Summary
Tecniche di chiave da utilizzare nella valutazione dei
Abstract
Candidosi vulvovaginale (VVC), causate da Candida specie, è una infezione fungina del basso tratto genitale femminile che colpisce circa il 75% delle donne in buona salute durante i loro anni riproduttivi 18,32-34. I fattori predisponenti comprendono l'uso di antibiotici, il diabete non controllato e disturbi dei livelli degli ormoni riproduttivi dovuti alla gravidanza, contraccettivi orali o terapia ormonale sostitutiva 33,34. VVC ricorrente (RVVC), definita come tre o più episodi l'anno, colpisce un separato da 5 a 8% delle donne senza fattori predisponenti 33.
Un modello murino sperimentale di VVC è stato istituito e utilizzato per studiare la patogenesi e la risposta dell'ospite mucose da Candida 3,4,11,16,17,19,21,25,37. Questo modello è stato utilizzato per testare potenziali terapie antifungine in vivo 13,24. Il modello prevede che gli animali sono mantenuti in uno stato di optare per pseudoestrusIMAL Candida colonizzazione / infezione 6,14,23. In tali condizioni, gli animali vaccinati avranno rilevabili vaginale carica fungina per settimane o mesi. Studi precedenti mostrano un parallelo estremamente elevata tra il modello animale e infezione umana rispetto alla proprietà immunologiche e fisiologiche 3,16,21. Le differenze, tuttavia, sono la mancanza di Candida come normale flora vaginale e un pH neutro vaginale nei topi.
Qui, dimostrano una serie di metodi chiave del modello vaginite mouse che includono l'inoculazione vaginale, la raccolta rapida di campioni vaginali, la valutazione del peso vaginale da funghi, e preparati per l'estrazione dei tessuti cellulari / isolamento. Questo è seguito da risultati rappresentativi per i componenti del liquido di lavaggio vaginale, carica fungina e drenaggio linfatico rendimenti dei leucociti nodo. Con l'uso degli anestetici, i campioni di lavaggio possono essere prelevati in punti più tempo sui topi stessi per la valutazione longitudinaleinfezione / colonizzazione. Inoltre, questo modello non necessita di farmaci immunosoppressori per avviare l'infezione, permettendo studi immunologici in condizioni definite serie. Infine, il modello e ogni tecnica introdotta qui potrebbe potenzialmente dar luogo ad utilizzare le metodologie per esaminare altre malattie infettive del basso tratto genitale femminile (batteriche, parassitarie, virali) e le rispettive difese dell'ospite locale o sistemica.
Protocol
1. Inoculazione vaginale con Candida albicans
- Tre giorni prima dell'inoculazione, mentre frenare l'animale per esporre l'addome, iniettare 100 ml di olio di sesamo contengono 0,1-0,5 mg di β-estradiolo per via sottocutanea nella parte inferiore dell'addome. Avanzare l'ago di circa 5 a 10 mm laterale alla pelle per ridurre la dispersione dal sito di iniezione.
La somministrazione sottocutanea di estrogeni nel basso addome è ottimale in questo modello a causa della prossimità del tratto genitale. Dosi efficaci possono variare da ceppi di topi, di età o derivati degli estrogeni. In studi precedenti con CBA-J (H-2 κ), C3H/HeN (H-2 κ), C57BL / 6 (H-2 b), Balb / c (H-2 d), DBA / 2 (H- 2 d), SJL (H-2 s) i topi a 6-8 settimane di età, 0,1 mg/100 microlitri è stato trovato efficace evidenziato da ispessimento della parete vaginale, riduzione muco vaginale eaumentata desquamazione delle cellule epiteliali. I topi trattati con estrogeni sopra a questa concentrazione mostra coerente colonizzazione vaginale da Candida. Per l'inoculazione in topi di altri ceppi e le età, uno studio pilota si raccomanda di garantire l'efficacia degli estrogeni nelle condizioni modificate e aumentare la dose di estrogeni, se necessario.
La soluzione estrogeni deve essere preparata fresca ogni volta il giorno di iniezione. Per garantire una completa solubilizzazione di estrogeni in olio di sesamo, mescolare la soluzione con un vortex e calore ad intermittenza a 37 ° C. Ripetere l'iniezione settimanale per tutto il periodo di studio. - Per preparare l'inoculo, aggiungere un un'ansata di C. albicans blastoconidia da una preparazione sottocultura recente su Sabouraud-destrosio agar (SDA) in 10 ml di brodo peptone Phytone-integrato con 0,1% di glucosio. Incubare il brodo di cultura di fase stazionaria per 18 ore a 25 ° C in un bagno d'acqua agitazione.
- Dopo l'incubazione, raccogliere °e brodo di cultura in un tubo da 15 ml e centrifugare a 800 xg per 5 minuti. Lavare il pellet due volte con PBS sterile.
- Enumerare blastoconidia possibili in un emocitometro per esclusione trypan colorante blu. Regolare la concentrazione cellulare a 2,5 x 10 6 / ml (o ad una concentrazione di inoculo desiderato) in PBS sterile.
- Per stabilizzare il mouse, tenere la base della coda con due dita e sollevare l'anca verso l'alto in modo che l'apertura vaginale volti verso di voi (Figura 1A). E 'ideale se il mouse è posizionato su una superficie piana grattugiato (es. gabbia in alto) in modo che il mouse in grado di fornire la resistenza contro la coda di moderazione.
- Pipettare 20 l (o un volume desiderato non superiore a 20 l), della sospensione di inoculo inserendo la punta della pipetta di circa 5 mm di profondità nel lume vaginale (Figura 1B). Completare questo passaggio il più velocemente e delicatamente possibile per ridurre al minimo disagio nel topo.
2. Lavaggi vaginali
- A seguito di eutanasia (o anestesia), hvecchio con il mouse verso il basso dalla base della coda con due dita in modo che l'apertura vaginale diventa esposti.
- Lavaggio del lume vaginale con l'introduzione di 100 l di PBS sterile con l'aspirazione ripetute e agitazione con la punta della pipetta. La punta della pipetta può ostruirsi con le cellule. In questo caso, dispensare le cellule ostacolando e continuare con le restanti lavaging PBS nella vagina. Raccogliere il liquido di lavaggio in una provetta.
- In alternativa, lavaggi vaginali può essere eseguito su topi anestetizzati con isoflurano anestesia inalanti. Per questo, esporre i topi di vaporizzato isoflurano fino a quando non sono completamente sedato (~ 30 sec.). Tenere il mouse verso il basso dalla base della coda e delicatamente lavaggio del lume vaginale usando 50 ml di PBS sterile. Assicurati di evitare l'agitazione dura con un puntale per minimizzare il trauma alla vagina durante questa procedura. Topi sedati dovrebbe recuperare dall'anestesia entro 30 secondi di esposizione all'aria ambiente.
Isofluranopossono essere vaporizzati con un vaporizzatore isoflurano e O 2 (preferito) o un sistema standard di camera chiusa goccia anestetico senza il sistema vaporizzatore (richiede uno stretto monitoraggio degli animali, mentre sedato per evitare difficoltà respiratorie).
Lavaggi vaginali in topi anestetizzati dovrebbe essere il metodo di scelta per i campioni longitudinali lavanda sui topi stessi. Lavaging consecutivi non influire sulla valutazione della carica fungina nel corso del tempo 41.
- Per umido-mount preparazioni, 10 ml di trasferimento del liquido di lavaggio su un vetrino e osservare con ingrandimento 400-1000x al microscopio ottico. Inoltre, le frazioni cellulari del liquido di lavaggio può essere macchiato di esaminare morfologia cellulare e nucleare. Per i preparati striscio, 10 ml di trasferimento del liquido di lavaggio su un vetrino e delicatamente diffondere tramite la parete esterna di un puntale. Conservare i campioni di striscio con fissativo CytoPrep e macchiare con la tecnica standard di Papanicolaou (Pap test). Osservare a 400 × ingrandimento al microscopio ottico.
3. Quantificazione del peso vaginale da funghi
- In un ben 96 round-piastra inferiore, trasferire il liquido di lavaggio in un pozzo della riga superiore e 180 ml di PBS sterile nelle seguenti 5 pozzi di quella colonna (la piastra).
- Fai 1:10 diluizioni seriali di liquido di lavaggio vaginale, trasferendo i 20 ml di liquido al pozzo successivo nella colonna. Mescolare accuratamente per aspirazione ripetuta prima di ogni trasferimento. Diluizioni seriali fino a 12 campioni di lavaggio (una riga completa orizzontale) possono essere eseguite contemporaneamente, utilizzando una pipetta a 12 canali.
- A partire dalla diluizione più basso, il trasferimento di 10 ml di campione su Sabouraud-destrosio agar (SDA). Placcatura di un massimo di 36 campioni possono essere eseguite su 1 piastra con SDA preparato in piazza piastre di Petri con griglia regolabile e una pipetta multicanale spaziatura.
- Enumerare le unità formanti colonia (CFU), dopo incubazione a 34 ° C fo 48 h.
4. Estrazione del tessuto vaginale
- Seguendo la procedura lavanda vaginale, giaceva il mouse eutanasia sul dorso e saturare la zona inguinale con il 70% di etanolo. Utilizzando un paio di pinze, sollevare l'orifizio urinario verso l'alto in modo che l'apertura vaginale diventa esposti.
- Inserire un paio di pinze curve nel lume vaginale e individuare il collo dell'utero. Pur mantenendo una salda presa con la pinza, estrarre il collo dell'utero attraverso la cavità vaginale (Figura 2A-C).
- Accise la vagina alla base dell'apertura vaginale e quindi rimuovere il collo dell'utero dalla vagina con le forbici chirurgiche. Tenete presente che il tessuto vaginale è involuta (lato interno epitelio della vagina è esposta verso l'esterno). Il tessuto può essere invertita lateralmente per mantenere l'orientamento originale della vagina o aperto in un foglio facendo una incisione laterale.
Asportati tessuti vaginali possono essere utilizzati per 1) l'estrazione dei linfociti collage seguentidigestione nase (~ 1 × 10 4 / mouse) 40, 2) isolamento delle cellule epiteliali dopo digestione dispasi (~ 5 × 10 4 / mouse) 28, 3) i preparati congelati o inclusi in paraffina per le analisi istologiche 25.
5. Lombare linfa escissione nodo
- Seguendo la procedura lavanda vaginale, giaceva il mouse eutanasia sul dorso e saturare l'addome con il 70% di etanolo. Effettuare una incisione laterale a partire dal basso ventre al petto ed esporre gli organi interni. Usando un paio di pinze con entrambe le mani, spostare l'intestino verso l'alto in modo che i vasi sanguigni diventano visibili centrale.
- Individuare la vena cava inferiore e aorta addominale. Normalmente, un paio di linfonodi lombari possono essere identificati adiacente alla aorta addominale, che si trova circa a metà strada tra l'origine delle arterie iliache renali e comuni 39. Questi linfonodi possono essere visivamente distinti da tessuto adiposo dalla texture elasticae sono più leggeri e più opaco di colore rispetto al tessuto adiposo (Figura 3). Questi linfonodi sono notevolmente più grandi di animali infetti rispetto agli animali non inoculata.
- Accise linfonodi mettendo microforceps sotto il nodo e tirare dolcemente fino a separarsi dal tessuto circostante.
6. Isolamento di cellule linfoidi in cella singola sospensioni
- Trasferimento linfonodi su uno schermo sterile rete metallica (circa 3 x 3 cm 2 di dimensioni) posto all'interno di un piatto di vetro Petri sterile contenente circa 10 ml di soluzione salina bilanciata Hanks '(HBSS) (Figura 4).
- Con la capsula di Petri leggermente inclinato, premere i linfonodi contro lo schermo con una testa stantuffo della siringa. Assicurati di rompere tutti i linfonodi in modo che il contenuto cellulare dei nodi passa attraverso lo schermo, mentre il componenti non cellulari dei nodi (cioè le membrane, stroma, grasso) rimangono sullo schermo.
- Utilizzando il pistone stesso e siringa, aspirare tha HBSS cellule contenenti. Lavare lo schermo con ~ 5 ml HBSS e raccogliere il liquido rimanente in un tubo da 15 ml.
- Centrifugare a 800 xg per 10 min. Aspirare qualsiasi depositi di grasso nella parte alta del liquido con una pipetta prima di scartare il liquido. Lavare i pellet tre volte con HBSS. Risospendere il pellet in 1 ml di HBSS ed enumerare cellule vitali per esclusione trypan colorante blu.
7. Rappresentante dei risultati:
Le frazioni cellulari del liquido di lavaggio vaginale da> 4 giorni topi inoculati tipicamente costituiti da Candida, le cellule epiteliali e infiltrati cellulari (Figura 5). Da bagnato-mount microscopia, Candida può essere visivamente identificato dalla presenza di ife e lieviti (Figura 5A). Preparazioni striscio vaginale di liquido di lavaggio può essere colorato con Papanicolaou tecnica per esaminare le cellule epiteliali e leucociti infiltranti, di cui le cellule principali sono neutrofili identificati dal tri-nuclelobi ar (Figura 5B). Neutrofili molto pochi, se del caso, vengono rilevati nei topi non inoculate (Figura 5C) 41.
Un esempio di peso vaginale da funghi è mostrato in Figura 6. Liquido di lavaggio vaginale raccolti in punti temporali specifici sono coltivate per il conteggio CFU (Figura 6A). Colonizzazione vaginale / infezione da Candida persiste per settimane nei topi inoculati estrogeno-trattati (Figura 6B), mentre Candida non riesce a stabilire la colonizzazione vaginale inoculati nei topi non trattati con estrogeni (Figura 6C). Non inoculate nei topi trattati con estrogeni rimane negativo per Candida per tutto il tempo (dati non riportati). Inoltre, lavaggi vaginali possono essere eseguite una sola volta sui topi separati in ogni fase o longitudinalmente nei topi stessi sotto anestesia.
I linfonodi lombari sono i nodi principali linfodrenante del tratto genitale e il sito più rilevanti per la valutazione sistemica per la risposta immunitaria a una sfida vaginale. Note che questi linfonodi possono diventare allargata nei topi inoculati mentre normalmente appaiono abbastanza piccola non inoculate nei topi. Recuperi cellulare dei leucociti in genere varia da 8 × 10 5 mouse / non inoculate fino a 5 × 10 6 mouse / inoculato. Oltre ai linfonodi lombari, linfonodi inguinali, popliteo e mesenterici può anche essere usato.
Figura 1. Inoculazione vaginale da Candida. A) Un mouse trattenuto per l'inoculazione. Il mouse è posizionato su un inserto gabbietta e detenute dalla base della coda, leggermente verso l'alto per sollevare le gambe ed esporre l'apertura vaginale. L'anca del mouse può essere stabilizzata con la stessa mano che tenta di resistere alla moderazione coda. B) Introduzione di inoculo nel lume vaginale. Il puntale è delicatamente inserito circa 5 mm di profondità nel lume vaginale. L'inoculo sospensione viene poi depositato.
Figura 2. Estrazione del tessuto vaginale. AB) Estrazione della cervice. La cervice si trova con una pinza ricurva ed esposta verso l'esterno attraverso la cavità vaginale. Una volta fuori della cavità vaginale, il collo dell'utero è ulteriormente tirato verso l'esterno per esporre completamente la vagina. C) Estrazione della vagina. La vagina è asportato dalla vulva con le forbici. Una volta staccato, rimuovere il collo dell'utero dalla vagina.
Figura 3. Identificazione dei linfonodi lombari. La posizione dei linfonodi lombare tra gli organi circostanti / vasi sanguigni in prossimità del bacino è indicato. A, aorta addominale. B, della vescica urinaria. C, arteria iliaca comune. Io, intestino. L, fegato. R, retto. S, milza. U, uteri.
Figura 4. I linfonodi lombare posto su uno schermo di rete metallica. I linfonodi sono raggruppati sullo schermo posto in una capsula di Petri con HBSS. I linfonodi sono premuti contro lo schermo con un stantuffo della siringa per ottenere cellule linfoidi in cella singola sospensioni.
Figura 5. Frazioni cellulari di liquido di lavaggio vaginale dai topi inoculati. Pap A) Wet-mount e B) si preparano strisci di campioni lavanda vaginale raccolto 4 giorni dopo l'inoculazione e C) dai topi non inoculata. Le immagini vengono visualizzate a 1000 × (A) o 400 × (B, C) ingrandimento. L'inserto in B mostra la morfologia nucleare dei neutrofili vaginale a 1000 ×. Lievito Candida (Y) e ife (H), cellule epiteliali (CE) e neutrohils (N) sono indicati.
Figura 6. Detectioni di peso vaginale da funghi. A) Rappresentante C. albicans colonie coltivate su un piatto SDA. Neat (N) campioni di lavaggio provenienti da sei diversi tipi di mouse inoculati (riga in alto) sono stati diluiti in serie e coltivate per il conteggio CFU. B) Quantificazione degli vaginale carica fungina nel estrogeno-trattati e C) non estrogeno-topi trattati. Ufc/100 ml di liquido di lavaggio da topi inoculati è stata valutata sui punti di tempo indicato.
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Discussion
Un modello murino sperimentale di vaginite da Candida è stata stabilita e storicamente usato per gli ultimi decenni a studiare la risposta mucosale ospite Candida, nonché per testare le terapie antimicotiche 3,4,11,13,16,17,19,21,24, 25,37. I protocolli presentati qui incorporare efficiente e metodi meno alta intensità di lavoro, e sembrano essere uno dei sistemi modello più ottimizzata di Candida vaginite descritto fino ad oggi. Queste tecniche consentono la quantificazione rapida di carica fungina e la raccolta di campioni vaginali. Inoltre, studi precedenti test haplotypic diversi ceppi di topi (n = 13) e vari momenti post-inoculo hanno mostrato livelli simili di variabilità in carica fungina e le risposte ospitato colonizzazione vaginale da Candida 2,6,41. Quindi, questo modello può essere adattato ai protocolli esistenti senza restrizione ceppi di topi o la durata dell'infezione. Tuttavia, si dovrebbe riconoscere che ilvariabilità vaginale carica fungina può essere alto fra gli animali dato l'inoculo stesso (Figura 6B). Ci sono prove a sostegno che la variabilità si verifica a causa di diversi gradi di adesione presto per epitelio vaginale 41. Pertanto, i topi 7-10 / gruppo è suggerito a fini statistici.
Variabilità vaginale carica fungina è stato anche evidenziato tra diversi ceppi di C. albicans, suggerendo che non tutti i ceppi di C. albicans hanno la capacità di colonizzare la vagina similmente mouse. Per esempio, C. 3153A albicans (ceppo di laboratorio) utilizzati in questo protocollo è stata riportata la colonizzazione vaginale superiore rispetto SC5314 (isolato clinico), dove un inoculo più alto (> un log) sarebbe richiesto per ottenere livelli equivalenti di peso vaginale da funghi visto con 3153A 27. In realtà, una colonizzazione molto variabile vaginale con diversi isolati clinici è stato documentato 36. Quindi, la cura dovrebbe essere takit nel determinare un inoculo ottimale per ogni C. albicans sforzo per garantire la colonizzazione costante nei topi. Tipicamente, la media CFU da 5 x 10 4 a 5 x 10 5 / 100 l liquido di lavaggio devono essere rilevati per la colonizzazione costante. Per la valutazione della carica fungina vaginale, la quantificazione dei CFU da lavaggi è adatto per questo modello come Candida blastoconidia ife e normalmente non penetrano oltre lo strato superficiale di epitelio vaginale. La nostra precedente valutazione istologica dei tessuti vaginali post-lavaggio raramente ha mostrato residuo Candida 25,41. Tuttavia, riconosciamo la possibilità che potrebbe essere ife miscounted man mano che crescono come una singola colonia sulla piastra di agar e potrebbero non riflettere accurato carica fungina. Come metodo alternativo per CFU enumerazione, un recente sviluppo nella tecnica di imaging in vivo è stato segnalato per valutare con successo vaginale carica fungina quando si utilizzano tecniche di ingegneria genetica luminescenti C. albicans 9,29. Inoltre, il protocollo può essere modificato per indurre C. colonizzazione glabrata in animali diabetici 15,20. Fino ad oggi, i modelli del mouse per altri non-C. Albicans indotta vaginite non sono stati segnalati.
La somministrazione di estrogeni è fondamentale per questo modello, l'avvio robusto colonizzazione vaginale da Candida 6,14,23. Oltre ad iniezione per via sottocutanea estradiolo in sospensione olio di sesamo, di idrosolubili impianto estradiolo in PBS e intradermica di un rilascio controllato di estradiolo pellet sono metodi alternativi per la somministrazione di estrogeni e sono stati impiegati in modelli murini di altre infezioni del tratto genitale femminile 10 , 35. Requisito di estrogeni ad alto contenuto di questo modello può essere spiegato da due fattori fisiologici. Uno è che estrogeni favorisce la stratificazione dell'epitelio vaginale 5,8,30. Epitelio ispessito da una maggiore proliferazione delle cellule epiteliali possono tuttiow Candida per ottenere una migliore aderenza alla parete vaginale e conseguente colonizzazione. In secondo luogo, le cellule epiteliali della vagina sono noti per avere alto contenuto di glicogeno. Un aumento del tessuto risultati a livello di estrogeni deposizione di glicogeno nelle pareti vaginali 30. Glicogeno elevata nel microambiente vaginale può a sua volta permettere Candida di fiorire, fornendo ulteriori sostanze nutritive. Precedente analisi immunitaria ha mostrato che gli estrogeni esogeni non ha influenzato l'espressione molecola di adesione cellulare 40. Un inconveniente di trattare gli animali con estrogeni esogeni è che estrogeni inoltre è stato conosciuto per promuovere la crescita eccessiva della flora vaginale commensali 30. Poiché la composizione della flora può variare in modo significativo tra gli animali, questo potrebbe aggiungere una variabile in cui gli organismi commensali potrebbero influenzare la crescita di Candida o modulare le risposte di accoglienza. In considerazione di questo problema, il modello richiede estrogeno-trattati di controllo (non inoculate) gli animali da inserire neltutti gli esperimenti e analizzati in parallelo.
In questo modello murino, l'efficacia di agenti anti-fungini possono essere accuratamente valutati i protocolli descritti nel presente documento, che potrebbe fornire cruciali nei test in vivo che portano allo sviluppo di terapie potenziali per uso clinico. In effetti, la natura robusta del modello fornisce buone indicazioni di efficacia clinica. Oltre all'uso di estrogeni, neutro pH vaginale nei topi favorisce la crescita delle ife, una forma patogena di Candida visto in tutti i topi inoculati. Simile a osservazioni cliniche, una migrazione dei neutrofili robusto vaginale si verifica in un sottogruppo di topi senza intaccare carica fungina 31,41. La presenza di neutrofili è prominente nelle donne durante la vaginite sintomatica e sembra topi parallela a seguito di inoculazione 12,41. Dal momento che altri sintomi clinici (per esempio, prurito, gonfiore) non possono essere precisamente misurabili nei topi, la valutazione dei neutrofili vaginaleserve come indicazione semplice ma affidabile di infiammazione (sintomi) in questo modello.
La microscopia del fluido vaginale lavanda mostrato in Figura 5 è eseguita di routine nel nostro laboratorio per valutare la colonizzazione da Candida e infiammazione vaginale. Inoltre, segnando ifale può essere utilizzato anche come misura di infezione. In seguito, le frazioni cellulari e solubili del liquido di lavaggio può essere conservata e crio-archiviati per future analisi. Da notare, una caratteristica vantaggiosa del protocollo è che lavande vaginali può essere eseguita longitudinalmente nel topo lo stesso sotto anestesia. I nostri studi precedenti hanno confermato che la valutazione longitudinale non influenza la valutazione del peso vaginale da funghi. Questo approccio è particolarmente utile nei casi in cui si desiderano le analisi longitudinali di infezione.
Infine, abbiamo sviluppato un metodo meno invasivo per l'asportazione della vagina. Questa tecnica efficace e veloce non richiede alcuna incisionel'addome o organi interni, lasciando il resto del tratto genitale intatto. Un'altra caratteristica utile di questo modello è la mancanza di necessità di farmaci immunosoppressori per iniziare la colonizzazione da Candida. Ciò è particolarmente importante perché il mantenimento naturale stato immunitario dell'ospite è un aspetto critico di studi immunologici e risposte ospita una sfida microbica. Quindi, tessuti e cellule isolate da questi metodi potrebbero essere applicati in diversi test in vitro del sistema immunitario.
In conclusione, riportiamo alcune caratteristiche importanti e risultati rappresentativi del modello sperimentale di candidosi vaginale. Oltre a C. albicans indotta vaginiti, infezioni da altri patogeni del tratto genitale inferiore femminile, tra cui Neisseria gonorrhoeae, Trichomonas vaginalis e virus herpes simplex sono stati studiati utilizzando modelli murini in cui gli organismi sono introdotti per via intravaginale in topi trattati con ormoni 1,7,10,22,26,35,38. Pertanto, le tecniche utili per gli studi che coinvolgono Candida vaginite possono essere applicati a metodologie e potenzialmente anticipo per studiare la patogenesi e la risposta immunitaria per altre malattie infettive del basso tratto genitale femminile.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da R01 AI32556 (NIAID, National Institute of Health). Questo lavoro è stato sostenuto in parte dalla Louisiana vaccino Centro e Sud della Louisiana Istituto di ricerca sulle malattie infettive promossa dal Consiglio dei Reggenti della Louisiana.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Female CBA/J mice | Charles River Laboratories | 01C38 | 5-6 weeks of age |
| Candida albicans (3153A) | National Collection of Pathogenic Fungi, UK | NCPF3153 | |
| Sesame oil | Sigma-Aldrich | S3547 | D–s not need to be pre-sterilized before use |
| Β-estradiol 17-valerate | Sigma-Aldrich | E1631 | 0.1-0.5mg in sesame oil |
| Phytone peptone | BD Biosciences | 211906 | Supplement with 0.1% glucose |
| Trypan blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Sabouraud dextrose agar | BD Biosciences | 211584 | |
| Collagenase type IV | Sigma-Aldrich | C5138 | 0.25% |
| Dispase | Invitrogen | 17105-041 | 1.7 U/ml |
| Wire mesh screens | TWP | 060X060S0065W36T | No. 60 mesh, stainless |
| Hanks’ balanced salt solution | Invitrogen | 24020-117 | |
| CytoPrep fixative | Fisher Scientific | 12-570-10 | Preserves smear slides |
| Papanicolaou stain EA-65 | EMD Millipore | 7054X-85 | |
| Papanicolaou stain OG-6 | EMD Millipore | 7052X-85 | |
| Harris’ Alum hematoxylin | EMD Millipore | 638A-85 | |
| Isoflurane | Baxter Internationl Inc. | NDC 10019-773-60 | Used with isoflurane vaporizer or in a drop system closed anesthetic chamber |
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