Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Protokoller for Vaginal Inokulasjon og Prøvetaking i Experimental mus modell av Candida Vaginitt

Published: December 8, 2011 doi: 10.3791/3382
Automatic Translation
1, 1
1Louisiana State University Health Sciences Center

Summary

Sentrale teknikker som skal brukes i evalueringen av

Abstract

Vulvovaginal candidiasis (VVC), forårsaket av Candida arter, er en soppinfeksjon i nedre kvinnelige kjønnsorganer som rammer ca 75% av ellers friske kvinner i sine reproduktive år 18,32-34. Disponerende faktorer inkluderer bruken av antibiotika, ukontrollert diabetes og forstyrrelser i reproduktive hormonnivået på grunn av graviditet, p-piller eller hormon erstatning terapi 33,34. Tilbakevendende VVC (RVVC), definert som tre eller flere episoder per år, påvirker en separat 5-8% av kvinner uten predisponerende faktorer 33.

En eksperimentell mus modell av VVC har vært etablert og brukt til å studere og patogenese mucosal vert respons på Candida 3,4,11,16,17,19,21,25,37. Denne modellen har også blitt ansatt for å teste potensialet antimykotisk behandling in vivo 13,24. Modellen forutsetter at dyrene holdes i en tilstand av pseudoestrus for optimal Candida kolonisering / infeksjon 6,14,23. Under slike forhold vil inokulert dyr har påvisbare vaginal soppbyrden i uker til måneder. Tidligere studier viser en ekstremt høy parallell mellom dyremodell og menneske-smitte i forhold til immunologiske og fysiologiske egenskaper 3,16,21. Forskjeller omfatter imidlertid en mangel på Candida som vanlig vaginal flora og en nøytral vaginal pH i mus.

Her viser vi en rekke sentrale metoder i musen vaginitis modell som inkluderer vaginal inokulasjon, rask innsamling av vaginale prøver, vurdering av vaginal soppbyrden, og vevspreparater for mobilnettet utvinning / isolasjon. Dette etterfølges av representative resultater for bestanddeler av vaginal lavage fluid, soppbyrden og drenerende lymfeknute leukocytt avkastning. Med bruk av anestesi, kan lavage prøvene hentes på flere tidspunkter på samme mus for langsgående evaluering avinfeksjon / kolonisering. Videre krever denne modellen ingen immunsuppressive midler til å initiere infeksjon, slik at immunologiske studier under definerte host forhold. Endelig innførte modellen og hver teknikk her kunne potensielt gi opphav til bruk av metoder for å undersøke andre smittsomme sykdommer i nedre kvinnelige kjønnsorgan (bakteriell, parasittiske, viral) og respektive lokale eller systemiske vert forsvar.

Protocol

1. Vaginal inokulering med Candida albicans

  1. Tre dager før inokulasjon, mens besøksforbud dyret å eksponere magen, injisere 100 mL av sesamolje inneholder 0,1 til 0,5 mg av β-estradiol subkutant i underlivet. Advance nålen ca 5 til 10 mm lateral på huden for å redusere lekkasje fra injeksjonsstedet.
    Den subkutan administrasjon av østrogen i underlivet er optimalt i denne modellen på grunn av nærhet til kjønnsorgan. Effektiv doser kan variere fra musestammer, alder eller østrogen derivater. I tidligere studier med CBA-J (H-2 κ), C3H/HeN (H-2 κ), C57BL / 6 (H-2 b), BALB / c (H-2 d), DBA / 2 (H- 2 d), SJL (H-2 s) mus ved 6-8 ukers alder, var 0,1 mg/100 mL funnet effektive dokumentert av fortykkelse av vaginal veggen, redusert vaginal slim ogøkt epithelial celle sloughing. Mus over behandlet med østrogen på dette konsentrasjon utstillingen konsistent vaginal kolonisering med Candida. For inokulasjon i mus av andre stammer og aldre, er en pilotstudie anbefales for å sikre effektiviteten av østrogen under endret forholdene og øke østrogen dosen om nødvendig.
    Den østrogen Løsningen bør være forberedt på frisk hver gang den dagen injeksjon. For å sikre fullstendig løseligheten av østrogen i sesamolje, grundig blanding løsningen ved hjelp av en vortex mikser og varme midlertidig ved 37 ° C. Gjenta injeksjon ukentlig gjennom hele studieperioden.
  2. For å forberede podestoff, legge til en loopful av C. albicans blastoconidia fra en nylig subkultur forberedelse på Sabouraud-dextrose agar (SDA) i 10 ml Phytone-pepton sjy supplert med 0,1% glukose. Inkuber suppen kultur til stasjonær fase for 18 timer ved 25 ° C i en rystelse vannbad.
  3. Etter inkubasjon, samle the kjøttkraft kultur inn i en 15 ml konisk rør og sentrifuger ved 800 xg i 5 min. Vask pellet to ganger med sterile PBS.
  4. Nummerere levedyktig blastoconidia på et hemocytometer ved trypan blått fargestoff eksklusjon. Juster cellekonsentrasjonen til 2,5 x 10 6 / ml (eller til ønsket podestoff konsentrasjon) i sterile PBS.
  5. Å stabilisere musen, hold haleroten med to fingre og løfte hip oppover slik at skjedeåpningen vender mot deg (figur 1A). Det er ideelt hvis musen er plassert på en flat revet overflate (f.eks bur øverst) slik at musen kan gi motstand mot halen tilbakeholdenhet.
  6. Pipetter 20 mL (eller en ønsket volum ikke skal overstige 20 mL) av podestoff suspensjon ved å sette pipettespissen ca 5 mm dypt inn i skjeden lumen (Figur 1B). Fullfør dette trinnet så raskt og skånsomt som mulig for å minimere ubehag hos mus.

2. Vaginal lavages

  1. Etter dødshjelp (eller anestesi), hgamle musen nedover ved haleroten med to fingre slik at skjedeåpningen blir eksponert.
  2. Lavage vaginal lumen ved å innføre 100 mL av sterile PBS med gjentatte aspirasjon og agitasjon med en pipette spissen. Pipettespissen kan bli tilstoppet med celler. Hvis dette skjer, dispensere det hindrer cellene og fortsette lavaging med gjenværende PBS i skjeden. Samle lavage fluid inn i et mikrosentrifuge tube.
  3. Alternativt kan vaginal lavages utføres på bedøvet mus med isofluran inhalant anestesi. For dette, utsette musene til fordampede isofluran før de er fullt bedøvet (~ 30 sek.). Hold musene nedover ved haleroten og forsiktig lavage vaginal lumen med 50 mL av sterile PBS. Sørg for å unngå harde agitasjon med en pipette tips for å minimere traumer til vagina under denne prosedyren. Bedøvet mus skal komme fra anestesi innen 30 sekunder fra eksponering til luft.

    Isoflurankan fordamper ved hjelp av en isofluran vaporizer og O 2 (foretrekkes) eller en standard dråpe system lukket bedøvelse kammer uten vaporizer system (krever tett oppfølging av dyret mens bedøvet for å unngå pustebesvær).

    Vaginal lavages på bedøvet mus skal være metoden for valg for langsgående lavage prøver på samme mus. Fortløpende lavaging påvirker ikke vurderingen av soppbyrden over tid 41.

  4. For våt-mount forberedelser, overføring 10 mL av lavage væske på et glass slide og observere på 400-1000x forstørrelse ved lysmikroskopi. I tillegg kan cellulære fraksjoner av lavage fluid være farget å undersøke celler og nukleær morfologi. For smøre forberedelser, overføring 10 mL av lavage væske på et glass slide og forsiktig spre bruker ytterveggen av en pipette tips. Bevar smøre prøvene med CytoPrep festing og beis av standard Papanicolaou teknikken (celleprøve). Observere på 400 × forstørrelse ved lysmikroskopi.

3. Kvantifisering av vaginal soppbyrden

  1. I en 96 godt rundbunnet plate, overføre lavage væske i en brønn av den øverste raden og 180 mL av sterile PBS i følgende 5 brønner i kolonnen (ned platen).
  2. Gjør 01:10 serielle fortynninger av vaginal lavage fluid ved å overføre 20 mL av væsken til den neste brønnen i kolonnen. Bland grundig ved gjentatte aspirasjon før hver overføring. Serial fortynninger av inntil 12 lavage prøver (én full horisontal rad) kan utføres samtidig med en 12-kanals pipette.
  3. Starte med lavest fortynning, overføre 10 mL av prøven på Sabouraud-dextrose agar (SDA). Plating av opp til 36 prøver kan utføres på en plate med SDA utarbeidet i kvadrat petriskåler med rutenett og en justerbar avstand multikanal pipette.
  4. Nummerere kolonidannende enheter (CFUs) etter inkubering ved 34 ° C feller 48 h.

Fire. Vaginal vev utvinning

  1. Etter vaginal lavage prosedyren, lå den avlives musen på ryggen og mette lysken med 70% etanol. Ved hjelp av en pinsett, løfter urin åpningen oppover slik at skjedeåpningen blir eksponert.
  2. Sett et par buet tang inn i skjeden lumen og finn livmorhalsen. Samtidig opprettholde et fast grep med pinsett, trekke livmorhalsen gjennom vaginal cavity (Figur 2A-C).
  3. Avgiftsdirektoratet i skjeden ved foten av skjedeåpningen og deretter fjerne cervix fra skjeden med kirurgisk saks. Husk at den vaginale vevet involuted (indre epitel-siden av skjeden er eksponert utover). Vevet kan enten lateralt invertert å opprettholde den opprinnelige retningen på skjeden eller åpnet i et ark ved å lage en lateral snitt.

    Excised vaginal vev kan brukes for 1) lymfocytt utvinning følgende collagenase fordøyelse (~ 1 × 10 4 / mus) 40, 2) epithelial celleisolasjon følgende dispase fordøyelsen (~ 5 × 10 4 / mus) 28, 3) frosset eller parafin-embedded forberedelsene til histologiske analyser 25.

5. Lumbar lymfeknute eksisjon

  1. Etter vaginal lavage prosedyren, lå den avlives musen på ryggen og mette magen med 70% etanol. Lag en lateral snitt fra nedre del av magen til brystet og avsløre de indre organer. Ved hjelp av en pinsett i begge hender, flytte tarmen oppover slik at de sentrale blodårene blir synlige.
  2. Finn vena cava inferior og abdominal aorta. Normalt kan et par lumbar lymfeknuter bli identifisert ved siden av abdominal aorta, som ligger omtrent halvveis mellom opprinnelsen av renal og felles iliac arterier 39. Disse lymfeknuter kan være visuelt skilles fra fettvev av elastiske teksturog er lettere og mer ugjennomsiktig i farge i forhold til fettvev (figur 3). Disse lymfeknutene er merkbart større i infiserte dyr sammenlignet med uninoculated dyr.
  3. Avgiftsdirektoratet lymfeknutene ved å plassere microforceps under noden og trekk forsiktig opp til å skille fra omkringliggende vev.

Seks. Isolasjon av lymfoide celler i encellede suspensjoner

  1. Overfør lymfeknuter på en steril netting skjerm (ca. 3 x 3 cm 2 i størrelse) plassert inne i et sterilt glass petriskål inneholder ~ 10 ml Hanks 'balansert salt-løsning (HBSS) (figur 4).
  2. Med petriskål tilbøyelig litt, trykk på lymfeknutene mot skjermen med en sprøytestempelet hodet. Sørg for å bryte alle lymfeknuter slik at den cellulære innholdet av nodene passerer gjennom skjermen mens de ikke-cellulære komponenter av nodene (dvs. membraner, stroma, fett) forblir på skjermen.
  3. Bruke samme stempelet og sprøyten, aspirer than HBSS inneholder celler. Vask skjermen med ~ 5 ml HBSS og samle de gjenværende væske inn i en 15 ml konisk tube.
  4. Sentrifuger ved 800 xg i 10 min. Aspirer noen fatty innskudd på toppen av væsken med en pipette før kaste væske. Vask cellepelleten tre ganger med HBSS. Resuspender pelleten i 1 ml HBSS og oppsummere levedyktige celler ved trypan blått fargestoff eksklusjon.

7. Representant Resultater:

Den cellulære fraksjoner av vaginal lavage væske fra> 4-dagers inokulert mus består typisk av Candida, epitelceller og cellulære infiltrerer (figur 5). Ved våt-mount mikroskopi, kan Candida være visuelt identifisert ved tilstedeværelsen av hyfer samt gjær (Figur 5A). Smear preparater av vaginal lavage fluid kan farges med Papanicolaou teknikken for å undersøke epitelceller og infiltrerende leukocytter, hvorav de viktigste cellene er nøytrofile granulocytter identifisert av tri-Nuclear lobes (Figur 5B). Svært få nøytrofile, om noen, er påvist i uninoculated mus (figur 5C) 41.

Et eksempel på vaginal soppbyrden er vist i Figur 6. Vaginal lavage fluid samles på bestemte tidspunkter dyrkes for CFU telling (Figur 6A). Vaginal kolonisering / infeksjon med Candida vedvarer i uker i østrogen-behandlet inokulert mus (Figur 6B), mens Candida unnlater å etablere vaginal kolonisering i ikke-østrogen-behandlede inokulert mus (Figur 6C). Østrogen-behandlet uninoculated mus forblir negativ for Candida hele tiden (data ikke vist). I tillegg kan vaginal lavages utføres enten én gang på separate mus ved hvert tidspunkt eller lengderetning i samme mus i narkose.

Den lumbar lymfeknuter er de primære drenering lymfeknutene av kjønnsorganer og de mest relevante området for å evaluere for systemisk immunreaksjoner til en vaginal utfordring. NOTE at disse lymfeknutene kan bli utvidet i inokulert mus mens de vanligvis vises ganske små i uninoculated mus. Leukocytter cellular inngang vanligvis strekker seg fra 8 × 10 5 / uninoculated mus til 5 × 10 6 / inokulert mus. I tillegg til lumbar lymfeknuter, kan inguinal, poplitea og mesenteriale lymfeknuter også brukes.

Figur 1
Figur 1. Vaginal inokulering med Candida. A) En mus behersket for inokulasjon. Musen er plassert på en wire buret inn og holdes ved haleroten, litt oppover for å løfte beina og avsløre skjedeåpningen. Hoften på musen kan stabiliseres med samme hånd som den forsøker å motstå halen tilbakeholdenhet. B) Innføring av podestoff til vaginal lumen. En pipette tips er forsiktig inn ca 5 mm dypt inn i skjeden lumen. Suspensjonen podestoff blir deretter deponert.


Figur 2. Vaginal vev utvinning. AB) Utvinning av livmorhalsen. Livmorhalsen ligger med bøyd pinsett og eksponert utad gjennom vaginal hulrom. Så snart ut av vaginal hulrom, er livmorhalsen ytterligere trekkes utover å fullt utsette vagina. C) Utvinning av vagina. Skjeden er excised av vulva med saks. Når frittliggende, fjerne cervix fra skjeden.

Figur 3
Figur 3. Identifikasjon av lumbar lymfeknuter. Plasseringen av lumbar lymfeknutene blant de omkringliggende organer / blodårer i nærheten av bekken er indisert. A, abdominal aorta. B, urinblæren. C, felles bekkenarterien. Jeg, tarmer. L, leveren. R, rektum. S, milt. U, Livmorframfall.

Figur 4
Figur 4. Lumbar lymfeknuter plassert på en netting skjerm. Lymfeknutene er samlet inn på skjermen plassert i en petriskål med HBSS. Lymfeknutene er presset mot skjermen med en sprøytestempelet å få lymfoide celler i encellede suspensjoner.

Figur 5
Figur 5. Cellular fraksjoner av vaginal lavage væske fra inokulert mus. A) Våt-mount og B) celleprøve preparater av vaginal lavage prøver samlet fire dager etter vaksinasjon og C) fra uninoculated mus. Bildene blir vist på 1000 × (A) eller 400 × (B, C) forstørrelse. Innsatsen i B viser den kjernefysiske morfologi av vaginal nøytrofile på 1000 ×. Candida gjær (Y) og hyfer (H), epitelceller (EC) og neutrohils (N) er angitt.

Figur 6
Figur 6. Detection av vaginal soppbyrden. A) Representant C. albicans kolonier vokst på en SDA plate. Neat (N) lavage prøver fra seks forskjellige inokulert mus (øverste rad) var serielt utvannet og kultivert for CFU telling. B) Kvantifisering av vaginal soppbyrden i østrogen-behandlet og C) ikke-østrogen-behandlede mus. CFU/100 mL av lavage væske fra inokulert mus ble vurdert på angitt tidspunkt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En eksperimentell mus modell av Candida vaginitt er etablert og historisk brukt de siste tiårene for å studere slimhinnene vert reaksjon på Candida samt for testing soppdrepende terapi 3,4,11,13,16,17,19,21,24, 25,37. Protokollene som presenteres her innlemme effektiv og mindre arbeidskrevende metoder, og synes å være en av de mest optimaliserte modell systemer av Candida vaginitt beskrevet hittil. Disse teknikkene muliggjøre rask kvantifisering av soppbyrden og innsamling av vaginale prøver. Videre tidligere studier teste flere haplotypic stammer av mus (n = 13) og ulike tidspunkter etter vaksinasjon viste tilsvarende nivåer av variasjon i soppbyrden og vert svar på vaginal kolonisering med Candida 2,6,41. Derfor kan denne modellen tilpasses eksisterende protokoller uten restriksjoner på musestammer eller varigheten av infeksjonen. Imidlertid bør man erkjenne atvariabilitet i vaginal soppbyrden kan være høyt mellom dyr får samme podestoff (Figur 6B). Det er bevis som støtter at variasjon oppstår på grunn av ulik grad av tidlig tilslutning til vaginal Epitel 41. Derfor er 70-10 mus / gruppe foreslo for statistiske formål.

Variasjon i vaginal soppbyrden har også blitt dokumentert mellom ulike stammer av C. albicans, tyder på at ikke alle stammer av C. albicans har kapasitet til lignende kolonisere musen vagina. For eksempel, C. albicans 3153A (lab stamme) som brukes i denne protokollen har blitt rapportert å vise større vaginal kolonisering enn SC5314 (klinisk isolat), hvor en høyere podestoff (> en log) ville være nødvendig for å oppnå tilsvarende nivåer av vaginal soppbyrden sett med 3153A 27. Faktisk har en svært variabel vaginal kolonisering med flere kliniske isolater er det dokumentert 36. Derfor bør forsiktighet takno når man skal avgjøre en optimal podestoff for hver C. albicans belastning å sikre konsekvent kolonisering hos mus. Vanligvis mener CFUs fra 5 x 10 4 til 5 x 10 5 / 100 mL lavage fluid bør bli oppdaget for konsekvent kolonisering. For vurdering av vaginal soppbyrden er kvantifisering av CFUs ved lavages passende for denne modellen som Candida blastoconidia og hyfer normalt ikke trenge utover det overflatiske lag av vaginal Epitel. Våre tidligere histologiske vurdering av post-lavage vaginal vev sjelden viste rester av Candida 25,41. Imidlertid erkjenner vi muligheten for at hyfer kunne være miscounted som de vokser som en enkelt koloni på agar plate og kanskje ikke gjenspeiler nøyaktige soppbyrden. Som en alternativ metode til CFU opplisting, en nylig utviklet in vivo imaging teknikken har blitt rapportert å kunne vurdere vaginal soppbyrden ved bruk av genmanipulerte selvlysende C. albicans 9,29. Videre kan protokollen endres til å indusere C. glabrata koloniseringen i diabetiske dyr 15,20. Til dags dato har musemodeller for andre ikke-C. Albicans-induced vaginitis ikke blitt rapportert.

Østrogen administrasjon er kritisk for denne modellen, initiere robust vaginal kolonisering med Candida 6,14,23. I tillegg til subkutan injeksjon av østradiol i sesamolje suspensjon, injeksjon av vannløselige østradiol i PBS og intradermal implantasjon av en kontrollert frisetting estradiol pellet er alternative metoder for østrogen administrasjon og har vært ansatt i andre mus modeller av kvinnelige kjønnsorgan infeksjoner 10 , 35 år. Krav til høy østrogen i denne modellen kan forklares av to fysiologiske faktorer. Det ene er at forhøyet østrogen fremmer lagdeling av vaginal Epitel 5,8,30. Fortykket epitel fra økt epiteliale celleproliferasjon kan alleow Candida å få bedre tilslutning til vaginal veggen og etterfølgende kolonisering. Dernest er vaginale epitelceller kjent for å ha høy glykogen innhold. En økt vev østrogen nivå resulterer i nedfall av glykogen i vaginal veggene 30. Forhøyet glykogen i vaginal mikromiljøet kan i sin tur gi Candida å blomstre ved å gi ekstra næringsstoffer. Forrige immune analyser viste at eksogene østrogen ikke påvirker celle adhesjonsmolekyl uttrykk 40. En ulempe å behandle dyr med eksogene østrogen er at forhøyet østrogen har også vært kjent for å fremme overvekst av vaginal commensal flora 30. Siden sammensetningen av flora kan variere betydelig mellom dyr, kan dette legge en variabel hvor commensal organismer kunne påvirke Candida vekst eller modulate host svar. I betraktning av dette problemet, krever modellen østrogen-behandlet kontroll (uninoculated) dyrene skal inkluderes ialle eksperimenter og analysert parallelt.

I denne mus modell kan effekten av anti-fungal agenter nøyaktig vurdert av protokollene beskrevet her, som kan gi avgjørende in vivo testing fører til utvikling av potensialet terapi for klinisk bruk. Faktisk har den robuste natur modellen gode indikasjoner på klinisk effekt. I tillegg til bruk av østrogen, fremmer nøytral vaginal pH i mus vekst av hyfer, en sykdomsfremkallende form av Candida sett i alle inokulert mus. Tilsvarende kliniske observasjoner, oppstår det en robust vaginal nøytrofile migrasjon i en undergruppe av mus uten å påvirke soppbyrden 31,41. Tilstedeværelsen av nøytrofile er fremtredende hos kvinner under symptomatisk vaginitt og synes å parallelle mus følgende inokulasjon 12,41. Siden andre kliniske symptomer (dvs. kløe, hevelse) kan ikke presist målbare i mus, vurdering av vaginal nøytrofilefungerer som en enkel og pålitelig indikasjon på betennelse (symptomer) i denne modellen.

Den mikroskopi av vaginal lavage fluid vist i figur 5 er rutinemessig utført i vårt laboratorium for å vurdere Candida kolonisering og vaginal inflammasjon. Videre kan hyphal scoring også brukes som et mål på infeksjon. Deretter kan de cellulære og løselige fraksjoner av lavage fluid bli bevart og Cryo-arkiveres for framtidige analyser. Av notatet er en fordelaktig egenskap ved protokollen som vaginal lavages kan utføres lengderetningen i samme mus i narkose. Våre tidligere studier bekreftet at langsgående evalueringen ikke påvirker vurderingen av vaginal soppbyrden. Denne tilnærmingen er spesielt fordelaktig i tilfeller der langsgående analyser av infeksjon er ønsket.

Endelig har vi utviklet en mindre invasiv excision metode for vagina. Denne effektive og raske teknikk krever ingen inngrep imagen eller noen indre organer, slik at resten av genital tract intakt. En annen nyttig funksjon i denne modellen er mangelen på krav om immunsuppressive midler til å initiere Candida kolonisering. Dette er spesielt viktig fordi opprettholde naturlig immun status på verten er en kritisk del av immunologiske studier og vert svar på en mikrobiell utfordring. Derfor kunne vev og celler isolert av disse metodene brukes i forskjellige in vitro immune analyser.

I konklusjonen, tilbyr vi flere viktige funksjoner og representative resultatene av den eksperimentelle modellen av vaginal candidiasis. I tillegg til C. albicans-indusert vaginitt, har infeksjoner av andre patogener av de kvinnelige nedre kjønnsorgan, inkludert Neisseria gonorrhoeae, Trichomonas vaginalis og Herpes simplex virus blitt studert ved hjelp av musen modeller hvor organismer er intravaginally introdusert i hormon-behandlede mus 1,7,10,22,26,35,38. Derfor kan de teknikker som er nyttige for studier med Candida vaginitt påføres og potensielt fremme metoder for å studere patogenese og vert immunresponser for andre smittsomme sykdommer i kvinnelige nedre kjønnsorgan.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklært.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av R01 AI32556 (NIAID, National Institute of Health). Dette arbeidet ble også støttet delvis av Louisiana Vaccine Center og South Louisiana Institute for Infectious Disease Research sponset av Louisiana Board of Regents.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Female CBA/J mice Charles River Laboratories 01C38 5-6 weeks of age
Candida albicans (3153A) National Collection of Pathogenic Fungi, UK NCPF3153
Sesame oil Sigma-Aldrich S3547 D–s not need to be pre-sterilized before use
Β-estradiol 17-valerate Sigma-Aldrich E1631 0.1-0.5mg in sesame oil
Phytone peptone BD Biosciences 211906 Supplement with 0.1% glucose
Trypan blue solution Sigma-Aldrich T8154
Sabouraud dextrose agar BD Biosciences 211584
Collagenase type IV Sigma-Aldrich C5138 0.25%
Dispase Invitrogen 17105-041 1.7 U/ml
Wire mesh screens TWP 060X060S0065W36T No. 60 mesh, stainless
Hanks’ balanced salt solution Invitrogen 24020-117
CytoPrep fixative Fisher Scientific 12-570-10 Preserves smear slides
Papanicolaou stain EA-65 EMD Millipore 7054X-85
Papanicolaou stain OG-6 EMD Millipore 7052X-85
Harris’ Alum hematoxylin EMD Millipore 638A-85
Isoflurane Baxter Internationl Inc. NDC 10019-773-60 Used with isoflurane vaporizer or in a drop system closed anesthetic chamber

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abraham, M. C. Inducible immunity to Trichomonas vaginalis in a mouse model of vaginal infection. Infect. Immun. 64, 3571-3571 (1996).
  2. Black, C. A. Major histocompatibility haplotype does not impact the course of experimentally induced murine vaginal candidiasis. Lab. Anim. Sci. 49 (6), 668-668 (1999).
  3. Black, C. A. Acute neutropenia decreases inflammation associated with murine vaginal candidiasis but has no effect on the course of infection. Inf. Immun. 66, 1273-1273 (1998).
  4. Black, C. A. Increased severity of Candida vaginitis in BALB/c nu/nu mice versus the parent strain is not abrogated by adoptive transfer of T cell enriched lymphocytes. J. Reprod. Immunol. 45, 1-1 (1999).
  5. Buchannan, D. L. Role of stromal and epithelial estrogen receptors in vaginal epithelial proliferation, stratification, and cornification. Endocrinology. 139 (10), 4345-4345 (1998).
  6. Clemons, K. V. Genetic susceptibility of mice to Candida albicans vaginitis correlates with host estrogen sensitivity. Infect. Immun. 72, 4878-4878 (2004).
  7. Conrady, C. D., Halford, W. P., Carr, D. J. Loss of the type I interferon pathway increases vulnerability of mice to genital Herpes simplex virus 2 infection. J. Virol. 85 (4), 1625-1625 (2011).
  8. Cunha, G. R., Cooke, P. S., Kurita, T. Role of estromal-epithelial interaction in hormonal responses. Arch Histol Cytol. 67 (5), 417-417 (2004).
  9. Enjalbert, B. A multifunctional, synthetic Caussia princeps luciferase reporter for live imaging of Candida albicans infections. 77 (11), 4847-4847 (2009).
  10. Feinen, B. Critical role of Th17 responses in a murine model of Neisseria gonorrhoeae genital infection. Mucosal Immunol. 3 (3), 312-312 (2010).
  11. Fidel, P. L. Distinct protective host defenses against oral and vaginal candidiasis. Med. Mycol. 40, 359-359 (2002).
  12. Fidel, P. L. An intravaginal live Candida challenge in humans leads to new hypotheses for the immunopathogenesis of vulvovaginal candidiasis. Infect. Immun. 72, 2939-2939 (2004).
  13. Fidel, P. L., Cutright, J. L., Sobel, J. D. Efficacy of D0870 treatment of experimental Candida vaginitis. Antimicrob. Agents. Chemother. 41, 1455-1455 (1997).
  14. Fidel, P. L., Cutright, J. L., Steele, C. Effects of Reproductive hormones on experimental vaginal candidiasis. Infect. Immun. 68, 651-651 (2000).
  15. Fidel, P. L. A murine model of Candida glabrata vaginitis. J. Inf. Dis. 173, 425-425 (1996).
  16. Fidel, P. L. Analysis of vaginal cell populations during experimental vaginal candidiasis. Inf. Immun. 67, 3135-3135 (1999).
  17. Fidel, P. L., Lynch, M. E., Sobel, J. D. Candida-specific cell-mediated immunity is demonstrable in mice with experimental vaginal candidiasis. Infect. Immun. 61, 1990-1990 (1993).
  18. Fidel, P. L., Sobel, J. D. Immunopathogenesis of recurrent vulvovaginal candidiasis. Clin. Microbiol. Rev. 9. 9, 335-335 (1996).
  19. Fidel, P. L., Sobel, J. D. Murine Models of Candida Vaginal Infections, In Experimental models in antimicrobial chemotherapy. Zak, O., Sande, M. , 2nd ed, Academic Press Ltd. London, UK. 741-748 (1999).
  20. Fidel, P. L., Vazquez, J. A., Sobel, J. D. Candida glabrata: Review of epidemiology, pathogenesis, and clinical disease with comparison to C. albicans. Clin. Microbiol. Rev. 12, 80-80 (1999).
  21. Fulurija, A., Ashman, R. B., Papadimitriou, J. M. Neutrophil depletion increases susceptibility to systemic and vaginal candidiasis in mice, and reveals differences between brain and kidney in mechanisms of host resistance. Microbiology. 142, 3487-3487 (1996).
  22. Gill, N. NK cells require type I IFN receptor for antiviral responses during genital HSV-2 infection. Cell Immunol. 269 (1), 29-29 (2011).
  23. Hamad, M., Abu-Elteen, K. H., Ghaleb, M. Estrogen-dependent induction of persistent vaginal candidosis in naive mice. Cell. Immunol. 47 (7), 304-304 (2004).
  24. Hamad, M. Utility of the oestrogen-dependent vaginal candidosis murine model in evaluating the efficacy of various therapies against vaginal Candida albicans infection. Mycoses. 49 (2), 104-104 (2006).
  25. LeBlanc, D. M., Barousse, M. M., Fidel, P. L. A role for dendritic cells in immunoregulation during experimental vaginal candidiasis. Infect. Immun. 74, 3213-3213 (2006).
  26. McGrory, T., Garber, G. E. Mouse intravaginal infection with Trichomonas vaginalis and role of Lactobacillus acidophilus in sustaining infection. Infect. Immun. 60, 2375-2379 (1992).
  27. Naglik, J. R., Fidel, P. L., Odds, F. C. Animal models of mucosal Candida infection. FEMS. Microbiol. Lett. 283 (2), 129-129 (2008).
  28. Nomanbhoy, F. Vaginal and oral epithelial cell anti-Candida activity. Inf. Immun. 70, 7081-7081 (2002).
  29. Pietrella, D. A beta-glucan-conjugate vaccine and anti-beta-glucan antibodies are effective against murine vaginal candidiasis as assessed by a novel in vivo imaging technique. Vaccine. 28 (7), 1717-1717 (2010).
  30. Redondo-Lopez, V., Cook, R. N., Sobel, J. D. Emerging role of Lactobacilli in the control and maintenance of the vaginal bacterial microflora. Rev Infect Dis. 12 (5), 856-856 (1990).
  31. Saavedra, M. Local production of chemokines during experimental vaginal candidiasis. Inf. Immun. 67, 5820-5820 (1999).
  32. Sobel, J. D. Pathogenesis and epidemiology of vulvovaginal candidiasis. Ann. N. Y. Acad. Sci. 544, 547-547 (1988).
  33. Sobel, J. D. Pathogenesis and treatment of recurrent vulvovaginal candidiasis. Clin. Infect. Dis. 14, Suppl 1. S148-S153 (1992).
  34. Sobel, J. D. Vulvovaginal candidiasis: Epidemiologic, diagnostic, and therapeutic considerations. Am. J. Obstet. Gynecol. 178 (2), 203-203 (1998).
  35. Song, W. Local and humoral immune responses against primary and repeat Neisseria gonorrhoeae genital tract infections of 17β-estradiol-treated mice. Vaccine. 26, 5741-5741 (2008).
  36. Taylor, B. N. In vivo virulence of Candida albicans isolates causing mucosal infections in people infected with the human immunodeficiency virus. J. Infect. Dis. 182, 955-955 (2000).
  37. Taylor, B. N., Saavedra, M., Fidel, P. L. Local Th1/Th2 cytokine production during experimental vaginal candidiasis. Med. Mycol. 38, 419-419 (2000).
  38. Tirabassi, R. S. A mucosal vaccination approach for herpes simplex virus type 2. Vaccine. 29 (5), 1090-1090 (2011).
  39. Broeck, W. V. anden, Derore, A., Simoens, P. Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: descriptive and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice. J. Immunol. Methods. 312 (1-2), 12-12 (2006).
  40. Wormley, F. L., Chaiban, J., Fidel, P. L. Cell adhesion molecule and lymphocyte activation marker expression during experimental vaginal candidiasis. J. Immunol. Methods. 69, 5072-5072 (2001).
  41. Yano, J. Epithelial cell-derived S100 calcium-binding proteins as key mediators in the hallmark acute neutrophil response during Candida vaginitis. Infect. Immun. 78 (12), 5126-5126 (2010).

Tags

Immunologi , Vaginitt mus lumbar lymfeknuter vaginal vev vaginal lavage
Protokoller for Vaginal Inokulasjon og Prøvetaking i Experimental mus modell av<em> Candida</em> Vaginitt
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yano, J., Fidel, Jr., P. L.… More

Yano, J., Fidel, Jr., P. L. Protocols for Vaginal Inoculation and Sample Collection in the Experimental Mouse Model of Candida vaginitis. J. Vis. Exp. (58), e3382, doi:10.3791/3382 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter