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Immunology and Infection

Protocoles pour l'inoculation vaginale et prélèvement d'échantillons dans le modèle expérimental chez la souris des Candida Vaginite

Published: December 8, 2011 doi: 10.3791/3382
Automatic Translation
1, 1
1Louisiana State University Health Sciences Center

Summary

Techniques clés à utiliser dans l'évaluation des

Abstract

Vulvo-vaginale candidose (VVC), causée par les espèces de Candida, est une infection fongique des voies génitales inférieures femelles qui affecte environ 75% des femmes en bonne santé pendant leurs années reproductives 18,32-34. Les facteurs prédisposants comprennent l'utilisation des antibiotiques, le diabète non contrôlé et la perturbation des niveaux d'hormones de reproduction en raison de la grossesse, contraceptifs oraux ou traitements hormonaux substitutifs 33,34. VVC récurrente (RVVC), définie comme trois épisodes ou plus par an, affecte un 5 séparée à 8% des femmes sans facteurs prédisposants 33.

Un modèle expérimental chez la souris de VVC a été établi et utilisé pour étudier la pathogenèse et la réponse de l'hôte des muqueuses à Candida 3,4,11,16,17,19,21,25,37. Ce modèle a également été employée pour tester le potentiel de traitements antifongiques in vivo 13,24. Le modèle exige que les animaux soient maintenus dans un état de pseudoestrus pour optiMAL Candida colonisation / infection 6,14,23. Dans ces conditions, les animaux inoculés aura détectable vaginale charge fongique pendant des semaines ou des mois. Des études antérieures montrent un parallèle extrêmement élevée entre le modèle animal et l'infection humaine par rapport à des propriétés immunologiques et physiologiques 3,16,21. Les différences, cependant, incluent un manque de Candida flore vaginale normale et un pH neutre vaginale chez la souris.

Ici, nous démontrons une série de méthodes clés dans le modèle de la souris vaginite qui incluent l'inoculation vaginale, la collecte rapide des échantillons vaginaux, évaluation de la charge fongique vaginale, et des préparations de tissus cellulaires pour l'extraction / isolement. Il est suivi par des résultats représentatifs pour constituants de liquide de lavage vaginal, charge fongique, et le drainage des ganglions lymphatiques rendements des leucocytes. Avec l'utilisation d'anesthésiques, des échantillons de lavage peuvent être collectées à plusieurs moments sur les mêmes souris pour l'évaluation longitudinale deinfection / colonisation. Par ailleurs, ce modèle ne nécessite pas des agents immunosuppresseurs pour déclencher l'infection, permettant des études immunologiques dans des conditions d'accueil définie. Enfin, le modèle et chaque technique présenté ici pourrait donner lieu à l'utilisation des méthodologies d'examiner d'autres maladies infectieuses du tractus génital inférieur féminine (bactériennes, parasitaires, virales) et défenses de l'hôte respectifs locales ou systémiques.

Protocol

1. L'inoculation vaginale avec Candida albicans

  1. Trois jours avant l'inoculation, tout en limitant l'animal afin d'exposer l'abdomen, injecter 100 ml d'huile de sésame contient de 0.1 à 0.5 mg de β-estradiol par voie sous cutanée dans l'abdomen inférieur. Avancer l'aiguille d'environ 5 à 10 mm latéral à la peau pour limiter les fuites au site d'injection.
    L'administration sous-cutanée d'œstrogènes dans le bas-ventre est optimale dans ce modèle en raison de la proximité de l'appareil génital. Les doses efficaces peuvent varier selon les souches de souris, les âges ou les dérivés de l'œstrogène. Dans des études précédentes utilisant l'ABC-J (H-2 κ), C3H/HeN (H-2 κ), C57BL / 6 (H-2 b), Balb / c (H-2 d), DBA / 2 (H- 2 d), SJL (H-2 s) des souris à 6-8 semaines d'âge, 0,1 mg/100 ul a été trouvé efficace en témoigne l'épaississement de la paroi vaginale, diminution du mucus vaginal etaugmenté mue des cellules épithéliales. Souris-dessus traitée avec de l'oestrogène à cette concentration d'exposition cohérents colonisation vaginale par Candida. Pour l'inoculation des souris d'autres souches et l'âge, une étude pilote est recommandé pour garantir l'efficacité de l'œstrogène dans les conditions modifiées et d'augmenter la dose d'œstrogène si nécessaire.
    La solution d'œstrogènes doit être préparé à chaque fois le jour de l'injection. Pour assurer une solubilité complète de l'oestrogène dans l'huile de sésame, bien mélanger la solution en utilisant un mélangeur à vortex et de la chaleur par intermittence à 37 ° C. Répéter l'injection hebdomadaire pendant toute la période d'étude.
  2. Pour préparer l'inoculum, ajouter une anse de C. albicans blastoconidia partir d'une préparation subculture récents sur Sabouraud-dextrose agar (SDA) dans 10 ml de bouillon de peptone-phytone complété avec 0,1% de glucose. Incuber le bouillon de culture à la phase stationnaire pendant 18 h à 25 ° C dans un bain d'eau agité.
  3. Après l'incubation, de recueillir èmebouillon de culture électronique dans un tube de 15 ml conique et centrifuger à 800 xg pendant 5 min. Laver le culot à deux reprises avec du PBS stérile.
  4. Énumérer blastoconidia viable sur un hémocytomètre par bleu trypan exclusion. Ajuster la concentration cellulaire à 2,5 x 10 6 / ml (ou à une concentration de l'inoculum désiré) dans du PBS stérile.
  5. Pour stabiliser la souris, maintenez la base de la queue avec deux doigts et soulevez les hanches vers le haut afin que l'ouverture vaginale est tourné vers vous (Figure 1A). Elle est idéale si la souris est placé sur une surface plane râpé (sommet de cage par exemple) afin que les souris peuvent fournir une résistance contre les restrictions de la queue.
  6. Pipeter 20 pl (ou un volume souhaité de ne pas dépasser 20 pi) de la suspension inoculum en insérant la pointe de la pipette d'environ 5 mm de profondeur dans la lumière vaginale (figure 1B). Terminez cette étape aussi rapidement et doucement que possible pour minimiser la détresse chez la souris.

2. Lavages vaginaux

  1. Après l'euthanasie (ou l'anesthésie), hanciens de la souris vers le bas par la base de la queue avec deux doigts pour que l'ouverture vaginale est exposée.
  2. Lavage de la lumière vaginale en introduisant 100 ul de PBS stérile avec l'aspiration répétée et agitation avec une pointe de pipette. La pointe de la pipette peut devenir obstrués par les cellules. Si cela se produit, passer les cellules obstruction et continuer avec le reste lavaging PBS dans le vagin. Recueillir le liquide de lavage dans un tube à centrifuger.
  3. Alternativement, lavages vaginaux peuvent être effectuées sur des souris anesthésiées à l'anesthésie par inhalation d'isoflurane. Pour cela, exposer des souris à l'isoflurane vaporisé jusqu'à ce qu'ils soient pleinement mis sous sédation (~ 30 sec.). Tenez la souris vers le bas par la base de la queue et doucement la lumière lavage vaginal avec 50 ul de PBS stérile. Veillez à éviter l'agitation sévère avec un embout de pipette pour minimiser les traumatismes du vagin pendant cette procédure. Souris Sedated devrait remettre de l'anesthésie dans les 30 secondes d'exposition à l'air ambiant.

    L'isofluranepeut être vaporisé en utilisant un vaporisateur d'isoflurane et O 2 (de préférence) ou un système de chute standard chambre fermée anesthésie sans le système de vaporisateur (nécessite une surveillance étroite de l'animal tout en sédation pour éviter la détresse respiratoire).

    Lavages vaginaux sur les souris anesthésiées devrait être la méthode de choix pour les échantillons de lavage longitudinale sur les mêmes souris. Lavaging consécutives ne pas influencer l'évaluation de la charge fongique dans le temps 41.

  4. Pour les préparations humides de montage, le transfert 10 pl de la liquide de lavage sur une lame de verre et observer à un grossissement de 400-1000x par microscopie optique. En outre, les fractions cellulaires du liquide de lavage peut être teinté d'examiner des cellules et des morphologies nucléaires. Pour les préparations de frottis, le transfert de 10 ul du liquide de lavage sur une lame de verre et écartez doucement à l'aide de la paroi extérieure d'une extrémité de la pipette. Préserver les échantillons de frottis avec fixateur CYTOPREP et tacher par la technique de Papanicolaou standard (test de Pap). Observez à un grossissement de 400 par microscopie optique.

3. Quantification de la charge fongique vaginale

  1. Dans une 96 puits à fond rond plaque, transférer le liquide de lavage dans un puits de la rangée du haut et 180 ul de PBS stérile dans le puits 5 à la suite de cette colonne (bas de la plaque).
  2. Faire 1:10 dilutions successives de liquide de lavage vaginal en transférant les 20 ul du fluide pour le bien dans la colonne suivante. Mélanger soigneusement par aspiration répétée avant chaque transfert. Des dilutions en série d'un maximum de 12 échantillons de lavage (une ligne complète horizontale) peut être réalisée simultanément à l'aide d'une pipette 12 canaux.
  3. A partir de la dilution la plus faible, le transfert 10 ul de l'échantillon sur Sabouraud-dextrose agar (SDA). Placage de jusqu'à 36 échantillons peuvent être effectuées sur une plaque à l'aide SDA préparé en boîtes de Pétri carrées avec une grille et d'une pipette multicanaux écartement réglable.
  4. Énumérer unités formant colonie (UFC) après incubation à 34 ° C fou 48 h.

4. L'extraction des tissus vaginaux

  1. Suite à la procédure de lavage vaginal, poser la souris euthanasiées sur son dos et de saturer la région de l'aine à l'éthanol 70%. En utilisant une paire de pinces, soulever l'orifice urinaire vers le haut afin que l'ouverture vaginale est exposée.
  2. Insérer une paire de pinces courbées dans la lumière vaginale et de localiser le col. Tout en conservant une prise ferme avec la pince, extrait de l'utérus à travers la cavité vaginale (figure 2A-C).
  3. D'accise dans le vagin à la base de l'ouverture du vagin, puis retirez le col du vagin avec des ciseaux chirurgicaux. Gardez à l'esprit que le tissu vaginal est involué (intérieur de l'épithélium du vagin côté est exposé vers l'extérieur). Le tissu peut être soit latéralement inversée pour maintenir l'orientation de l'original du vagin ou ouvert dans une feuille en faisant une incision latérale.

    Excisées tissus vaginaux peuvent être utilisées pour 1) le collage des lymphocytes suite à l'extractionla digestion nase (~ 1 × 10 4 / souris) 40, 2) l'isolement des cellules épithéliales dispase après digestion (~ 5 × 10 4 / souris) 28, 3) les préparations congelées ou en paraffine pour des analyses histologiques 25.

5. Lombaire excision des ganglions lymphatiques

  1. Suite à la procédure de lavage vaginal, poser la souris euthanasiées sur le dos et saturer l'abdomen avec 70% d'éthanol. Faire une incision latérale à partir du bas-ventre à la poitrine et d'exposer les organes internes. En utilisant une paire de pince à deux mains, de déplacer les intestins vers le haut afin que les vaisseaux sanguins deviennent visibles centrale.
  2. Localisez la veine cave inférieure et l'aorte abdominale. Normalement, une paire de ganglions lymphatiques lombaires peuvent être identifiés à côté de l'aorte abdominale, située à environ mi-chemin entre l'origine des artères iliaques communes rénale et 39. Ces ganglions lymphatiques peuvent être distinguées visuellement des tissus adipeux par la texture élastiqueet sont plus légers et plus opaques de couleur par rapport au tissu adipeux (figure 3). Ces ganglions lymphatiques sont sensiblement plus grandes chez les animaux infectés par rapport aux animaux non inoculés.
  3. Accise les ganglions lymphatiques en plaçant microforceps sous le nœud, puis tirez doucement jusqu'à se séparer de tissus environnants.

6. Isolement des cellules lymphoïdes dans une seule cellule suspensions

  1. Transfert des ganglions lymphatiques sur un grillage stérile (environ 3 x 3 cm 2 en taille) placé à l'intérieur une boîte de Pétri stérile en verre contenant environ 10 ml de solution de Hanks saline équilibrée (HBSS) (figure 4).
  2. Avec la boîte de Pétri légèrement incliné, appuyez sur les ganglions lymphatiques contre l'écran avec une tête de piston de la seringue. Assurez-vous de briser tous les ganglions lymphatiques afin que le contenu cellulaire des ganglions passer par l'écran alors que les composantes non cellulaires des nœuds (ie, les membranes, le stroma, la graisse) restent à l'écran.
  3. En utilisant le piston et la seringue même, aspirer tIl HBSS cellules contenant. Laver l'écran avec ~ HBSS 5 ml et recueillir le liquide restant dans un tube de 15 ml conique.
  4. Centrifuger à 800 xg pendant 10 min. Aspirer les dépôts gras dans le haut du liquide avec une pipette avant de jeter le liquide. Laver le culot cellulaire à trois reprises avec HBSS. Reprendre le culot dans 1 ml de HBSS et énumérer les cellules viables par l'exclusion bleu trypan.

7. Les résultats représentatifs:

Les fractions cellulaires du liquide de lavage vaginal de> 4-jours des souris inoculées sont généralement constitués de Candida, les cellules épithéliales et des infiltrats cellulaires (figure 5). Par humides montage microscopique, Candida peut être identifié visuellement par la présence d'hyphes ainsi que la levure (figure 5A). Étaler la préparation du liquide de lavage vaginal peut être coloré par la technique de Papanicolaou pour examiner les cellules épithéliales et les leucocytes infiltrant, dont les principales cellules neutrophiles sont identifiés par le tri-nuclelobes ar (figure 5B). Très peu de neutrophiles, le cas échéant, sont détectés chez les souris inoculées (figure 5C) 41.

Un exemple de charge fongique vaginale est montré dans la figure 6. Le liquide de lavage vaginal prélevés à des moments spécifiques sont cultivées pour l'énumération UFC (figure 6A). Colonisation vaginale / infection à Candida persiste pendant des semaines dans des œstrogènes chez les souris traitées inoculé (figure 6B), tandis que le Candida ne parvient pas à établir la colonisation vaginale chez les non-oestrogène-traitée souris inoculées (figure 6C). L'œstrogène chez les souris traitées non inoculés restent négatives pour le Candida dans le temps (données non présentées). En outre, les lavages vaginaux peuvent être effectuées soit une seule fois sur des souris séparées à chaque point du temps ou longitudinalement dans les mêmes souris sous anesthésie.

Les ganglions lymphatiques lombaires sont les nœuds lymphatiques drainant primaires du tractus génital et le site le plus pertinent pour évaluer des réponses immunitaires à un défi vaginale. Note que ces ganglions peuvent devenir élargie chez les souris inoculées pendant qu'ils apparaissent normalement assez faible chez les souris inoculées. Leucocytes recouvrements cellulaires varient généralement de 8 x 10 5 / souris inoculées à 5 × 10 6 souris / inoculé. En plus de ganglions lymphatiques lombaires, les ganglions lymphatiques inguinaux, poplité et mésentériques peuvent également être utilisés.

Figure 1
Figure 1. Inoculation vaginale à Candida. A) Une souris retenue pour l'inoculation. La souris est placée sur un insert cage métallique et détenus par la base de la queue, légèrement vers le haut pour soulever les jambes et d'exposer l'orifice vaginal. La hanche de la souris peut être stabilisée avec la même main, car il tente de résister à la contrainte de la queue. B) l'introduction de l'inoculum dans la lumière vaginale. Une extrémité de la pipette est doucement introduit à environ 5 mm de profondeur dans la lumière vaginale. L'inoculum de suspension est ensuite déposée.


Figure 2. Extraction de tissu vaginal. AB) Extraction de l'utérus. Le col est situé à la pince incurvée et exposés à l'extérieur par la cavité vaginale. Une fois sorti de la cavité vaginale, le col est encore tiré vers l'extérieur pour exposer entièrement le vagin. C) Extraction du vagin. Le vagin est excisé de la vulve avec des ciseaux. Une fois détaché, retirez le col du vagin.

Figure 3
Figure 3. Identification des ganglions lymphatiques lombaires. L'emplacement des ganglions lymphatiques lombaires entre les organes environnants / vaisseaux sanguins dans les environs du bassin est indiquée. Une aorte, abdominaux. B, de la vessie. C, artère iliaque commune. I, intestins. L, le foie. R, rectum. S, de la rate. U, utérus.

Figure 4
Figure 4. Les ganglions lymphatiques lombaires placé sur un grillage. Les ganglions lymphatiques sont regroupés sur l'écran placé dans une boîte de Pétri avec HBSS. Les ganglions lymphatiques sont pressés contre la grille avec un piston de la seringue pour obtenir des cellules lymphoïdes dans une seule cellule suspensions.

Figure 5
Figure 5. Fractions cellulaires du liquide de lavage vaginal de souris inoculées. Une préparation) Mouiller montage et B) frottis vaginaux des échantillons recueillis lavage 4 jours post-inoculation et C) chez des souris inoculées. Les images sont montré à 1000 × (A) ou 400 × (B, C) grossissement. L'insert en B montre la morphologie nucléaire des neutrophiles vaginale à 1000 ×. Levure Candida (Y) et des hyphes (H), les cellules épithéliales (CE) et neutrohils (N) sont indiqués.

Figure 6
Figure 6. Détecterion de charge fongique vaginale. A) Les colonies de C. albicans représentant cultivé sur une plaque SDA. Neat échantillons de lavage (N) à partir de six différents souris inoculées (rangée du haut) ont été dilués en série et de culture pour le dénombrement des UFC. B) Quantification de la charge fongique vaginale d'œstrogène-traitées et C) la non-oestrogènes chez les souris traitées. UFC/100 ul du liquide de lavage des souris inoculées ont été évalués sur des points de temps indiquée.

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Discussion

Un modèle expérimental chez la souris de Candida vaginite a été établi et historiquement utilisé pour les dernières décennies pour étudier la réponse d'hôte des muqueuses à Candida ainsi que pour les tests traitements antifongiques 3,4,11,13,16,17,19,21,24, 25,37. Les protocoles présentés ici intègrent des méthodes efficaces et moins de main-d'œuvre, et semblent être l'un des systèmes modèle le plus optimisé de Candida vaginite décrites à ce jour. Ces techniques permettent une quantification rapide de la charge fongique et la collecte des échantillons vaginaux. Par ailleurs, des études antérieures de tester plusieurs souches haplotypique de souris (n = 13) et différents temps post-inoculation a montré des niveaux similaires de la variabilité de la charge de champignons et de réponses de l'hôte à la colonisation vaginale par Candida 2,6,41. Par conséquent, ce modèle peut être adapté aux protocoles existants, sans restriction sur les souches de souris ou de la durée de l'infection. Cependant, on doit reconnaître que levariabilité charge fongique vaginale peut être élevé entre animaux ayant reçu le même inoculum (figure 6B). Il ya des preuves soutenant que la variabilité est due à différents degrés d'adhésion précoce à l'épithélium vaginal 41. Par conséquent, les souris 7-10 / groupe est suggéré à des fins statistiques.

Variabilité de la charge fongique vaginale a également été mise en évidence entre les différentes souches de C. albicans, ce qui suggère que toutes les souches de C. albicans ont la capacité de coloniser le vagin de la même souris. Par exemple, C. albicans 3153A (souche de laboratoire) utilisé dans ce protocole a été rapporté pour montrer la colonisation vaginale supérieur à SC5314 (isolat clinique), où un plus haut inoculum (> un log) serait nécessaire pour obtenir des niveaux équivalents de charge fongique vaginale vu avec 3153A 27. En fait, une colonisation vaginale très variable avec plusieurs isolats cliniques a été documentée 36. Par conséquent, des précautions doivent être takfr lors de la détermination d'un inoculum optimal pour chaque C. albicans souche afin d'assurer la colonisation cohérente chez la souris. Généralement, la moyenne allant de 5 UFC x 10 4 à 5 x 10 5 / 100 ul du liquide de lavage doit être détecté pour la colonisation cohérente. Pour l'évaluation de la charge fongique vaginale, la quantification de CFU par lavages est appropriée pour ce modèle comme Candida blastoconidia et hyphes normalement ne pénètrent pas au-delà de la couche superficielle de l'épithélium vaginal. Notre précédente évaluation histologique de l'après-lavage des tissus vaginaux rarement montré résiduelle Candida 25,41. Toutefois, nous reconnaissons la possibilité que les hyphes pourrait être mal compté à mesure qu'ils grandissent comme une seule colonie sur la plaque de gélose et pourraient ne pas refléter précise charge fongique. Comme méthode alternative d'UFC énumération, un tout nouveau dans la technique d'imagerie in vivo a été signalé à succès d'évaluer charge fongique vaginale lors de l'utilisation génétiquement luminescents C. albicans 9,29. Par ailleurs, le protocole peut être modifié pour inciter C. la colonisation glabrata chez les animaux diabétiques 15,20. À ce jour, des modèles de souris pour les autres non-C. Albicans induite vaginite n'ont pas été signalés.

Administration d'œstrogènes est critique pour ce modèle, initier robustes colonisation vaginale par Candida 6,14,23. En plus d'injection sous-cutanée de l'injection d'estradiol en suspension huile de sésame, solubles dans l'eau d'implantation d'estradiol dans le PBS et intradermique d'une libération contrôlée-estradiol pellets sont des méthodes alternatives pour l'administration d'œstrogènes et ont été employées dans des modèles murins d'autres infections des voies génitales femelles 10 , 35. Exigence d'oestrogènes élevés dans ce modèle peut être expliqué par deux facteurs physiologiques. L'une est que l'oestrogène favorise élevés stratification de l'épithélium vaginal 5,8,30. L'épithélium épaissi par la prolifération des cellules épithéliales peuvent tous augmentéCandida omment obtenir un meilleur respect de la paroi vaginale et de la colonisation ultérieure. Deuxièmement, cellules épithéliales vaginales sont connus pour avoir la teneur en glycogène élevée. Une augmentation des résultats tissus oestrogène au niveau des dépôts de glycogène dans les parois vaginales 30. Glycogène élevée dans le microenvironnement vaginales peuvent à leur tour permettent de s'épanouir Candida en fournissant des éléments nutritifs supplémentaires. Les précédentes analyses ont montré que l'abri d'œstrogènes exogènes n'a pas affecté la cellule d'expression des molécules d'adhésion 40. Un inconvénient de traiter les animaux avec des œstrogènes exogènes est que oestrogène élevé a aussi été connu pour favoriser la prolifération de flore commensale vaginale 30. Comme la composition de la flore peuvent varier considérablement entre les animaux, cela peut ajouter une variable où les organismes commensaux pourrait influencer la croissance de Candida ou moduler réponses de l'hôte. En contrepartie de cette question, le modèle exige des œstrogènes traités de contrôle (non inoculés) animaux destinés à être inclus danstoutes les expériences et analysés en parallèle.

Dans ce modèle de souris, l'efficacité des agents antifongiques peuvent être évalués avec précision par les protocoles décrits aux présentes, qui peuvent fournir cruciaux des tests in vivo conduisant à l'élaboration de thérapies potentielles pour une utilisation clinique. En fait, la nature robuste du modèle fournit de bonnes indications sur l'efficacité clinique. En plus de l'utilisation d'œstrogènes, neutre pH vaginal chez la souris favorise la croissance des hyphes, une forme pathogène de Candida vu dans toutes les souris inoculées. Semblable à des observations cliniques, une migration des neutrophiles robustes vaginale survient dans un sous-ensemble de la souris sans affecter la charge fongique 31,41. La présence de neutrophiles est proéminent chez les femmes pendant la vaginite symptomatique et apparaît à la souris en parallèle après inoculation 12,41. Depuis d'autres symptômes cliniques (ie, démangeaisons, gonflement) ne peut pas être précisément mesurable chez la souris, l'évaluation des neutrophiles vaginalesert comme une indication simple et fiable de l'inflammation (les symptômes) dans ce modèle.

La microscopie du liquide de lavage vaginal montre la figure 5 est systématiquement effectué dans notre laboratoire pour évaluer la colonisation de Candida et d'inflammation vaginale. Par ailleurs, la notation des hyphes peut également être utilisé comme mesure de l'infection. Par la suite, les fractions cellulaires et solubles du liquide de lavage peut être préservée et cryo-archivées pour des analyses futures. Fait à noter, une caractéristique avantageuse de ce protocole est que les lavages vaginaux peuvent être réalisées longitudinalement dans les souris même sous anesthésie. Nos études antérieures ont confirmé que l'évaluation longitudinale n'a pas d'influence évaluation de la charge fongique vaginale. Cette approche est particulièrement avantageuse dans les cas où des analyses longitudinales de l'infection sont souhaitées.

Enfin, nous avons développé une méthode d'excision moins invasive pour le vagin. Cette technique efficace et rapide ne nécessite aucune incision dansl'abdomen ou les organes internes, laissant le reste de l'appareil génital intact. Une autre caractéristique utile de ce modèle est l'absence d'obligation pour les agents immunosuppresseurs pour initier la colonisation à Candida. Ceci est particulièrement important car le maintien du statut immunitaire naturelle de l'hôte est un aspect critique des études immunologiques et réponses de l'hôte d'un défi microbien. Par conséquent, les tissus et les cellules isolées par ces méthodes pourraient être appliquées dans différents tests in vitro immunitaire.

En conclusion, nous proposons plusieurs caractéristiques importantes et les résultats représentatifs du modèle expérimental de candidose vaginale. En plus de C. albicans induite par la vaginite, les infections par d'autres pathogènes de l'appareil génital féminin inférieur, y compris Neisseria gonorrhoeae, Trichomonas vaginalis et virus Herpes simplex ont été étudiés en utilisant des modèles de souris où les organismes sont introduits par voie intravaginale de l'hormone de souris traitées 1,7,10,22,26,35,38. Par conséquent, les techniques qui sont utiles pour des études impliquant Candida vaginite peut être appliqué à l'avance et potentiellement des méthodes pour étudier la pathogenèse et l'hôte des réponses immunitaires à d'autres maladies infectieuses de l'appareil génital féminin inférieur.

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Disclosures

Pas de conflits d'intérêt déclarés.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par R01 AI32556 (NIAID, Institut national de santé). Ce travail a également été soutenu en partie par la Louisiane Vaccine Center et sud de la Louisiane Institut de recherche sur les maladies infectieuses commandité par le Conseil ontarien des affaires collégiales en Louisiane.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Female CBA/J mice Charles River Laboratories 01C38 5-6 weeks of age
Candida albicans (3153A) National Collection of Pathogenic Fungi, UK NCPF3153
Sesame oil Sigma-Aldrich S3547 D–s not need to be pre-sterilized before use
Β-estradiol 17-valerate Sigma-Aldrich E1631 0.1-0.5mg in sesame oil
Phytone peptone BD Biosciences 211906 Supplement with 0.1% glucose
Trypan blue solution Sigma-Aldrich T8154
Sabouraud dextrose agar BD Biosciences 211584
Collagenase type IV Sigma-Aldrich C5138 0.25%
Dispase Invitrogen 17105-041 1.7 U/ml
Wire mesh screens TWP 060X060S0065W36T No. 60 mesh, stainless
Hanks’ balanced salt solution Invitrogen 24020-117
CytoPrep fixative Fisher Scientific 12-570-10 Preserves smear slides
Papanicolaou stain EA-65 EMD Millipore 7054X-85
Papanicolaou stain OG-6 EMD Millipore 7052X-85
Harris’ Alum hematoxylin EMD Millipore 638A-85
Isoflurane Baxter Internationl Inc. NDC 10019-773-60 Used with isoflurane vaporizer or in a drop system closed anesthetic chamber

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Immunologie Numéro 58, La vaginite la souris les ganglions lymphatiques lombaires des tissus vaginaux lavage vaginal
Protocoles pour l&#39;inoculation vaginale et prélèvement d&#39;échantillons dans le modèle expérimental chez la souris des<em> Candida</em> Vaginite
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Yano, J., Fidel, Jr., P. L.… More

Yano, J., Fidel, Jr., P. L. Protocols for Vaginal Inoculation and Sample Collection in the Experimental Mouse Model of Candida vaginitis. J. Vis. Exp. (58), e3382, doi:10.3791/3382 (2011).

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