Summary
이 문서는 생쥐의 후각 망울의 표면에지도 냄새 evoked 활동에 고유 광 신호와 flavoproteins autofluorescence 신호 이미징의 프로토콜을 제공합니다.
Abstract
두뇌에 감각 자극은 자극의 코딩에 참여 기능 모듈 간의 뉴런의 인구를 분산 활성화됩니다. 기능성 광학 이미징 기술은 높은 공간 해상도를 가진 감각 cortices에서 이러한 모듈의 활성화를 시각화에 유리하고 있습니다. 이러한 맥락에서, neuroenergetics에 연결된 분자 메커니즘에서 발생하는 내생 광학 신호는 쥐 두뇌에서 다양한 분야를 통해 감각 자극의 공간적지도를 기록하는 대조의 귀중한 자원입니다.
여기, 우리는 활성화하는 동안 뇌 조직의 내생 광학 특성의 변화에 따라 두 가지 기술을 제시한다. 먼저 내장 광학 신호 (IOS)는로 인해 붉은 빛의 반사율에 지역 변경에 의해 생산 (I) 흡수 혈액 산소 수준과 혈액 볼륨 (2) 광자 산란의 변화에 의해. 공간지도를 기록하는 생체내 IOS에의 사용은 1980 년대 중반 observati으로 시작고양이 시각 피질 1 쥐, 오리 엔테이션 열에 수염 배럴의 광학적지도에. odorants에 대응 설치류 주요 후각 망울 (OB)의 표면 IOS 이미징은 나중에 래리 카츠의 그룹 2로 입증되었다. 두 번째 접근 방식은 다음과 mitochondrial 신진 대사 중간체의 산화 환원 상태의 변화로 인해 flavoprotein autofluorescence 신호 (FAS)에 의존합니다. 더 정확하게, 기술은 조직이 푸른 불빛과 함께 기쁘게 생각합니다 flavoproteins의 산화 상태로 인해 녹색 형광을 기반으로합니다. 이러한 신호가 Britton의 기회와 동료 3의 선구자 연구에서 뇌 활동의 연구에 대해 기록된 최초의 형광 분자 간의 아마도했지만, 그것은 그들이 생체내 뇌 활성화의 매핑에 사용되는 것으로 최근까지되지 않았습니다. FAS 이미징 먼저 Katsuei Shibuki의 그룹 4로 hindpaw의 자극에 대한 응답으로 설치류의 somatosensory 피질에 적용되었다.
그것은 환경에서 화학 물질의 효율적인 탐지 및 식별 (음식, 육식)을 수 있기 때문에 후각 시스템은 살아있는 인류의 대다수의 생존을위한 중앙 중요하다. OB는 두뇌의 후각 정보 처리의 첫 번째 릴레이입니다. 그것은 휘발성 odorant 분자를 감지 후각 감각 뉴런에서 주 수입 성의 전망을받습니다. 각각의 감각 신경 세포가 ~ 100μm 3 같은 잘 정의된 microregions 자신의 신경 프로세스를 보내는 수용체의 동일한 유형을 가지고 odorant 수용체와 신경의 한 유형 이산 neuropil, 후각 glomerulus (그림 1)의 형성을 표현합니다. 지난 10 년, IOS 영상은 가장 공부 감각 구조 중 하나가 가지고있는 OB 5, 6, 7의 기능 탐사를 육성하고 있습니다. FAS 이미지와 OB 활동의 매핑은 아직 수행되지 않았습니다.
여기, WE 마우스 OB에서 냄새 evoked 활동을지도하기 위해 IOS와 FAS 이미징을위한 효율적인 프로토콜의 연속 단계를 보여줍니다.
Protocol
1. (실험 동물의 관리 및 사용에 대한 유럽의 권고에 따라, 86/609/EEC 지시문) 이미징을위한 동물 준비
- 6~8주 오래된 C57BL6 남성 쥐들이 intraperitonealy 주입 케타민을 (10mg/kg)과 xylazine (100mg/kg)의 칵테일과 함께 anesthetized 있습니다. 마우스가 더 이상 핀치를 hindpaw에 응답 없을 때 수술이 시작됩니다. 전체 실험 기간 동안 동물은 가열 패드에 배치됩니다. 체온이 지속적으로 모니터 37에서 관리하고 있습니다 ° C. 마취의 심도는 사지의 부재 철회를 확인하여 수술 및 이미징 세션을 통해 유지됩니다. 초기 마취 칵테일의 20 %의 피하 주사가 다르게 관리됩니다.
- 가위를 사용하여 두피에서 머리카락을 제거합니다. 식염수에 담가 멸균 거즈를 사용하여 잔류 머리에서 노출된 피부를 청소합니다.
- stereotaxic 프레임에서 마우스를 놓으십시오. 주둥이는 머리의 뒤쪽과 같은 비행기에한다수평으로 후각 망울의 표면을 설정하기 위해서. 이미징하는 동안 움직임을 방지하기 위해 단단히 귀 및 코 막대를 고정합니다.
- 건조하고 고통을 방지하기 위해 동물의 눈에 안과 연고를 적용합니다.
- 70 °의 에탄올과 betadine의 연속 감시 장치로 두피 지역 모든 수술기구를 소독.
- 두개골을 덮고있는 피부를 제거하려면 귀 사이 머리의 뒤쪽에서 가위로 피부에 절개를하여 시작합니다. 그런 다음 귀의 기본 방향과 눈꺼풀을 따라 이마쪽으로 anteroposterior 방향으로 양쪽에서 했네요. 코 표시줄에 가까운 주둥이 위에 피부를 절단하여 두피를 제거 완료.
- 쌍안경 관측에서 부드럽게 두개골의 상단에있는 골막을 분리하기 위해 식염수에 담가 면봉을 사용합니다. 나머지 조직을 제거하고 깨끗한 준비를 위해 메스로 두개골의 표면을 긁어 포셉 한 쌍의을 사용합니다.
- OB는 눈꺼풀 사이에 위치 두 hemibulbs 구성된 대칭 구조입니다. 그들은 정맥 부비동 (副 鼻 洞)에 의해 주동이의와 꼬리 방향으로 제한하고, 화살 봉합사로 구분됩니다. OB 위의 뼈에 증류수로 적셔 흡수성 젤라틴 스폰지 조각을 넣으십시오. 실험에 걸쳐이 골 지역 촉촉한 유지하는 것이 중요합니다.
2. 두개골 창문을 준비
- 젤라틴 스폰지를 제거하고 부드럽게 N ° 10 메스 블레이드와 뼈 근근이 살아가고으로 시작합니다. 칼날과 뼈 사이에 45 °의 일정한 각도를 유지하고 눈꺼풀의 전구 지역의 화살쪽으로 칼날을 이동합니다. 뼈에 수직 압력을 적용하거나 정맥 구멍 위에있는 뼈 긁지 마라.
- 숱이없는 과정마다 5 분을 중지하고 준비를 진정 뼈에 수산화 젤라틴 스폰지를 넣으시기 바랍니다. 면봉 뼈 먼지를 제거하는 스펀지와 두개골.
- 전면 유지하고trabeculae, 해면 뼈 계층을 시각까지 또는 냉각. OB의 훌륭한 vasculature는이 단계에서 표시되어야합니다. 뼈를 긁적 중지하고, OB를 둘러싸고 사각형 영역을 "그리는"로 수직 메스의 팁을 사용하여 시작합니다. 이 단계에서 N ° 11 메스 블레이드를 사용할 수 있습니다. 모든 메스 뇌졸중의 안전한되어야 정맥 sinuses의 한계 내에서 수술을 보관하십시오.
- 메스의 연속 동작을 사용하여 점진적으로 형성된 사각형 참호를 파다. 그것을 깨끗하게하고 날카로운 유지하기 주기적으로 메스의 끝부분을 닦아주십시오. 경질 표면을 만져 피하기 위해 팁의 깊이주의 추가한다.
- 남아있는 뼈의 두께의 감각을 얻기 위해서, 포셉의 쌍 끝에 조심스럽게 밀어. 압력 아래에있는 뼈 플랩 폴드 경우, 다음 단계로 이동합니다.
- 염분의 드롭에서 뼈 플랩을 세운 가로 메스 지향의 팁을 사용합니다. 플랩의 제거는 C를 할 수있다arefully 남은 뼈를 떼어 줘야하지 않도록합니다.
- OB의 표면이 노출되면 어떤 출혈이나 혈관 교합 (anastomosis)의 부재를 확인합니다. 경질 또는 조직 표면을 손상하는 광학 신호를 얻기의 기회를 줄일 수 있습니다. 전구의 촉촉한을 유지하기 위해 식염수에 담가 젤라틴 스폰지와 지역을 닦아주십시오.
- 창 주위 골에 우물을 형성 폴리 아크릴 산 치과 시멘트를 적용합니다.
- 경질을 통해 낮은 용융 점 아가로 오스 (1.2 %)의 드롭를 삽입하고, 윈도우의 크기에서 멸균 덮개 유리를 넣어. 이미징 세션 동안, 아가로 오스의 작은 수량은 탈수를 보상하기 위해 추가할 수 있습니다. 아가로 오스는 호흡과 함께 이동에서 OB를 방지하고 광학 이미징을위한 평평한 표면을 제공합니다.
3. 후각 활동 매핑을위한 광학 이미징 설정
- 후각 자극은 정확하게 olfactometer를 사용하여 시간과 강도에 정의된되어야합니다. 우리는 기본적인 공기 압축기 (압축 숨쉴만한 공기는 물론 적절한 것입니다)과 관련된 자동화 과학에서 multivial 재관류 시스템 Valvebank 8II의 사용자 지정 수정된 버전을 사용합니다. 이 시스템은 정확하고 빠른 외부 밸브 제어를 허용합니다. 순수 odorant의 솔루션은 선택한 농도의 미네랄 오일에 희석 수 있습니다. 같은 hexanal로 지느러미 OB aldehydes을 활성화하기 위해 일반적으로 사용됩니다. 희석 odorant (20 50μl)의 정확한 볼륨 필터 종이에로드되고 주사기의 저수지에 배치됩니다. 재관류 시스템을 통해, 압력 제어 공기 밸브 오프닝 기간 동안 동물의 코를 odorized 공기 유량 전달의 지속적인 속도를 보장 시스템에 전달됩니다. Odorant는 ~ 1000ml/min의 흐름 속도로 공기를 운반 Tygon R - 3603 진공 튜브 (세인트 - Gobain 주식 회사)를 통해 제공됩니다. 튜브에 odorants와 odorant의 잔여 수량 사이의 오염을 피한다. 가능한 경우, odorant의 자극의 재현성은 contro 수 있습니다불꽃 이온화 검출기의 사용 (microFID 2020 Photovac)를 통해 lled.
- 광학 설정은 켜져 있습니다. 그것은 이루어진 인터 레이스 냉각 12 비트 형광 stereomicroscope (Leica MZ16), 컴퓨터 제어 olfactometer 적절한 밴드 패스 간섭 필터 안정화 여기 램프와 연결된 CCD 카메라 (오카 하마 마츠 AG). 우리의 설정을 설명하는 방식은 그림 2에 제공됩니다. 내장 광학 신호 이미징 (IOSI), 섬유 링 라이트 (SCHOTT)과 함께 200W 텅스텐 할로겐 램프 (출창 QTH)은도 안정적이고 조명을 제공하는 데 사용되는 현미경 목표 주변에 연결. Flavoprotein Autofluorescence 신호 이미징 (FASI), 5mm 핵심 액체 라이트 가이드와 150W 금속 할로겐화물 램프 (Leica)는 stereomicroscope의 에피 조명 포트를 통해 형광도화된 여기를 제공하십시오.
이미지 수집 및 하드웨어 동기화는 사용자 지정 소프트웨어에 의해 실현됩니다. 오픈의ource 소프트웨어는 또한 마이크로 광학 설치 및 수집을 제어하는 데 사용할 수 있습니다.
4. 광학 이미징
- stereomicroscope 아래 stereotaxic 프레임 (그림을 참조하십시오. 광학 설치의 구조에 대한 2A)보기의 분야에서 중심 두개골 윈도우를 놓습니다.
- 모세 혈관에 초점 현미경을 조정. 이전 자극 실험으로 (5 설명 참조) 전구의 이미지는 혈관 이미징을위한 좋은 대조를 제공 560nm (녹색) 라이트 (광섬유 링) 아래 이루어집니다. 이 사진은 준비의 상태를 확인하는 해부학 제어로 사용하고 실험하는 동안 여러 번 획득합니다.
- IOS 이미지 들면, 빛의 강도는 630 + / -10 NM (빨간색) 조명 아래의 CCD 카메라로 기록됩니다 반영됩니다. 이미지가 150ms 정도의 노출 시간에 해당하는 초당 5 프레임의 풀 프레임 (NO binning)에 인수하고 있습니다. 광원의 전원이 다시 조정됩니다 가까운 픽셀 CCD 우물의 채도에 OB 지역에 적어도 ~ 3000의 ACH 회색 수준. 이렇게하면 인증 기간 동안 희미한 강도 변화를 포착하는 CCD의 12bits 역학을 활용하는 것이 가능합니다. 최대 IOS amplitudes에 도달 ~ 1 %.
- FAS 이미징 형광 들어 480nm의 여기 + / - 20nm (파란색) epiflurorescence 조명에 따라 취득됩니다. 515nm의 높은 패스 필터는 빛을 포착하도록 설정되어 있습니다. 이미지 감도를 극대화 4로 4 binning와 초당 5 프레임에서 찾았습니다. 여기 라이트 전원은 OB 지역에있는 3000의 회색 수준 IOS와 비슷하게 조정됩니다. 최대 FAS amplitudes는 ~ 3 %에 도달.
두 이미징 modalities 들어, 제목 비행기에서 필드의 깊이는 동일하며 약 4 시간의 확대를위한 0.5 mm에서 측정되었다.
- 라이트는 가열과 준비 photobleaching 피하기 위해 이미징 실험 사이에서 해제해야합니다.
- 표준 영상 세션은 공기가 전달 10 초 5의 기준을 포함, 추가로 기준 복구를 위해 지속적인 공기 흐름 (그림과 함께 기록 선택한 악취 농도, 70 82s에 따라 10 초 3에 대한 악취 자극에 의해 다음 2A). 재판 끝에 빛이 꺼져 있고 순수한 공기가 잔류 냄새 분자를 씻고 감각 요법 이니을 피하기 위해 (1 3 분 소요) 간 시험 간격 기간 동안 제공됩니다. 악취 시련은 빈 실험 (공기 공급)와 인터리빙된되었습니다.
- 냄새 evoked 활성 영역은지도에 대략 구형 영역으로 시각되며 개별 glomeruli (직경 9 80 200μm)의 크기에 해당한다. 영상 처리는 그림 2B에서 설명합니다. 후각지도를 그림 3에 제공됩니다. 다른 감각 시스템에 반대로, OB의 신호 대 잡음 비율 (싱글 시련의 냄새 evoked 답변을 해결하기 위해 충분한되었습니다그림. IOS와 그림에 대한 3B. FAS를위한 3D).
- 마우스는 실험실 동물 관리 및 사용에 대한 유럽의 권장 사항에 따라 방법을 사용하여 영상 세션이 끝날 때 즉시 euthanized있다.
6. 대표 결과 (그림 3 후각지도 참조) :
설치류의 주요 후각 망울의 1 구조 조직을 그림. 후각 감각 뉴런, 메인 후각 상피에있는 기본 감각 세포가 같은 odorant 수용체를 표현하고 OB에서 동일한 glomeruli에 수렴. 후각 glomeruli, 둥근 모양의 neuropils는 (점선 원), OB의 표면에 위치하고 있습니다. 아주 밀도가 높으며 복잡한 혈관 네트워크가 사구체 수준에서 존재합니다. 약어 (위 / 아래) : ONL : 후각 신경 층, GL : 사구체 층, EPL : 외부 plexiform 층, MCL :승모판 세포 층, GCL : 과립 세포 계층.
그림 2 반사율과 생체내에 기록 형광 신호. A. 넓은 필드 광학 이미징 설정. anesthetized 마우스의 두뇌는 광학 렌즈 또는 현미경의 에피 조명 포트에 연결된 두 환상 섬유 링을 통해 빨간색 (IOS) 또는 파란색 (FAS) 조명 하나에 노출됩니다. 냄새는 밀폐 유리병에로드하고 odorized 공기는 동물 코로 전달된다 (녹색 표시등 : 개방 밸브). B. 녹음 프로토콜과 데이터 처리. IOS와 FAS은 개별 시험의 시리즈 (기간의 90 년대)로 기록됩니다. 그림은 하나의 재판 일정을 보여줍니다 : 기준 5에서 10 초, 10 초 3으로 자극하고, 70 82s으로 기준으로 돌아가 다릅니다. 이미지 처리 자극의 기간 동안 강도 값 기준 중 강도 값의 픽셀별로 픽셀 뺄셈 (FAS)을 O가 필요합니다R의 자극 기준 플러스로 돌아갑니다 (IOS에 대해). 이 차이는 다음 (그림의 결과 이미지를 참조하십시오. 3) %의 편차를 구하는 기준 가치로 나눈 값입니다.
그림 3 냄새 evoked IOS와 FAS 이미징을 사용하여 OB의 활동지도. 지느러미 OB의 A. Vasculature 녹색 불빛 아래에서 시각. BC. 20 % hexanal의 10 초 프레 젠 테이션을위한 IOS 몇 군데 (각각 세 평균 시험 대비 단일 재판). 흰색 화살표는이 냄새에 의해 활성화된 관심의 구형 영역을 나타냅니다. 이러한 활성지도 프레임 (B A와 -0.52 %의 반사율의 변화 -0.63 %의 최대) 냄새 자극의 끝에 후 첫 초 동안 평균 사용 얻은했습니다. 냄새 활성화가 발생했습니다 흡광도의 블랙 영역을 확인합니다. CD. FAS는 (세명 평균 시련 각 대 한 재판 같은 odorant에 대해 동일한 마우스에 순차적으로 인수니). 이러한 활성지도 프레임 (형광 변화 D에 0.72 %와 0.66 % E에서 최대) 냄새 자극의 시작 후 첫 초 동안 평균 사용 취득했다. 검정색 화살표로 표시 autofluorescence 방출의 흰색 영역은 IOS의 검은 영역에 해당합니다. FAS지도에서 본 입자 측면은 감도의 향상에 필요한 4 binning으로 4 때문입니다. FAS 이미지는 autofluorescence은 표백에서 수정되지 않았습니다. 이미지의 실제 크기는 : 0.7 mm (폭) x 1.2 mm 길이.
Discussion
이 문서에서 우리는 마우스 OB에서 냄새 evoked 활동의 생체내 레코딩에 대한 IOS와 FAS 이미징 기술을 제시한다. 이 목표를 달성하기 위해 비교적 간단하고 저렴 넓은 필드 광학 영상 설정이 필요합니다. 이미지 데이터의 수집은 미세 수술 절차를 수행하고 경질이나 뇌 조직에 어떤 부상을 피하기 위해 훈련이 필요합니다. 특히, 주요 출혈이 영상에 대해 기록된 광자를 흡수 실험을 종료합니다.
IOS와 FAS 이미지 중 하나는 혜택은 세포 독성 또는 바람직하지 않은 부작용을 초래할 수있는 형광 추적기의 주입을 방지하는 것입니다. 그들은 가능한 후각지도 감각 자극의 공간적 따라서 코딩에 대한 문제를 해결하기 위해합니다. 2 DeoxyGlucose 이미징 반대로, 그들은 하나의 동물에 이미지 몇 냄새로 가능성을 제공합니다. 광자 침투가 조직에 제한되기 때문에하지만, IOS와 FAS는 OB의 지느러미 부분에 제한됩니다그리고 복부 지역에서 기록하실 수 없습니다.
내생 광학 신호 이미징은 생체내 이미징의 우수한 공간 해상도를 제공합니다. 반사율의 혈관 부품의 기술 향상에 관심 정량 계산 감각 활성화 10시 8,9뿐만 아니라 혈액 산소와 볼륨의 역학을 신호. IOS 이미지 방식의 Multiwavelength 이미징은 현재 완전히 감각 활성화하는 동안 OB 총 헤모글로빈 농도와 산소를 정할 저희 연구실에서 개발된 있습니다. FAS 이미지에 추가이 spectroscopic 광학 측정 감각 활성화 11,12 중에 혈관과 세포 역학 사이의 미해결 관계를 응답 수있는 기회를 제공합니다.
Disclosures
우리는 공개 아무것도 없어.
Acknowledgments
이 작품은 "회사 직원 Nationale 드 라 공들인"부여 ANR - 09 - JCJC - 0117-01와 로맹 Chery에 대해 "Neuropôle 드 공들인 Francilien - NERF"부여합니다. 지원했습니다 우리는 C + + / Qt는에있는 소프트웨어 개발을위한 프랑소의 Lefebvre 감사 및 광학 이미징 설정의 개발에 도움 로랑 피노와 얇은 평직의 무명 안토니오.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Imalgene | Merial | ||
| Rompun | Bayer AG | ||
| Agarose, type III-A | Sigma-Aldrich | A9793-50G | |
| Hexanal 98% | Aldrich | 115606-100ML |
References
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