Imaging Lukt-evoked Aktiviteter i Mus luktelappen bruker optisk Refleksjon og Autofluorescence Signaler

Summary

Denne artikkelen presenterer protokollene av iboende optiske signaler og flavoproteins autofluorescence signaler avbildning for å kartlegge lukt-evoked aktiviteter på overflaten av luktelappen hos mus.

Abstract

I hjernen, aktiverer sensorisk stimulering distribuert populasjoner av nerveceller blant funksjonelle moduler som deltar til koding av stimulus. Funksjonell optiske avbildning teknikker er en fordel å visualisere aktivering av disse modulene i sensoriske cortices med høy romlig oppløsning. I denne sammenheng endogene optiske signaler som oppstår fra molekylære mekanismer knyttet til neuroenergetics er verdifulle kilder til kontrast til rekord romlig kart sensoriske stimuli over et vidt felt i gnager hjernen.

Her presenterer vi to teknikker basert på endringer av endogen optiske egenskapene av hjernevev under aktiveringen. Først den iboende optiske signaler (IOS) er produsert av en lokal endring i rødt lysrefleksjon skyldes: (i) absorpsjon av endringer i oksygentilførsel i blodet nivå og blodvolum (ii) foton spredning. Bruken av in vivo IOS å registrere romlig kartene startet på midten av 1980-tallet med observatipå av optiske kart over værhår fat i rotte og orientering kolonnene i cat visuelle cortex ^1. IOS avbildning av overflaten av gnager viktigste luktelappen (OB) som svar på odorants senere ble demonstrert av Larry Katz gruppe ^2. Den andre tilnærmingen baserer seg på flavoprotein autofluorescence signaler (FAS) som følge av endringer i redoks staten disse mitochondrial metabolske mellomprodukter. Mer presist er teknikken basert på grønn fluorescens grunn oksidert tilstand flavoproteins når vevet er spent med blått lys. Selv om slike signaler var trolig blant de første fluorescerende molekyler registrert for studiet av hjernens aktivitet ved pioner studier av Britton Sjansene og kolleger ^3, var det ikke før nylig at de har blitt brukt til kartlegging av hjerneaktivitet in vivo. FAS bildebehandling ble først brukt på somatosensoriske cortex i gnagere som svar på hindpaw stimulering av Katsuei Shibuki gruppe ^fire.

Den luktsystemet er av sentral betydning for overlevelsen av de aller fleste levende arter fordi den tillater effektiv påvisning og identifikasjon av kjemiske stoffer i miljøet (mat, predatorer). OB er den første stafetten i olfactory informasjonsbehandling i hjernen. Den mottar afferent anslag fra olfactory primære sensoriske nevroner som oppdager flyktige odorant molekyler. Hver sensorisk neuron uttrykker bare én type odorant reseptor og nevroner bærer samme type reseptor sende sine nerve prosesser til samme veldefinerte microregions av ~ 100μm ^tre konstitueres av diskrete neuropil, den olfactory glomerulus (Fig. 1). I det siste tiåret har IOS bildebehandling fostret den funksjonelle utforskning av de ^{5 OB, 6, 7} som har blitt en av de mest studerte sensoriske strukturer. Kartleggingen av OB aktivitet med FAS bildebehandling er ikke utført ennå.

Her we viser de påfølgende trinnene i en effektiv protokoll for IOS og FAS bildebehandling for å kartlegge lukt-evoked aktiviteter i musen OB.

Protocol

1. Forberedelse dyret for imaging (i samsvar med europeiske anbefalinger for behandling og bruk av forsøksdyr, 86/609/EØF direktivet)

1. 6 til 8 uker gammel C57BL6 hannmus er bedøvet med en cocktail av ketamin (10mg/kg) og xylazin (100mg/kg) injisert intraperitonealy. Kirurgi begynner når musen reagerer ikke lenger hindpaw klype. Under hele eksperimentet dyret er plassert på en oppvarming pad. Kroppstemperatur er kontinuerlig overvåkes og vedlikeholdes ved 37 ° C. Anestesidybden opprettholdes gjennom kirurgi og bildebehandling økten ved å sjekke ut fraværet av lem trekke seg. En subkutan injeksjon av 20% av den opprinnelige bedøvelse cocktail ellers administreres.
2. Bruk clippers, fjerne hår fra hodebunnen. Rens eksponert hud fra gjenværende håret ved hjelp av steril kompress dynket med saltvann.
3. Plasser musen i stereotaxic rammen. Den snute må være i samme plan som baksiden av hodet,For å sette overflaten av luktelappen til den horisontale. Sikre fast i øret og nese barer for å hindre bevegelser i imaging.
4. Påfør oftalmiske salve på dyrets øyne for å hindre uttørking og smerte.
5. Desinfisere alle kirurgiske instrumenter med 70 ° etanol og hodebunnen området med påfølgende sweeps av betadine.
6. For å fjerne huden som dekker kraniet, start ved å gjøre et snitt i huden med saks på baksiden av hodet mellom ørene. Så kuttet i begge sider mot basen av øret og i anteroposterior retning mot pannen langs øyelokkene. Finish fjerne hodebunnen ved å skjære huden på toppen av snuten nær nesa bar.
7. Under kikkerter observasjon, bruk en bomullspinne fuktet med saltvann for å forsiktig løsne periosteum på toppen av skallen. Bruk en pinsett til å fjerne de gjenværende vev og skrape overflaten av skallen med en skalpell til å ha en ren forberedelse.
8. OB er en symmetrisk struktur består av to hemibulbs som er plassert mellom øyelokkene. De er begrenset i rostral og i caudal retning av en venøs sinus, og atskilt av sagittal suturen. Plasser et stykke av absorberbare gelatin svamp fuktet med destillert vann på beinet over OB. Det er viktig å holde dette benet området fuktig gjennom hele forsøket.

2. Klargjøre cranial vinduet

1. Fjern gelatin svampen og starte med å forsiktig skrape beinet med n ° 10 skalpell blad. Hold en konstant vinkel på 45 ° mellom bladet og bein, og flytte bladet fra øyelokk til sagittal siden av pære området. Ikke legg vertikale press på beinet eller klore beinet over venøse sinus.
2. Under tynning prosessen stoppe hvert 5min og plassere en hydrert gelatin svamp på beinet for å kjøle ned forberedelse. Vattpinne skallen med svamp til å fjerne bein støv.
3. Hold feiing ogkjøling alternativt inntil visualisere trabeculae, spongy bein laget. Den fine blodkar av OB må være synlige på dette stadiet. Stopp skrape bein, og begynner å bruke skalpell i spissen vinkelrett å "tegne" et rektangulært område omslutter OB. På dette stadiet n ° 11 skalpell blad kan brukes. Hold kirurgi innenfor grensene av den venøse bihulene som bør være trygt av noen skalpell slag.
4. Dig gradvis dannet rektangulære grøften ved å bruke suksessive bevegelser av skalpell. Tørk tuppen av skalpell jevne mellomrom for å rense den og holde den skarp. Vær ekstra forsiktig av dybden i spissen for å unngå å berøre dura overflaten.
5. For å få en følelse av tykkelsen på gjenværende bein, skyv den forsiktig med spissen av en pinsett. Hvis benet klaff folder under press, gå til neste trinn.
6. Under en dråpe saltvann, bruk tuppen av skalpell orientert horisontalt for å løfte opp bein klaff. Fjerning av klaffen må gjøres carefully å unngå å rive av de resterende bein.
7. Når OB overflate er utsatt, sjekk for fraværet av blødninger eller blodårer anastomose. Skade dura eller vevet overflaten vil redusere sjansene for å skaffe optiske signaler. Tørk området med en gelatin svamp dyppet i saltvann for å holde pæren fuktig.
8. Påfør polyacrylate dental sement for å danne en brønn på beinet rundt vinduet.
9. Legg en dråpe lavt smeltepunkt agarose (1,2%) over dura, og legg en steril cover glass på dimensjonene av vinduet. Under bildebehandling økten, kan en liten mengde agarose legges for å kompensere for uttørking. Agarose vil hindre at OB fra å flytte med åndedrett og vil gi et flatt underlag for optisk avbildning.

3. Optisk avbildning oppsett for olfactory aktivitet kartlegging

1. Den olfactory stimulering må være presist definert i tid og intensitet ved bruk av en olfactometer. Vi bruker en tilpasset modifisert versjon av multivial perfusjons system Valvebank 8II fra Automatiser Scientific forbundet med en grunnleggende luftkompressor (komprimert pusteluft ville være egnet som tillegg). Dette systemet gir mulighet for nøyaktig og rask ekstern ventil kontroll. Løsninger av ren odorant fortynnes i mineralolje ved den valgte konsentrasjon. For å aktivere dorsal OB aldehyder som hexanal blir ofte brukt. Et nøyaktig volum av fortynnet odorant (20 til 50μl) er lastet på et filter papir og plassert i en sprøyte reservoar. Gjennom perfusjon systemet, er trykket kontrollert luft leveres til systemet, noe som sikrer en konstant rate på lukttilsatt luft flux levering til dyret nesen under ventil åpning. Odorant leveres gjennom en Tygon R-3603 Vacuum Tubing (Saint-Gobain Corporation) bærer luft ved en strømningshastighet på ~ 1000ml/min. Unngå kontaminering mellom odorants og gjenværende mengder odorant i slangen. Hvis tilgjengelig, kan reproduserbarhet odorant stimulus være controlled gjennom bruk av en flamme ionisering detektor (microFID 2020 Photovac).
2. Den optiske oppsettet er slått på. Den består av et avkjølt interlaced 12 bits CCD-kamera (ORCA AG Hamamatsu) forbundet med fluorescens stereomikroskop (Leica MZ16), en datastyrt olfactometer og stabilisert eksitasjon lamper med passende Båndpassdesign interferens filtre. En ordning som beskriver våre oppsett er gitt i figur 2. For Indre optiske signaler Imaging (IOSI), en 200W wolfram halogen lampe (Oriel QTH) kombinert med en fiber ring lys (Schott) plugget rundt mikroskopet mål brukes til å gi stabil og jevn belysning. For Flavoprotein Autofluorescence Signals Imaging (FASI), en 150W metall halogen (Leica) med en 5mm kjerne flytende lys guide gi enda lokalisert eksitasjon av fluorescens gjennom epi-belysning port av stereomikroskop.

   Bilde erverv og hardware-synkronisering er realisert av tilpasset programvare. Den åpne erkilde programvare Micromanager kan også brukes til å kontrollere den optiske oppsett og oppkjøp.

Fire. Optisk avbildning

1. Plasser stereotaxic rammen under stereomikroskop, den kraniale vinduet sentrert i synsfeltet (se fig. 2A for en skjematisk av den optiske setup).
2. Tune mikroskopet å fokusere på kapillærene. Før stimulering studier (se beskrivelse i 5) et bilde av pæren er tatt under 560nm (grønn) lys (fiber ring) som gir en god kontrast for blodkar imaging. Dette bildet brukes som en anatomisk kontroll for å sjekke tilstanden til forberedelse og blir kjøpt opp flere ganger under forsøket.
3. For IOS imaging, reflektert lys intensitet er registrert av CCD-kamera i henhold til 630 + / -10 nm (rødt) lys. Bildene er kjøpt på full frame (ingen Binning) ved 5 bilder per sekund, som tilsvarer en eksponeringstid på ca 150ms. Power of lyskilden er tilpasset re ACH grå nivåer av minst ~ 3000 på OB-området, nær metning av CCD piksler brønnene. Gjør du det gjør det mulig å dra nytte av 12bits dynamikken i CCD å fange opp svak intensitet endringer under aktivering. Maksimum IOS amplitudene nå ~ 1%.
4. For FAS avbildning fluorescens er ervervet i henhold til eksitasjon av 480nm + /-20Nm (blå) epiflurorescence lys. En høy-pass filter på 515nm er satt opp til å fange lyset. Bildene er kjøpt til 5 bilder per sekund med en Binning på 4 med 4 for å maksimere følsomheten. Eksitasjon lys strømmen er justert på samme måte IOS med grå nivåer av 3000 på OB området. Maksimum FAS amplitudene nå ~ 3%.

   For både bildediagnostikk, er dybdeskarpheten i faget planet det samme og ble målt til 0,5 mm for en forstørrelse på ca 4 ganger.

5. Lys skal være slått av mellom avbildning forsøk for å unngå oppvarming og fotobleking av preparatet.

le "> 5. Imaging studier

1. Standard bildebehandling session inkluderte et utgangspunkt på 5 til 10-ere der bare luften er levert, etterfulgt av lukt stimulering for 3 til 10s avhengig av valgt lukt konsentrasjon, og 70 til 82s er videre tatt opp med en konstant luftstrøm for baseline recovery (Fig. 2A). På slutten av rettssaken, blir lyset slått av og ren luft er levert for den inter rettssaken intervall varighet (1 til 3 minutter) for å vaske ut rest lukt molekyler og unngå sensorisk tilvenning. Lukt studier var interleaved med blanke studier (luft levering).
2. Lukt-vakte aktivert sonene er visualisert som grovt sfærisk områder på kart og tilsvarer størrelsen på individuelle glomeruli (80 til 200μm i diameter ^9). Bildebehandling er forklart i figur 2B. Olfactory kart er presentert i Figur 3. I motsetning til andre sensoriske system, var signal-til-støy-forholdet i OB tilstrekkelig til å løse lukt-evoked responser i enkelt studier (Fig. 3B for IOS og fig. 3D for FAS).
3. Mus er avlives umiddelbart på slutten av imaging økten etter metoder i tråd med europeiske anbefalinger for behandling og bruk av forsøksdyr.

Seks. Representant Resultater (se olfactory kartene i figur 3):

Figur 1. Strukturelle organiseringen av de viktigste luktelappen hos gnagere. Olfactory sensoriske nevroner, primære sanseceller ligger i hovedbygningen olfactory epitel, uttrykker det samme odorant reseptoren og møtes på samme glomeruli i OB. Olfactory glomeruli, runden-formet neuropils (stiplede sirkler), er plassert på overflaten av OB. Merk at en veldig tett og komplekst vaskulære nettverk er til stede ved glomerulære nivået. Forkortelser (topp / ned): onl: olfactory nerve lag; GL: glomerulære lag, EPL: eksterne plexiform lag; MCL:mitral celle laget; GCL: granule celle laget.

Figur 2 Refleksjon og fluorescens signaler innspilling in vivo. A. Wide-field optisk avbildning oppsett. Hjernen til en bedøves musen er utsatt til enten rød (IOS) eller blå (FAS) lys gjennom enten en ringformet fiber ring festet til optikk linse eller en epi-belysning port av et mikroskop. Lukt lastes inn forseglede ampuller og lukttilsatt luft leveres til dyrets nese (grønt lys: åpen ventil). B. Opptak protokoll og databehandling. IOS og FAS er bokført som serie av individuelle studier (90 av varighet). Diagrammet viser tidslinjen for en enkelt prøve: baseline varierer fra 5 til 10s, stimulering fra 3 til 10s, og gå tilbake til baseline fra 70 til 82s. Bildebehandling krever pixel-by-pixel subtraksjon av intensitet verdiene under baseline til intensitet verdier i perioder med stimulering (for FAS) or stimulering pluss tilbake til baseline (for IOS). Denne forskjellen er så delt på baseline verdier for å oppnå en variasjon i% (se resulterende bildene i fig. 3).

Figur 3 Lukt-evoked aktivitet kart i OB med IOS og FAS bildebehandling. A. vasculature av dorsal OB visualisert i henhold til grønt lys. BC. IOS avbildes (single rettssaken mot tre gjennomsnitt prøvelser henholdsvis) for en 10s presentasjon av 20% hexanal. Hvite piler indikerer sfæriske regioner av interesse aktivert av denne lukt. Disse aktivering kartene ble oppnådd ved bruk av rammer i gjennomsnitt i løpet av det første sekundet etter utløpet av lukt stimulering (maksimalt refleksjon variasjon -0,63% i A og -0,52% i B). Merk den svarte soner i absorbans hvor lukt aktivering har oppstått. CD. FAS kjøpte sekvensielt i samme musen for samme odorant (single rettssaken mot tre gjennomsnitt prøvelser respektively). Disse aktivering kartene ble oppnådd ved bruk av rammer i gjennomsnitt i løpet av det første sekundet etter begynnelsen av lukt stimulering (maksimum av fluorescens variasjon 0,72% i D og 0,66% i E). Merk at den hvite soner autofluorescence utslipp angitt med sorte piler tilsvare den svarte soner i IOS. Den kornete aspekt sett i FAS kartet skyldes de 4 av 4 Binning nødvendig for forbedring av følsomheten. FAS bilder ble ikke korrigert fra autofluorescence bleking. Faktisk dimensjoner av bilder BE: 0,7 mm bred x 1,2 mm lang.

Discussion

I denne artikkelen presenterer vi IOS og FAS imaging teknikker for in vivo innspillinger av lukt-evoked aktiviteter i musen OB. For å oppnå dette målet en relativt enkel og rimelig bredt felt optisk imaging oppsett er nødvendig. Oppkjøpet av imaging data krever opplæring til å utføre de fine kirurgiske prosedyrer og unngå skade på dura eller hjernen vev. Spesielt vil store blødninger absorbere fotoner registrert for bildebehandling og ende opp forsøket.

En fordel for IOS og FAS bildebehandling er å unngå injeksjon av fluorescerende sporstoffer som kan resultere i cellulær toksisitet eller uønskede bivirkninger. De gjør det mulig å takle spørsmål om olfactory kart dermed romlig koding av sensoriske stimuli. I motsetning til 2-DeoxyGlucose bildebehandling, gir de muligheten til bilde flere lukt i et enkelt dyr. Men siden foton penetrasjon er begrenset i vevet, er IOS og FAS begrenset til dorsal del av OBog kan ikke registreres fra ventral regioner.

Endogen optisk signal bildebehandling tilbyr utmerket romlig oppløsning for in vivo imaging. Tekniske forbedringer bekymring kvantitative beregninger av vaskulære komponenter i refleksjon signalene ^8,9 samt dynamikken i blod oksygenering og volumet under sensoriske aktivering ^10. Multibåndbredde avbildning av IOS bildebehandling tilnærminger er i dag utviklet i vårt laboratorium i å fullt ut kvantifisere total hemoglobinkonsentrasjon og oksygenering i OB under sensoriske aktivering. Disse spektroskopiske optiske målinger legges til FAS bildebehandling vil gi mulighet til å svare på uløste forholdet mellom vaskulær og intracellulære dynamikk under sensoriske aktivering ^11,12.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Imalgene	Merial
Rompun	Bayer AG
Agarose, type III-A	Sigma-Aldrich	A9793-50G
Hexanal 98%	Aldrich	115606-100ML