Summary
В этой статье представлены протоколы собственных оптических сигналов и изображений флавопротеидов аутофлюоресценция сигналы карту запахов вызывало деятельности на поверхности обонятельной луковицы у мышей.
Protocol
1. Подготовка животных для работы с изображениями (в соответствии с Европейскими рекомендациями по уходу и использованию лабораторных животных, 86/609/EEC Директива)
- От 6 до 8 недель C57BL6 самцов мышей анестезируют смесью кетамина (10mg/kg) и ксилазина (100mg/kg) вводят intraperitonealy. Операция начинается тогда, когда мышь не реагирует на hindpaw крайнем случае. Во время всего эксперимента животное помещается на грелку. Температура тела постоянно контролируется и поддерживается на уровне 37 ° C. Глубина анестезии сохраняется в течение хирургии и обработки изображений сессии, проверяя отсутствие конечностей уйти. Подкожного введения 20% от первоначальной коктейль анестетик вводят в противном случае.
- Использование ножницы, удалите волосы с головы. Чистая открытые участки кожи от остаточных волос с помощью стерильной марлей, смоченной физиологическим раствором.
- Место мыши в стереотаксической раме. Морда должна быть в той же плоскости, в затылок,для того, чтобы установить на поверхности обонятельной луковицы к горизонтали. Безопасные твердо уха и носа баров, чтобы предотвратить движение во время съемки.
- Применение глазной мази на глаза животного, чтобы предотвратить высыхание и боль.
- Лечить все хирургические инструменты с 70 ° и этанола области скальпа с последовательными взмахов бетадин.
- Для удаления кожного покрова черепа, сначала составьте разрез в коже с ножницами в задней части головы между ушами. Затем вырежьте в обе стороны к основанию уха и в передне-заднем направлении в сторону лба вдоль век. Готово удаления кожи головы за счет сокращения кожи на верхней части морды близко к носу бар.
- Под бинокулярным наблюдением, использовать ватный тампон, пропитанный солевым аккуратно отделить надкостницы на верхней части черепа. Используйте пару щипцов, чтобы удалить оставшиеся ткани и очистить поверхности черепа с помощью скальпеля, чтобы иметь чистую подготовки.
- ОВ симметричная структура, состоящая из двух hemibulbs, которые расположены между веками. Они ограничены в ростральной и в каудальном направлении от венозного синуса, и разделенных сагиттального шва. Поместите лист желатина рассасывающиеся губки пропитанной дистиллированной воды на кости выше OB. Важно, чтобы эта кость области влажной в течение всего эксперимента.
2. Подготовка черепной окно
- Удалить желатин губку и начните, мягко очищая кости с № 10 лезвие скальпеля. Держите под постоянным углом 45 ° между лезвием и кости, и двигаться лезвие от века, чтобы сагиттальной стороны лампочка области. Не применять вертикальное давление на кость или поцарапать кости выше венозного синуса.
- Во время прореживания процесс, остановить каждые 5 минут и место гидратированных желатин губку на кости, чтобы остыть подготовки. Тампон череп с губкой для удаления остатков костной ткани.
- Держите подметание иохлаждение альтернативно до визуализации трабекул, губчатый слой кости. Штрафа сосудистой из OB должен быть виден на данном этапе. Стоп царапин кости, и начать работу с кончика скальпеля в перпендикулярно "рисовать" прямоугольную область ограждающих OB. На этом этапе N ° 11 лезвие скальпеля может быть использован. Держите операции в пределах венозных синусов, которые должны быть в безопасности от любой скальпель инсульта.
- Dig постепенно формируются прямоугольные траншеи с помощью последовательных движений скальпелем. Протрите кончик скальпеля периодически чистить его и хранить его острым. Будьте предельно осторожны глубине наконечником, не прикасаясь к поверхности оболочки.
- Для того, чтобы получить представление о толщине оставшиеся кости, нажмите на нее осторожно кончиком пару щипцов. Если костный лоскут складки под давлением, переходим к следующему шагу.
- Под каплю физиологического раствора, использование кончика скальпеля ориентирован горизонтально, чтобы поднять костный лоскут. Удаление лоскута должно быть сделано сarefully, чтобы избежать отрыва оставшиеся кости.
- Как только поверхность Оби подвергается, проверьте на отсутствие каких-либо кровотечений или анастомоза сосудов. Повреждение оболочки или поверхности ткани снизит шансы на получение оптических сигналов. Протрите область с желатином губкой пропитанной солевым для того, чтобы держать лампу влажной.
- Применить полиакрилат стоматологического цемента в форме хорошо на кости вокруг окна.
- Место капли низкой температурой плавления агарозы (1,2%) по сравнению с твердой мозговой оболочки, и положить стерильную стеклянную крышку на размеры окна. Во время сессии изображений, малое количество агарозы может быть добавлен, чтобы компенсировать высыхания. Агарозном помешает О.Б. от движущихся с дыханием и обеспечит ровную поверхность для оптических изображений.
3. Оптическая установка изображений для отображения активности обонятельных
- Обонятельная стимуляция должна быть точно определена во времени и интенсивности использования ольфактометра. Мы используем пользовательские модифицированную версию multivial перфузии системы Valvebank 8II от Автоматизация научно связанные с основным воздушным компрессором (сжатым воздухом дышать было бы подходит, а). Эта система позволяет точно и быстро внешнего регулирующего клапана. Решения чистого одоранта разводят в минеральном масле при выбранной концентрации. Для активации спинной О.Б. альдегиды, такие как гексаналь обычно используются. Точный объем разреженных одоранта (от 20 до 50 мкл) загружается на фильтровальную бумагу и помещают в шприц водохранилище. С помощью системы перфузии, давления контролируемой воздух поступает в систему, обеспечивая постоянную скорость потока воздуха одоризованный доставки животного нос во время открытия клапана. Одоранта поставляется через Tygon R-3603 Вакуумный труб (Saint-Gobain Corporation) проведение воздуха при расходе ~ 1000ml/min. Избегайте загрязнения между отдушки и остаточные количества одоранта в трубку. Если есть возможность, воспроизводимость одоранта стимул может быть противоречивыеlled с помощью пламенно-ионизационного детектора (microFID 2020 Photovac).
- Оптической схемы включен. Она состоит из охлажденного чересстрочной 12 бит CCD камера (ORCA AG Хамамацу), связанные с флуоресценции стереомикроскопа (Leica MZ16), управляемый компьютером ольфактометра и стабилизировался возбуждения ламп с соответствующими фильтрами вмешательства полосовой. Схема, описывающая нашей установки обеспечивается на рисунке 2. Для внутренних оптических сигналов Imaging (IOSI), 200 Вт галогенной лампы вольфрам (Oriel QTH) в сочетании с волокном световое кольцо (Schott) подключен вокруг объектива микроскопа используются, чтобы обеспечить стабильное и равномерное освещение. Для флавопротеидом аутофлюоресценция Сигналы Imaging (Роснаукой), 150 Вт металлогалогенные лампы (Leica) с 5 мм руководство жидкость светло-ядро обеспечить даже локализованные возбуждения флуоресценции через эпи-подсветкой порт стереомикроскопа.
Приобретение изображения и аппаратное обеспечение синхронизации реализуются заказного программного обеспечения. Открытаяource программного обеспечения микроменеджер также может быть использован для управления оптическими установки и приобретения.
4. Оптические изображения
- Место стереотаксической рамы под стереомикроскопа, черепно окно по центру поля зрения (см. рис. 2A для Схема оптической схемы).
- Tune микроскоп, чтобы сосредоточиться на капилляры. До стимуляции испытаний (см. описание в 5) образ лампы взят под 560nm (зеленый) свет (ВКИ), которая обеспечивает хорошую контрастность для получения изображений кровеносных сосудов. Эта картина используется в качестве анатомического контроль и проверить состояние подготовки и приобретает несколько раз в течение эксперимента.
- Для IOS изображения, интенсивность отраженного света регистрируется с помощью ПЗС-камеры при 630 + / -10 нм (красный) подсветки. Изображения, полученные в полный кадр (без биннинга) со скоростью 5 кадров в секунду, что соответствует времени экспозиции около 150 мс. Мощность источника света регулируется повторно Ах оттенков серого, по крайней мере ~ 3000 на площади О.Б., близкой к насыщению ПЗС пикселей скважин. Это позволяет воспользоваться 12bits динамика CCD для захвата слабого изменения интенсивности во время активации. Максимальная IOS амплитуды достигает ~ 1%.
- Для ФАС изображений флуоресценции, приобретенных по возбуждению 480nm + /-20нм (синий) epiflurorescence света. Фильтр верхних частот на 515nm настроен для захвата света. Изображения, полученные в 5 кадров в секунду с биннинга из 4 на 4, чтобы максимизировать чувствительности. Мощности возбуждающего света настраивается аналогично IOS с серым уровнем 3000 на площади OB. Максимальная ФАС амплитуды достигают ~ 3%.
Для обоих изображений условий, глубины резкости в теме плоскости же и измерялась в 0,5 мм для увеличения примерно в 4 раза.
- Свет должен быть отключен от визуализации испытаний, чтобы избежать нагрева и фотообесцвечивания препарата.
- Стандартный сеанс визуализации включены базовые от 5 до 10 с, где только воздух подается, а затем запах стимуляции от 3 до 10 с в зависимости от выбранного запаха концентрации, и от 70 до 82S далее записанные с постоянным расходом воздуха для базового восстановления (рис. 2А). В конце судебного разбирательства, свет выключен, а чистый воздух подается по продолжительности интервала между суда (от 1 до 3 минут), чтобы смыть остаточные молекулы запаха и избежать сенсорного привыкания. Запах испытания чередуются с пустыми испытания (подача воздуха).
- Запах-вызывало активированный зон визуализируются как приблизительно сферических областей на картах и соответствовать размеру отдельных клубочков (от 80 до 200 мкм в диаметре 9). Обработка изображений объясняется на рисунке 2B. Обонятельные карты представлены на рисунке 3. В отличие от любой другой сенсорной системы, отношение сигнал-шум в ОВ было достаточно, чтобы решать запах вызывал реакции в одном испытаний (Рис. 3B для IOS и рис. 3D для ФАС).
- Мыши эвтаназии сразу же в конце сессии изображений с использованием методов в соответствии с Европейскими рекомендациями по уходу и использованию лабораторных животных.
6. Представитель Результаты (см. обонятельных карты на рисунке 3):
Рисунок 1 Структурная организация основной обонятельной луковицы у грызунов. Обонятельные сенсорные нейроны, первичных сенсорных клеток, расположенных в основной обонятельный эпителий, экспресс же рецепторов одоранта и сходятся на том же клубочков в OB. Обонятельные клубочков, круглые neuropils (пунктирные кружки), расположены на поверхности OB. Обратите внимание, что очень плотная и сложная сосудистая сеть присутствует в клубочковой уровне. Сокращения (верх / вниз): ONL: обонятельный нерв слой; GL: клубочкового слоя, EPL: внешний слой плексиформные; MCL:митрального слоя клеток; GCL: ЗК слоя.
Рисунок 2 отражения и флуоресценции сигналы записи в естественных условиях. А. Широкие поля установки оптических изображений. Мозг мыши анестезии подвергается либо красный (IOS) или синий (ФАС) свет или через кольцевой волокна придает объектив оптика или эпи-подсветкой порт микроскопа. Запахи загружаются в запечатанных флаконах и одоризованный воздух поступает к животному нос (зеленый свет: открыть клапан). Б. Запись протокола и обработки данных. IOS и ФАС регистрируются в качестве серии отдельных исследований (90-е годы продолжительность). Диаграмма показывает хронологию одного судебного разбирательства: базовый колеблется от 5 до 10 с, стимуляцию от 3 до 10 секунд, и вернуться к исходной линии, от 70 до 82S. Обработка изображений требует пиксель на пиксель вычитания значений интенсивности в течение базового для значений интенсивности в период стимуляции (ФАС) оГ стимуляции плюс возвращение к исходному (для IOS). Эта разница делится на базовые значения для получения изменения в% (см. полученных изображений на рис. 3).
Рисунок 3 дезодорированный вызванной активности карты в OB использованием IOS и ФАС изображений. А. сосудистой спинного О.Б. визуализированы в зеленом свете. До нашей эры. IOS образ (одно судебное разбирательство против трех усредненных испытаний соответственно) для 10 с презентацией на 20% гексаналь. Белые стрелки указывают сферической регионах, представляющих интерес активируется этим запахом. Эти активации карты были получены с использованием кадров усредненная в течение первой секунды после окончания запах стимуляции (максимум отражения изменения -0,63% в и -0,52% в В). Обратите внимание на черные зоны, где поглощение запаха активации не произошло. Компакт-диск. ФАС приобрела последовательно в той же мыши по той же одоранта (один судебный процесс против трех усредненных соответствующих испытанийлы). Эти активации карты были получены с использованием кадров усредненная в течение первой секунды после начала стимуляции запах (максимум флуоресценции изменения 0,72% в D и 0,66% в Е). Обратите внимание, что белый зон аутофлюоресценция выбросов показано черными стрелками соответствуют черные зоны в IOS. Зернистым аспект увидеть в карте ФАС в связи с 4 на 4 биннинга, необходимых для улучшения чувствительности. ФАС изображения не были устранены от аутофлюоресценция отбеливания. Фактические размеры изображения Берни Экклстоун: 0,7 мм х 1,2 мм.
Discussion
В этой статье мы представляем IOS и ФАС методов визуализации для прижизненного записи запах вызывал деятельности в OB мыши. Для достижения этой цели относительно простой и доступный широким полем оптической схемы изображений не требуется. Приобретение визуализации данных требует подготовки для выполнения тонких хирургических процедур и избегать любых повреждений оболочки или ткани головного мозга. В частности, кровотечений будут поглощать фотоны записал для работы с изображениями и в конечном итоге эксперимент.
Одним из преимуществ IOS и ФАС изображения, чтобы избежать введения флуоресцентных индикаторов, которые могли бы привести к сотовой токсичность или нежелательные побочные эффекты. Они позволяют решать вопросы о обонятельных карты таким образом пространственное кодирование сенсорных стимулов. В отличие от 2-дезоксиглюкозы изображений, они предоставляют возможность изображения несколько запахов в одно животное. Однако, так как фотон проникновения ограничен в ткани, IOS и ФАС ограничены спинной части О.Б.и не может быть записан с вентральной области.
Эндогенные оптических изображений сигнала предлагает отличные пространственного разрешения для изображений в естественных условиях. Технические озабоченность улучшения количественных расчетов сосудистых компонентов отражения сигналов 8,9, а также динамика оксигенации крови и объема при сенсорной активации 10. Многоволновые изображений IOS подходы визуализации в настоящее время в нашей лаборатории в полной мере количественно общей концентрации гемоглобина и кислорода в О. Б. во время сенсорных активации. Эти спектроскопические измерения оптической добавил в ФАС изображений даст возможность ответить на нерешенные взаимоотношения между сосудистыми и внутриклеточной динамики в процессе активации сенсорной 11,12.
Disclosures
Нам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана "Национальное агентство по La Recherche" гранта ANR-09-JCJC-0117-01 и "Neuropôle по исследованиям Франсильен-нерф" грант на Ромен Chery. Мы благодарим Франсуаза Лефевр для разработки программного обеспечения в C + + / Qt, и Лоран Пино и Батист Жанвье за помощь в развитии оптической схемы обработки изображений.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Imalgene | Merial | ||
| Rompun | Bayer AG | ||
| Agarose, type III-A | Sigma-Aldrich | A9793-50G | |
| Hexanal 98% | Aldrich | 115606-100ML |
References
- Grinvald, A., Lieke, E., Frostig, R. D., Gilbert, C. D., Wiesel, T. N. Functional architecture of cortex revealed by optical imaging of intrinsic signals. Nature. 324, 361-364 (1986).
- Rubin, B. D., Katz, L. C. Optical imaging of odorant representations in the mammalian olfactory bulb. Neuron. 23, 499-511 (1999).
- Chance, B., Cohen, P., J&246, bsis, &, F., Schoener, B.
- Shibuki, K., Hishida, R., Murakami, H., Kudoh, M., Kawaguchi, T., Watanabe, M., Watanabe, S., Kouuchi, T., Tanaka, R. Dynamic imaging of somatosensory cortical activity in the rat visualized by flavoprotein autofluorescence. J. Physiol. 549 (Pt. 3, 919-9127 (2003).
- Uchida, N., Takahashi, Y. K., Tanifuji, M., Mori, K. Odor maps in the mammalian olfactory bulb: domain organization and odorant structural features. Nat. Neurosci. 3, 1035-1043 (2000).
- Gurden, H., Uchida, N., Mainen, Z. F. Sensory-evoked intrinsic optical signals in the olfactory bulb are coupled to glutamate release and uptake. Neuron. 52, 335-345 (2006).
- Soucy, E. R., Albeanu, D. F., Fantana, A. L., Murthy, V. N., Meister, M. Precision and diversity in an odor map on the olfactory bulb. Nat. Neurosci. 12, 210-220 (2009).
- Frostig, R. D., Lieke, E. E., Ts'o, D. Y., Grinvald, A. Cortical functional architecture and local coupling between neuronal activity and the microcirculation revealed by in vivo high-resolution optical imaging of intrinsic signals. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 6082-6086 (1990).
- Meister, M., Bonhoeffer, T. Tuning and topography in an odor map on the rat olfactory bulb. J. Neurosci. 21, 1351-1360 (2001).
- Dunn, A. K., Devor, A., Bolay, H., Andermann, M. L., Moskowitz, M. A., Dale, A. M. Simultaneous imaging of total cerebral hemoglobin concentration, oxygenation, and blood flow during functional activation. Opt. Lett. 28, 28-30 (2003).
- L'Heureux, B., Gurden, H., Pain, F. Autofluorescence imaging of NADH and flavoproteins in the rat brain: insights from Monte Carlo simulations. Optics. Express. 17, 9477-9490 (2009).
- Renaud, R., Gurden, H., Chery, R., Bendhamane, M., Martin, C., Pain, F. Multispectral imaging of the olfactory bulb activation: influence of realistic differential pathlength correction factors on the derivation of oxygenation and total hemoglobin concentration maps (Proceedings Paper). Photonics West Conference, , (2011).
