية في محيط الجذع من الثقافة إلى أن الانحدار chemotactant هو عمودي على اتجاهها الطبيعي توقع، يمكن الكشف عن تغييرات في الاستقطاب الناجم عن الهجرة التدرج chemotactant التطبيقية. هذه التقنية غير مكلفة، تتطلب زراعة من إإكسبلنتس NT اثنين فقط في علاج تكرار، يتجنب قاسية رفع الخلية (مثل trypsinization)، ويترك البلدان المساهمة الصافية في الجذع توزيع أكثر مماثلة لفي ظروف الجسم الحي، التخفيضات مقدار الوقت بين explantation والتجريب (مما يقلل من خطر المحتمل تمايز)، ويسمح الوقت الفاصل بين تقييم الخصائص المهاجرة عديدة.

Protocol

1. يوم 1: عزل أنابيب الجذع العصبية للثقافة بين عشية وضحاها على coverslips

1. احتضان البيض لمدة 56 ساعة فرخ في 38 ° C. إزالة البيض من الحضانة، أقل ما يقال لهم رش مع الايثانول 70٪، ومن ثم تسمح لهم لتجف. كسر البيض في فتح علبة زجاجية معقمة للأشعة فوق البنفسجية.
2. استخراج الجنين من كل صفار ووضعه في وقارع الأجراس فرخ. القيام بذلك عن طريق الحشة الأولي حول الجزر الدم مع مقص منحني، ثم، مع ملقط حادة، واختيار الجنين من قبل الغشاء خارج الجنين ووضعه في طبق بتري بلاستيكية معقمة تحتوي على فرخ حل رينغر.
3. عزل جذع كل جنين من تقليم قبالة الأغشية خارج الجنين الزائد وكذلك مستويات المحوري الجمجمة، المبهمي، والعجزية باستخدام إبرة التنغستن (الشكل 1). أولا، حدد حوالي 9 الأجنة التي هي بين المراحل HH15-17 ^11. لمراحل HH15 فما فوق، ومحاور الدماغ الأمامي والدماغ المؤخر تشكل زاوية حادة، وبالتالي يبدو أن رئيس إمالة نحو caudally. فيالمرحلة HH17، المهد الذيل موجود ويميل بطنيا ولكن لا تحتوي على somites بعد. مع إبرة التنغستن، وتقليم قبالة الأغشية خارج الجنين إلى حوالي 2 مم من الجنين وقطع أي الأنسجة الجنينية سابقة لالجسيدة 10. أيضا إزالة جميع الأنسجة الجنينية بدءا من الذيلية حول الجسيدة معظم 5 التي شكلت حديثا.
4. وضع جذوع معزولة الجنينية في Dispase (0.24 U / مل DMEM) واحتضان لهم لمدة 1 دقيقة 15 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO _2. وبمجرد أن تبدأ جذوع الحضانة، البدء في إعداد coverslips 6 (CS) لإإكسبلنتس NT زراعة (1،5-1،8 الخطوات).
5. 6 شطف CS في الايثانول 70٪ (المخفف في الماء، ومعقمة عالى النقاء)، ومن ثم تسمح لهم لتجف. باستخدام علامة المختبر، رسم دائرة في وسط كل هذا هو CS حوالي 1 سم في القطر (هذه الدائرة في وقت لاحق سوف تساعد على تحديد حيث تم تطبيق معطف فبرونيكتين). على وجه كل نفس CS، وكتابة كلمة "يكون" (أو كلمة أخرى غير متناظرة بعض أو شكل) خارج دائرة مرسومة (وهذا سوف يساعد Yأوو تحديد ما اذا كان الجانب ملحوظ في CS تواجه أعلى أو لأسفل).
6. وضع كل CS في 40 × 10 مم منفصلة طبق معقم مع سطح ملحوظ أسفل والسماح للطبق مفتوحة للجلوس تحت أشعة فوق البنفسجية مبيد للجراثيم مصباح لمدة 10 دقيقة.
7. وهي مغلفة على السطح لا تحمل علامات من CS حين التأكد من كامل المنطقة ضمن دائرة 1 سم، وتطبيق 60 ميكرولتر فبرونيكتين (10 ميكروغرام / مل DMEM FN). ضع الأطباق في لاحتضان C ° 37 لمدة 30 دقيقة ثم نضح بعناية فبرونيكتين من كل CS.
8. إضافة 250 ميكرولتر "الثقافة" المتوسطة [DMEM مع الجلوتامين L-(2 ملم)، البنسلين (100U/ml)، الستربتوميسين (100 ميكروغرام / مل)، و 8٪ مصل بقري جنيني (FBS)] إلى المنطقة FN المغلفة لل وCS. ضع الأطباق التي تحتوي على كل CS في 37 ° C و 5٪ CO ₂ مرة أخرى إلى أن يتم عزل اليلة.
9. نقل جميع جذوع الجنين المحتضنة لطبق واحد 5 سم بيتري زجاجية تحتوي L15 المتوسطة والبدء في تشريح كل من NT باستخدام ملقط غرامة إبرة التنغستن و(الشكل 1). Cشريحة arefully على طول الحدود من NT وsomites بإبرة حادة التنغستن في حين يجري الحذر على عدم الاضرار NT. غالبا ما يكون من الأسهل أن تبدأ عزل كل من NT نهاية الذيلية الأكثر من الجذع.
10. حدد 6 من اليلة استقامة وأطول ليلة وضحاها إلى ثقافة (NTS بين ما يقرب من 8 و 15 somites طويلة ينصح). تلميح باستخدام micropipette معبي مع ثقافة المتوسط، ونقل كل من NTS 6 إلى CS الخاصة به معدة مسبقا (من خلال الخطوات 1،5 1.8). تأكد من أن لا تبقى NT العائمة على السطح. إذا كان NT هو العائمة، بالتنقيط المتوسطة على ذلك حتى تغرق باستخدام micropipette.
11. وضع كل طبق في 37 ° C و 5٪ CO ₂ ليلة وضحاها. كن حذرا لضمان كل NT هو داخل منطقة FN المغلفة من CS الخاصة به مباشرة قبل وضع الطبق في الحاضنة (باستخدام دائرة مرسومة في الخطوة 1.5 كمرجع). ويمكن استخدام micropipette لضبط أفضل لموقف كل NT إذا لزم الأمر.
12. مكان فيلا يقل عن 2 مل من مستنبت (بدون المصل) إلى 15 مل العقيمة أنبوب الطرد المركزي واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و 5٪ CO _2. اترك الغطاء مرفوعا مفكوك قليلا للسماح الرقم الهيدروجيني للمتوسطة لضبط يلة وضحاها. قبل تفرخ وسيلة مهمة للمساعدة في منع تشكيل فقاعة في الغرفة الخاصة بك، والتي قد تعطل إقامة التدرج الجزيئية. وينبغي استخدام "preincubated" هذه المتوسطة في جميع الخطوات المستقبلية. عندما لا تكون قيد الاستخدام، يجب أن تفرخ هذه الوسيلة في 37 ° C.

2. يوم 2: تحميل وغرفة زيجموند عدل والوقت الفاصل بين تحليل للهجرة الخلية

1. من اليلة 6 مثقف، حدد 3 الثقافات الأنسب للتحليل. عموما، ينبغي اختيار الثقافات NCC التي لديها واحد على الأقل طويلة، حافة مستقيمة (الشكل 2A). سيتم استخدام أفضل 3 إلى الثقافات وتحميل الفيلم 3 غرف تعديل زيجموند على مدار اليوم، مع كل معاملة مختلفة. من الثقافات 3، اختيار واحد من التحميل للز الغرفة الأولى والعودة إلى الآخرين حاضنة لاستخدامها لاحقا.
2. باستخدام قطعة من القطن، وتطبيق طبقة رقيقة من الفازلين حتى المحيطة الخزانات وجسر واحد غرفة زيجموند المعدلة.
3. مع إبرة التنغستن، وإزالة بلطف NT من CS، بينما تترك البلدان المساهمة الصافية المحيطة تعلق على سطح CS. بمناسبة الطبق مع القلم أن نتذكر اتجاه استقامة حافة الثقافة NCC.
4. ضع بضع قطرات من preincubated المتوسطة على الجسر. التقاط ملقط غرامة CS مع، ربت على حافة CS ضد Kimwipe لإزالة معظم المتوسطة الثقافة القديمة، ثم وضع على الفور CS على غرفة زيجموند معدلة بحيث يتم توسيط حافة مستقيمة للثقافة ليتم تصويره على مدى طول الجسر تقريبا وعمودي على الحدود الجسر الخزان (الشكل 2A، B).
5. باستخدام مجهر مقلوب، نقل مباشرة إلى الحدود NCC يكون على جانب من الجسر الأقرب إلى الخزان ه التي سوف تحتوي على المشتبه chemotactant (الشكل 2B؛ لعناصر هذا سوف تتوافق مع أيهما الخزان يتم تحميل الثانية). أيضا، أكثر دقة محاذاة حافة مستقيمة للثقافة أن تكون عمودية على الحدود الجسر الخزان.
6. بعناية، ولكن اضغط آمن CS في الفازلين موجودة على غرفة زيجموند، والتأكد من ومختومة تماما إلى الغرفة، ثم وضع الفازلين على طول إضافية على حافة CS لضمان مزيد من سيكون محكم. غرامة ضبط زاوية من الحدود NCC مرة أخرى لتصحيح أي حركة أثناء عملية الختم.
7. تحميل الخزان من شأنها أن لا يحتوي على اكتشاف اول chemotactant (الشكل 2B). القيام بذلك عن طريق تحميل حقنة 1 مل (25 × 1.5 بوصة G إبرة المرفقة) مع المتوسط ​​نحو 300 ميكرولتر preincubated وحقن المتوسطة في الخزان حتى الشبع (مع الحرص على عدم توليد أي فقاعات في الخزان). سد الخزان على كلا الجانبين مع الإكتفاءicient كمية من الفازلين قبل التحميل الخزان القادم.
8. كرر الخطوة 2.7، إلا هذه المرة باستخدام preincubated المتوسطة التي تحتوي على chemotactant مرشح. فمن الأهمية بمكان عند إنشاء تدرج لوني عبر الثقافة الجزيئية لتحميل دائما الخزان الذي يحتوي على جزيء لفحصها بعد تحميل الخزان تفتقر إلى جزيء اختبارها.
9. ضع دائرة زيجموند تحميل عند 37 درجة مئوية لمدة 1 لاحتضان ح قبل التصوير. صورة استقامة الحدود للثقافة NCC لمدة 3 ساعات على فترات 90 ق في حين يحتضنها في 37 ° C تقريبا (الشكل 2A، B). قبل إنشاء أي فيلم، تأكد من محاذاة الكاميرا بحيث يتم محاذاة حافة الصور التي يمكن الحصول عليها مع ولمس حافة الجسر الذي يقع على حدود الماضي محملة الخزان (الشكل 2B، اللوحة العليا؛ مربع متقطع يمثل المثالي موقف للتصوير). وسوف يسهل هذا البرنامج في وقت لاحق عن طريق توحيد التحليل يكون الاتجاه من التدرج الجزيئية التطبيقية والأنتجت المسافة ه من الخزان تم تصويرها في كل فيلم.
10. بالنسبة لعناصر التحكم، كرر الخطوات من 2،2-2،9 لكل من الثقافتين NCC مختارة أخرى (في الخطوة 2.1)، ولكن ملء الخزان مع كل وسيلة مناسبة. لنوع واحد من كل من الخزانات تحكم ملء مع preincubated المتوسطة لا تحتوي على جزيء لفحصها. لعلاج التحكم الثاني، رئيس والجسر مع بضع قطرات من preincubated المتوسطة التي تحتوي على المشتبه chemotactant قبل تركيب CS. ثم، تحميل كل الخزانات المتوسطة مع نفس تحتوي على chemotactant المشتبه بهم.
11. استخدام يماغيج (NIH) دليل تتبع (rsb.info.nih.gov / ط / الإضافات / مسار / track.html) والكيميائي والهجرة أداة V1.01 (www.ibidi.de / تطبيقات / ap_chemo.html) لتعقب الإضافات هجرة البلدان المساهمة الصافية الطرفية على طول الحدود مباشرة من ي الثقافةتصوير أوست والمعلمات لتحليل مختلف مسارات الهجرة التي تم الحصول عليها (الشكل 2B-C).

3. ممثل النتائج:

يظهر نموذج من مسارات خلية من الفيلم حيث كانت العديد من البلدان المساهمة الصافية الجذع استجابة لمرشح جاذب كيميائي باستخدام تقنية أعلاه (الشكل 2D). عرض معظم الخلايا في هذا المثال ردا إيجابيا من حركة ارتفاع صافي التدرج جاذب كيميائي (كما هو موضح باللون الأحمر). ويمكن استخدام البيانات لتحليل مسار الخصائص الأخرى للهجرة الخلية أيضا.

من أجل تقييم بصريا لتطبيق التدرج في غرفة زيجموند المعدلة، وفلور اليكسا 488 الغلوبولين المناعي المتقارن (MW 900 كيلو دالتون ~) تم تحميلها في الخزان الثاني من دائرة زيجموند معدلة (في نحو 40 ميكروغرام / مل H ₂ O). وأنشئ الانحدار بنسبة 1 ساعة وتزال موجودة إلى حد ما بعد 26 ساعة، ولكن تضاءلت إلى حد كبير بنسبة 50 ح (الشكل 3). إذا كان جزيء لفحصها أصغر، ثم التدرج التطبيقية وايسوف تتحلل بشكل أسرع من ما يتم عرضه.

الشكل 1. Explantation من الجذع على مستوى اليلة ليلة وضحاها على زراعة فبرونيكتين المغلفة coverslips. لأن الجذع البلدان المساهمة الصافية delaminate من NT الظهرية تقع في جوار somites 8-28، يتم عزل هذه الشريحة من NT من تسليخ مجهري ومثقف بين عشية وضحاها على CS فبرونيكتين المغلفة للسماح للهجرة من البلدان المساهمة الصافية يزدرع NT. هي الأنسب اليلة المعزولة التي هي بين 8-15 somites طويلة ومستقيمة نسبيا للزراعة بين عشية وضحاها لأنها تميل لانتاج الثقافات NCC مع الحدود يعد التوالي. وتظهر مناطق الأنبوب العصبي التي تؤدي إلى العصبية الأخرى المستويات المحورية في قمة أصغر الخط. ق، الجسيدة.

الشكل 2. أسلوب لتقييم هجرة البلدان المساهمة الصافية الجذع explantedباستخدام دائرة زيجموند المعدلة. ويتم اختيار (A) يتم إعداد مطول الجذع الثقافات NCC من زراعة ليلة وضحاها من NTS والثقافات الناتجة NCC مع واحد على الأقل الحدود الطويلة المستقيمة للتجريب. ثم يتم وضعه على التوالي وهي أطول حدود لثقافة المحددة عمودي على الحدود الجسر الخزان، وبالتالي موازية لمكافحة ناقلات التدرج في المستقبل تطبيقها. (B) بعد غرامة ضبط الموقف من الثقافة NCC على غرفة زيجموند وختم وساترة إلى الدائرة، يتم تحميل الغرفة. عند اختبار الكيميائي، والتي من شأنها أن الخزان لا يحتوي على المشتبه chemotactant - يتم تحميل الأولى ومختوم (). ثم، يتم تحميل خزان أخرى مع المشتبه chemotactant (+) ومختومة. يمكن البلدان المساهمة الصافية الطرفية على طول الحدود المحددة سابقا ثم يمكن تصوير وتعقب باستخدام البرنامج المساعد لتعقب دليل يماغيج (اللوحة السفلية). (C) خصائص عديدة المهاجرة استجابةويمكن تقييم لتطبيق التدرج استنادا إلى بيانات التتبع. على سبيل المثال، يمكن اشتقاق مؤشر الكيميائي عن طريق قسمة الإزاحة الخلية على طول المحور س من المسافة الإجمالية فقد تم ترحيلها. (D) يتم عرض مثال للاستجابة جاذبية عن طريق خلية مؤامرة مسار ولدت في البداية من قبل الانجذاب الكيميائي والهجرة البرنامج المساعد أداة ليماغيج. تم تعيين نقطة البداية لكل مسار إلى الأصل (0،0). نلاحظ كيف تهاجر الخلايا غيرها الكثير في اتجاه مركز جاذب كيميائي من source.The الشامل لجميع الخلايا في موقفهم النهائي (بلو كروس، وكل خلايا مرجحة على قدم المساواة) هو أيضا أقرب إلى مصدر جاذب كيميائي. البلدان المساهمة الصافية، والخلايا العصبية قمة؛ المسارات الأحمر، الخلايا التي هاجرت باتجاه خزان محملة يشتبه جاذب كيميائي؛ المسارات الأسود، والخلايا التي هاجرت بعيدا؛ (+)، وارتفاع تركيز chemotactant، (-)، وانخفاض تركيز chemotactant.

ملامح كثافة ز> الشكل 3. عبر الجسر من غرفة زيجموند تعديل في أوقات مختلفة بعد إضافة لالمتقارن فلور اليكسا الغلوبولين المناعي 488. تم تحميل الغرفة بطريقة مماثلة لتلك التي وصفها في بروتوكول مع الاستثناءات الرئيسية التي preincubated المياه (بدلا من preincubated المتوسطة) كان يستخدم لتخفيف الأجسام المضادة إلى 40 ميكروغرام / مل، وجيوب الهواء الصغيرة كانت موجودة في نهايات الجسر (بعيدا عن شريحة حيث كثافة التشكيلات أعلاه حيث اتخذت). في البداية، لم يكن الانحدار الحالي في معظم أنحاء الجسر. تأسست من قبل الانحدار هكتار 1 و لا تزال موجودة من خلال إلى 26 ساعة. وبنسبة 50 ح وجود التدرج لا يتفق في مناطق مختلفة من الجسر، وعندما تكون موجودة، تقلصت إلى حد كبير شدة الانحدار في التدرج. تم إنشاؤها من كافة ملفات تعريف شريحة مماثلة عبر الجسر (جسر من الحدود الخزان واحدة إلى أخرى) باستخدام AxioVision 4،6 البرمجيات. نلاحظ أنه في حين حتى الهواءوكانت جيوب الحاضر، لا تتأثر التدرج. عالية، وكثافة عالية، منخفضة، كثافة منخفضة؛ محور س، وبعد المسافة عبر كامل عرض الجسر (2 ملم)؛ (+)، خزان محملة فلور اليكسا المتقارن الغلوبولين المناعي 488، (-)، لم يتم تحميل مستودع مع المتقارن.

الشكل 4. التعديل المواصفات غرفة زيجموند. أظهرت هو رسم تخطيطي للغرفة زيجموند المعدلة المستخدمة هنا جنبا إلى جنب مع مواصفاتها الأبعاد (± 0.2 مم). يمكن تعديل قياسات معتدلة من أجل مطابقة التفضيلات الفردية.

بروتوكول الإضافي: التصنيع لإحدى دوائر المحكمة زيجموند معدلة

يرجى الرجوع إلى الشكل 4 كمرجع لبروتوكول أدناه:

1. شراء ورقة سميكة من الاكريليك 3/16 "مصقول (4.45 مم سماكة الفعلي).
2. باستخدام جدول رأى، قطع الفراغات غرفة كبيرة الحجم إلىأبعاد الخام من 33،25 مم × 64،57 ملم. هذا يسمح 3،175 مم للمواد اضافية بالقطع.
3. تعيين فارغة على غرفة بالعكس. مع آلة الطحن ومم 6.35 (1/4 ") نهاية بت طاحونة، والانتهاء من الآلات الجانبين من الغرفة لأبعادها بالضبط: 30.07 مم × 61،39 ملم.
4. وضع فارغة الغرفة على آلة طحن وتحديد موقع مركز فارغة على طول X على حد سواء ومحاور ذ مع مكتشف حافة، ثم الصفر موقع المركز.
5. الحصول على غرفة ارتفاع (Z-المحور) من خلال لمس بت طاحونة حد للالسطح العلوي وصفر في الارتفاع.
6. باستخدام مم 3.91 (0.154 ") نهاية بت طاحونة، ويقابل بت 3،03 مم على طول محور س (اتجاه إيجابي) لخزان الأولى. تبدأ بالقطع في غرفة على عمق 2،84 ملم بينما تتحرك على طول المحور ص (اتجاه إيجابي) إلى 7.62 ملم (0.300 ")، ثم تعبر إلى 7.62 ملم (0.300") في الاتجاه (سلبي) مقابل خزان كاملة طول 15،24 ملم (0.600 "). عوضبت إلى 3.03 مم (0.119 ") على طول محور س (اتجاه سلبي) وكرر نفس العملية للخزان الثاني.
7. وضع دائرة على حافته وحفر حفرة باستخدام مم 1.09 (0.043 بوصة) على قمة الحفر نهاية كل خزان (4 الكل) الذي يربط نهاية الخزان إلى جانب قاعة لتحميل المتوسطة خلال التجريب.
8. نقع في غرفة البئر بماء دافئ وصابون للمساعدة على إزالة أي ملوثات كيميائية.
9. نقع وشطف جيدا في غرفة مزدوجة الماء المقطر لإزالة أي الصابون. الدوائر هي الآن جاهزة للاستخدام كما هو موضح أعلاه.

Discussion

إجراء البحوث الكيميائي على البلدان المساهمة الصافية الجذع وقد ثبت تحديا لسلسلة من الأسباب. البلدان المساهمة الصافية الجذع تشكل الخلايا الجذعية غير المتجانسة التي من شأنها أن تفرق السكان إذا مثقف على المدى الطويل، وبالتالي، يجب الحصول على الجذع من البلدان المساهمة الصافية explantation الرئيسي للNT الجذع المستوى. الأساليب التقليدية لدراسة استجابة الانجذاب الكيميائي للخلية توزيع متجانس السكان في المختبر لاختبار من الصعب على البلدان المساهمة الصافية الجذع لأنها تحتاج أولا أن الخلايا المعزولة ومتجانس replated في غرفة الكيميائي (على سبيل المثال، غرفة بويدن ^12). يمكن عزل البلدان المساهمة الصافية يكفي أن تكون مملة ما قد يلزم من explantation العشرات من اليلة لإنشاء توزيع متجانسة من البلدان المساهمة الصافية الجذع كافية لتجربة واحدة حتى. بالإضافة إلى ذلك، لا يتم رفع البلدان المساهمة الصافية، ملون، وإعادة توزيع متجانس في سياقها الطبيعي. لذلك، قد البلدان المساهمة الصافية التي replated من أجل أداء بعض المقايسات الكيميائي التقليدي تتصرفبشكل مختلف تماما من الجسم الحي في ظروف في ما يخص السلوك المهاجرة.

هنا، نحن تصف تقنية تعديل لتقييم الجذع NCC الكيميائي في سياق أكثر طبيعية. ومن التحديات الرئيسية عند تقييم الاستجابة الانجذاب الكيميائي من البلدان المساهمة الصافية الجذع دون توزيع متجانس هو قطبية قوية المتأصلة في البلدان المساهمة الصافية في إطار الثقافة يزدرع الأصلي بالإضافة إلى هويتهم غير متجانسة الفطرية. على سبيل المثال، تميل البلدان المساهمة الصافية الجذع عمودي على الهجرة إلى حد كبير (بعيدا) من NT عندما تكون في الثقافة ^13. العوامل المختلفة التي يمكن أن تؤثر القطبية NCC الجذع في الثقافة يزدرع تكون قوية بحيث يصبح من الصعب تحديد قاطع التغيرات في الخلية القطبية الناجم عن الانحدار chemotactant. باستخدام مقايسة زيجموند الجديد المعدل من الممكن التمييز بين الاقطاب الخلية الطبيعية الملازمة ليزدرع الثقافات والتغيرات الناجمة عن الانحدار chemotactant، في حين رصد أيضا parame المهاجرة الأخرى النسب مثل استمرار والسرعة. وقد لاحظنا أن كل زاوية من الحدود ثقافة الجذع NCC explanted يواجه يحدد إلى حد كبير يكون الاتجاه المتأصلة في البلدان المساهمة الصافية الجذع الرائدة في تلك الحدود. على سبيل المثال، إذا كان من الحدود ثقافة NCC تواجه الشمال، ثم يكون الاتجاه متوسط ​​البلدان المساهمة الصافية من أن تكون الحدود الشمال. مقايسة لدينا تعديل يقلل التقلبات الناجمة عن اتجاهها الطبيعي في البلدان المساهمة الصافية الرائدة عن طريق توحيد زاوية الحدود NCC التي تهاجر نسبة إلى التدرج chemotactant تطبيق (الشكل 2A). عن طريق اختيار الرائدة البلدان المساهمة الصافية على الحدود مباشرة نسبيا من الجذع NCC الثقافة، وتحديد المواقع التي دائما الحدود NCC مستقيم عمودي على تطبيق التدرج، ومن ثم تتبع فقط هجرة الخلايا الرائدة على تلك الحدود، واحد هو قادرة على الكشف عن التحولات يكون الاتجاه في متوسط ​​البلدان المساهمة الصافية الجذع نحو أو بعيدا عن مصدر chemotactant التي كانت ستذهب لم يتم كشفها.

الأنف والحنجرة "> فيما يلي ملخص للمنافع المستمدة من العديد من البروتوكول أعلاه:

1. ويوفر القدرة على تتبع الحية الهجرة الخلية.
2. يمكن للغرفة زيجموند معدلة إنتاج المعرفة الانحدار نسبيا التي يمكن تصور مع جزيء نيون (الشكل 3).
3. غرف زيجموند تجنب بعض القيود على الفحص القياسية التي سبق وصفها بويدن من قبل الآخرين ^10،14.
4. ويمكن لدينا تعديل الدوائر زيجموند محلية الصنع بتكلفة منخفضة جدا (تقدر المواد في أقل من 1 دولار أمريكي لكل غرفة قابلة لإعادة الاستخدام).
5. لأن المثقف أنابيب العصبية على coverslips ومختومة في وقت لاحق مع الفازلين، يمكن للمرء أن يختار بسهولة التوجه للثقافة بالنسبة إلى التدرج في المستقبل تطبيقها.
6. غير مطلوب Trypsinization أو تجريف الخلية.
7. فقط كمية صغيرة من العزلة NT ضرورية.
8. ثقافة NCC هو أكثر مماثلة لتوزيع البلدان المساهمة الصافية الجذع وجدت في الجسم الحي من خلايا عندماويتم رفع replated مع توزيع متجانس.

وهذه المزايا تنطبق أيضا عرضة للثقافات مماثلة يزدرع الأولية من أنواع الخلايا الأخرى، وبالتالي، فإن هذا النهج قد يكون أوسع مدى الرغبة للاستخدام في تقييم سلوك المهاجرة الطبيعي للخلايا جذعية أخرى explanted.

على الرغم من أن المزايا التي تتمتع بها مقايسة معدلة غرفة زيجموند كثيرة، لديها بعض القيود. وقد تم بالفعل بعض العيوب للغرفة القياسية التي ناقشها زيجموند الباحثين الماضية ^14. واحد الحد من الفحص لدينا زيجموند تعديل هو استخدام الفازلين لتركيب CS ويسد كل ثقب خزان. الفازلين يسمح احد المرونة اللازمة لتوجيه ثقافة بالضبط NCC نسبة إلى التدرج chemotactant، ولكن يؤدي إلى التباين في المسافة بين CS والجسر الذي يمكن أن يسبب تغير في الانحدار تطبيق ^14. بالإضافة إلى ذلك، تركيبوختم CS الدائرة مع الفازلين الفخاخ في كثير من الأحيان جيوب صغيرة من الهواء في الدائرة التي يمكن أن تؤدي إلى ضغط كميات صغيرة من تدفق عبر الجسر ^14. يمكن تعطيل تدفق هذه يحتمل التدرج الجزيئية خلال بعض التجارب، وتؤدي إلى زيادة التقلبات في النتائج واحدة. في حين أن هذا أمر ممكن، لم يكن لوحظ تعطل شديد الانحدار عند تصور باستخدام فلور اليكسا 488 الغلوبولين المناعي المتقارن (الشكل 3)، حتى في الوقت الذي كانت موجودة جيوب الهواء نحو نهايات الجسر (بعيدا عن المنطقة التي تم قياس كثافة الفلورية) . لذلك، حتى في ظل الظروف التي يمكن أن تعطل يحتمل أن فلور اليكسا التدرج الغلوبولين المناعي 488، وعدم المساس التدرج في منطقة جسر قياس (أقرب إلى منتصف الجسر). إذا كان أحد يحتاج إلى التدرج على المدى الطويل على حد سواء درجة عالية من الاستقرار ويمكن التنبؤ بها، فإن هذا الفحص لا يكفي المحتمل. ومع ذلك، في كثير من الأحيان مثل هذه الدقة غير مطلوبة وبالمقارنة مع بعض الدول الاخرىالمقايسات الكيميائي المشتركة (مثل فحوصات أو فحوصات معينة بويدن باستخدام chemotactant غارقة في الخرز)، والتدرج من المرجح أن يكون أكثر استقرارا وقابلية للتنبؤ.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Omega Scientific	DM-22
Penicillin Streptomycin Solution	Omega Scientific	PS-20	100X Stock Concentration
L-Glutamine	Omega Scientific	GS-60	100X Stock Concentration
Fetal Bovine Serum	Omega Scientific	FB-11	Lot# 105247 (or another that is comparable)
Modified Zigmond chamber	Home made	N/A	Reservoir volume: ~ 160 μl ea; for additional specifications, see Fig. 4 and the supplemental fabrication protocol
Cell culture dish	Denville	T6040	40 x 10 mm
Fibronectin	BD	354008	10X Stock prepped by diluting 1 mg FN in 1 ml H2O and 9 ml DMEM
Coverslips	Fisher	12-548-B	Precleaned; 22 x 22 mm
L15 medium	Thermo Scientific	SH30525.02
Petroleum Jelly	Comforts	011110794642	100%
Centrifuge tube	Biologix	10-9152	15 ml
Dispase	Cell Systems	4Z0-850	10X Stock Concentration
Syringe	BD	309602	1 ml
Needle	BD	305127	25 G x 1.5 in.
Alexa Fluor 488-IgM	Invitrogen	A21042	Stock is 2 mg/ml; 7 moles dye/mole IgM
Dissecting Forceps	FST	Misc.	Dumont #5 or 55; straight tipped; stainless steel or titanium
Tungsten Needle	N/A	N/A	Home made; placed in a pin holder
Blunt Forceps	Tiemann	160-18	Used for transferring embryos to Ringer's from egg yolk
Supplemental Protocol: Fabrication of a Modified Zigmond Chamber
Please refer to Figure 4 as a reference for the protocol below:
Purchase a sheet of 3/16" thick polished acrylic (4.45 mm actual thickness). Using a table saw, cut chamber blanks oversized to the rough dimensions of 33.25 mm x 64.57 mm. This allows 3.175 mm extra material for machining. Set the chamber blank on a vise. With a milling machine and a 6.35 mm (1/4") end mill bit, finish machining the sides of the chamber to their exact dimensions: 30.07 mm x 61.39 mm. Position the chamber blank on the milling machine and locate the center of the blank along both the x and y axes with an edge finder; then zero the center location. Acquire the chamber height (z-axis) by touching the end mill bit to the top surface and zero the height. Using a 3.91 mm (0.154") end mill bit, offset the bit 3.03 mm along the x-axis (positive direction) for the first reservoir. Begin machining into the chamber to a depth of 2.84 mm while moving along the y-axis (positive direction) to 7.62 mm (0.300") and then traverse to 7.62 mm (0.300") in the opposite (negative) direction to a complete reservoir length of 15.24 mm (0.600"). Offset the bit to 3.03 mm (0.119") along the x-axis (negative direction) and repeat the same process for the second reservoir. Position the chamber on its edge and drill a hole using a 1.09 mm (0.043 in.) drill bit on the end of each reservoir (4 total) that connects the end of the reservoir to the side of the chamber for loading medium during experimentation. Soak the chamber well in warm soapy water to help remove any chemical contaminants. Soak and rinse the chamber well in double-distilled water to remove any soap. The chambers are now ready to use as described above.