Summary
Bicelles er lipid / amphiphile blandinger, der opretholder membranproteiner (MP) inden for en tolagede men har unikke fase adfærd, der fremmer high-throughput screening ved krystallisation robotter. Denne teknik har med succes produceret en række høj opløsning strukturer fra både prokaryote og eukaryote kilder. Denne video beskriver protokoller for at generere lipidic bicelle blandingen, som omfatter parlamentsmedlemmer i bicelle blandingen, etablering krystalliseringer forsøg (såvel manuelt som robotersvejsede) og høste krystaller fra mediet.
Abstract
Membranproteiner (MP) spiller en afgørende rolle i mange fysiologiske processer som pumpning specifikke molekyler på tværs af de ellers uigennemtrængelige membran tolagede, der omgiver alle celler og organeller. Ændringer i funktionen af parlamentsmedlemmer resultere i mange menneskelige sygdomme og lidelser, og dermed en indviklet forståelse af deres strukturer er stadig et afgørende mål for biologisk forskning. Men strukturen bestemmelse af parlamentsmedlemmer er fortsat en stor udfordring ofte stammer fra deres hydrofobicitet.
Parlamentsmedlemmer har store hydrofobe regioner indlejret i tolagede. Vaskemidler er ofte bruges til at oploest disse proteiner fra tolagede generere et protein-vaskemiddel micelle, som derefter kan manipuleres på samme måde som opløselige proteiner. Traditionelt krystallisering forsøg gå videre ved hjælp af et protein-rengøringsmiddel blanding, men de ofte modstå krystallisering eller fremstille krystaller af dårlig kvalitet. Disse problemer opstår på grund afvaskemiddel manglende evne til at tilstrækkeligt efterligne tolagede resulterer i en dårlig stabilitet og heterogenitet. Hertil kommer, at vandafvisende overflade MP rengøringsmidlet skjolde reducere det areal til rådighed for krystal kontakter. For at omgå disse ulemper parlamentsmedlemmer kan være udkrystalliseret i lipidic medier, som i højere grad simulerer deres endogene miljø, og er for nylig blevet en de novo teknik til MP krystallisation.
Lipidic kubiske fase (LCP) er en tre-dimensionel tolagede gennemtrænges af et sammenhængende system af vandige kanaler 1. Selvom monoolein er lipid valg, har relation lipider som f.eks monopalmitolein og monovaccenin også blevet brugt til at lave LCP 2. Parlamentsmedlemmer er indarbejdet i LCP, hvor de diffuse i tre dimensioner og foder krystal kerner. En stor fordel ved LCP er, at proteinet forbliver i et mere oprindelige miljø, men metoden har en række tekniske ulemper herunder højt viscnysgerrighed (kræver specialiseret apparater) og problemer med krystal visualisering og manipulation 3,4. På grund af disse tekniske vanskeligheder, udnyttede vi en anden lipidic medium for krystallisering-bicelles 5,6 (Figur 1). Bicelles er lipid / amphiphile blandinger dannes ved at blande phosphatidylcholin lipid (DMPC) med en amphiphile (CHAPSO) eller en kortkædede lipid (DHPC). Inden for hver bicelle disk, generere lipid molekyler en tolagede mens amphiphile molekyler linje polære kanterne giver gavnlige egenskaber af både dobbeltlag og rengøringsmidler. Vigtigere er det, under deres overgang temperatur, har protein-bicelle blandinger en reduceret viskositet og manipuleres på samme måde som vaskemiddel-opløst parlamentsmedlemmer, hvilket gør bicelles kompatibel med krystallisering robotter.
Bicelles med succes er blevet brugt til at krystallisere adskillige membranproteiner 5,7-11 (Tabel 1). Denne voksende samlingaf proteiner viser alsidigheden i bicelles for krystalliserende både alfa heliske og beta ark parlamentsmedlemmer fra prokaryote og eukaryote kilder. På grund af disse succeser og enkelheden af high-throughput gennemførelse bør bicelles være en del af hver membran protein crystallographer arsenal. I denne video, beskriver vi de bicelle metode og giver en trin-for-trin-protokol til opsætning af high-throughput krystallisering undersøgelser af renset parlamentsmedlemmer ved hjælp af standard robotteknologi.
Protocol
Bicelle baseret krystallisering består af fire grundlæggende trin (Figur 2): i) forberedelse af en bicelle danne lipid: amphiphile blanding ii) inkorporering af oprenset protein ind i bicelle medium iii) krystallisering forsøg (manuelt eller robot), og iv) visualisering, krystal udvinding og frysning. Disse trin er beskrevet i detaljer nedenfor
1. Udarbejdelse af Bicelles
Bicelles kan dannes i en række forskellige lipid: amphiphile kombinationer og over en bred vifte af koncentrationer. Derfor er betingelser-en indledende komposition baseret på tidligere succesfulde anbefalet (Tabel 1). De mest succesfulde blanding er DMPC: CHAPSO bicelle formulering, som enten kan købes kommercielt som en færdigblandet klar til brug formulering (se tabel af reagenser nedenfor) eller forberedt i laboratoriet som beskrevet. Til denne øvelse vil vi forberede 1 ml 35% DMPC: CHAPSO blanding ved en 2.8:1 molforholdet.
- Den bicelle procentdel kan variere mellem 10% -40% med en DMPC: CHAPSO molforholdet spænder fra 2.6-3.0:1 (Tabel 1).
- Bemærk: Jo højere bicelle koncentration desto sværere er det at opløse lipid resulterer i en højere opløsning viskositet. Dog kan en koncentreret bicelle formulering være en fordel, når det protein koncentrationen er lav.
- Opløse lipid at opnå en homogen løsning kræver en stor indsats, hvilket gør dette skridt er det mest tidskrævende i bicelle-metoden. Cycle gennem følgende trin, indtil DMPC er helt blandet:
- Varm blandingen til ~ 40 ° C ved hjælp af et vandbad eller en inkubator og vortex for ~ 1 minut.
- Bemærk: Efterhånden som flere cyklusser er gennemført, vil opvarmning blandingen resulterer i en gel-lignende conkonsistensen gør det vanskeligt at vortex.
- Afkøl blandingen på is og vortex i et par minutter. Køling hjælper liquefy den løsning, der gør det nemmere at vortex.
- Bemærk: Efterhånden som flere cykler udføres, kan blandingen bliver uklar, når køling.
- Gentag trinene ovenfor (1.2.1 og 1.2.2), indtil lipid er helt opløst.
- Bemærk: Denne proces kan tage flere timer. Bicelle dannelse er angivet ved ændringer i fase opførsel af DMPC: CHAPSO formulering. Ved afslutning, vil blandingen være en klar gel på eller over stuetemperatur og en tyktflydende væske på is.
- Varm blandingen til ~ 40 ° C ved hjælp af et vandbad eller en inkubator og vortex for ~ 1 minut.
- Den bicelle Blandingen er nu klar til brug og kan opbevares ved -20 ° C for langtidsopbevaring (op til 5 år). På grund af risikoen for hydrolyse af phospholipid hovedet gruppe, er det ikke tilrådeligt at opbevare bicelles ved stuetemperatur i længere perioder.
2. Inkorporering af protein i bicelles
De fleste MP strukturer fra bicelles blev udkrystalliseret i DMPC: CHAPSO bicelle koncentration fra 2 til 8% ved hjælp af et protein koncentration på 8 til 12 mg / ml (Tabel 1). Hvis det er muligt, bør initial-skærme anvender disse retningslinjer og yderligere koncentrationer kan screenes på optimering fase. Sammenlignet med LCP-metoden, er protein inkorporering med bicelles en simpel proces (Figur 3), som bør ske samme dag som krystallisering forsøg.
- Optø DMPC: CHAPSO bicelle blanding ved stuetemperatur, indtil den fase, ændres til en klar gel.
- Bemærk: Flere fryse-tø vil ikke påvirke bicelle adfærd.
- Læg blandingen på is til Blødgør og kort vortex for at genetablere en homogen bicelle fase. Når de placeres på is blandingen kan blive uklar.
- Frabout dette punkt på, holder bicelle blandingen og oprenset protein på is. Dette vil holde bicelle i en flydende fase gør det modtagelig for pipettering.
- Tilsæt bicelle blandingen til de rensede vaskemiddel-opløst protein i en 01:04 (V / V) ratio.
- For eksempel: 100 μl protein-bicelle blandingen er fremstillet ved at blande 80 μl protein med 20 μl bicelle. Hvis protein koncentration er 15 mg / ml og bicelle koncentration er 35%, vil dette give en bicelle-indbygget protein blanding med et protein koncentration på 12 mg / ml og en bicelle koncentration på 7%.
- Bland ved forsigtigt at pipettere indholdet op og ned, indtil opløsningen bliver klar og homogen.
- Bemærk: Hvis der kommer bobler, kan en hurtig spin (30-60 sekunder, 13000 rpm, 4 ° C) med en bordplade centrifuge hjælpe med at fjerne dem.
- Inkubér blandingen på is i mindst 30 minutter for at fremme fuldstændig integration af protein into bicelles. Proteinet-bicelle blanding er nu klar til krystallisation forsøg.
3. Opsætning af krystallisering forsøg
Andre lipid krystallisering teknikker som LCP kræver specialudstyr på grund af mediets høje viskositet, men den unikke fase adfærd bicelles tillader implementering i stort set enhver standard krystallisering format herunder robotteknologi (Figur 3). Krystallisering forsøg kan udføres i enten hængende eller siddende drop formater ved hjælp af standard kommercielt tilgængelige skærme.
- Om oprettelsen af bakker manuelt eller ved hjælp af en krystallisering robot, bevare protein-bicelle blandingen på is. Dette vil holde protein-bicelle blandingen koldt og sikre, at opløsningens viskositet er minimal.
- Manuel krystalliseringsprocessen Forsøg - Ved hjælp af en standard pipette, kan protein-bicelle blanding blandes med reservoir løsning på samme måde som normalt udførered for opløselige eller vaskemiddel-opløst membranproteiner.
- Bemærk: Hold protein-bicelle blandingen på is under forsøgene.
- Robotic krystalliseringsprocessen Forsøg - Vi har skræddersyet disse studier for Mosquito krystallisering robotten, men i princippet (efter samme forholdsregler) teknikken bør være kompatibel med alle krystallisering robotter. De følgende tips vil sikre, at protein-bicelle blandingen forbliver køligt og præcist pipetteret af robotten:
- Precool pladen holder protein-bicelle blanding ved at placere den på is.
- Pipette protein-bicelle blandingen i pladen og fortsætte med at holde pladen på is. Denne plade bør være det sidste punkt at gå på robotten, før de påbegynder kørslen.
- Set-up reservoiret bakken og krystallisering låg på platform 3 og 5, af myg robotten.
- Pladen indeholder protein-bicelle blandingen på Platform 4af myg robotten. Dette sikrer protein-bicelle blanding er den sidste til at blive afhentet af robotten, og det er straks frigives.
- For at forhindre opvarmning og øget viskositet, skal du ikke blande reservoir med protein-bicelle blanding.
- Når der udføres flere skærme, skal du straks returnere bicelle-protein plade til is til køling, så snart en løbetur er afsluttet.
- Drop volumen og forholdet (protein: reservoir) kan vælges som for konventionelle krystallisation forsøg. For eksempel kan indledende krystal forsøg ved hjælp af Mosquito robotten sættes op med 0,25 μl protein: bicelle blanding plus 0,25 μl reservoir.
- Inkubér krystal forsøg i et kammer ved 20 ° C. Temperatur er en god screening og optimering parameter, fordi den fase adfærd bicelles er temperatur afhængig.
- Højere temperaturer inducere lamellære fase 12 (Figur 1), som har den fordel, at præ-organiserendeproteinet i lag. Temperaturer under 20 ° C kan screenes, men du bør ikke gå under 4 ° C, da dette kan medføre, at lipider til at udfælde over længere perioder.
- På samme måde som traditionelle krystallisering forsøg, bør bicelle forsøg blive overvåget regelmæssigt for krystal udseende og vækst. Vi anbefaler at kontrollere bakker på 1. og 3. dag efter setup efterfulgt af ugentlige inspektion.
- Crystal optimering kan udføres ved hjælp af metoder, der rutinemæssigt anvendes til vaskemiddel baseret krystaller herunder gitter screening, additiv screening, skiftende temperaturer osv. Derudover bicelle procent og protein: bicelle-forholdet kan varieres. Desuden kan bicelles være doteret med særlige lipider, der måtte være nødvendige for protein stabilitet eller funktion.
4. Visualisering, krystal udvinding og frysning
Siden krystal forsøg med protein-bicelle blanding har en viskositet svarende til protein-vaskemiddel dråber, visualisering og krystal udsugning er rutine, og udføres som traditionelt set-ups.
- Visualisering: I modsætning til LCP medier, der ofte kræver høj kvalitet belysning under normale og polariseret lys til krystal detektion, er visualisering ikke hindres af bicelles. Farvede samt farveløs protein krystal dråber kan let analyseres ved hjælp af standard mikroskoper og ikke særligt udstyr er påkrævet.
- Bicelles, ligesom andre lipidic medier, tendens til at producere en høj procentdel af falske positiver. En UV-mikroskop i høj grad hjælper med at differentiere protein fra saltkrystaller (Figur 4).
- Udvinding og frysning: Crystal udvinding og frysning er relativt ligetil og kræver ikke, at opløsningen af de omkringliggende bicelle medier. Derudover bicelle fase i sig selv giver nogle moderate cryo-beskyttelse.
5. Repræsentative resultater:
nt "> Det tager normalt 2-3 dage for krystaller at dukke op og cirka en uge eller mere for dem at vokse til deres maksimale størrelse. Dette var tilfældet for bacteriorhodopsin og mus spændings-afhængige anion kanal 1 (mVDAC1) krystaller 4,8 . For andre membranproteiner det kan tage adskillige uger for krystal vækst, så det er vigtigt at fortsætte overvågningen af krystal forsøg langt ud over de første uger.Som med andre lipidic medier, har en tendens bicelles at forme figurer, der kan synes at være krystallinsk. Det er også blevet observeret, at de fører til en højere procentdel af salt og opvaskemiddel krystaller. En UV-mikroskop, der registrerer tryptofan fluorescens kan bidrage væsentligt til at fjerne sådanne ikke-proteinholdig falske positiver. Figur 4 viser lipid former, salt og protein krystaller set i synligt og ultraviolet lys til at skelne de forskellige resultater, der kan observeres.
83fig1.jpg "/>
Figur 1. Bicelle Skematisk. Bicelles er sammensat af et tolagede danner lipid molekyle som DMPC (blå) og en amphiphile såsom CHAPSO (grøn), som beskytter de hydrofobe kanter tolagede. Da temperaturen er steget, disk-lignende bicelles gennemgår en fase, omdannelse til en perforeret lamellar ark 12.
Figur 2. Flowchart for bicelle krystallisering metode beskriver de fire grundlæggende trin.
Figur 3. Crystal forsøg set-up skematiske. Renset vaskemiddel-opløst membranproteiner direkte kan blandes med bicelles på is ved blot pipettering indholdet sammen. Efter inkubation af protein / bicelle blandingen på is for ~ 30 minutter, krystallisering forsøgkan sættes op ved hjælp af et standard format, herunder robotteknologi.
Figur 4. Visualisering af krystal forsøg. Synlig billede (top panel) og UV-billede (nederste panel) af (A) Needle-formede krystaller observeret i en salt-eneste betingelse. Ingen fluorescens kan påvises fra krystaller, en angivelse af falsk positive. (B) Rod-formet krystal dannet i en MPD tilstand. Den krystal fluoresced svagt men blev fundet at være ikke-proteinholdig med røntgendiffraktion. (C) Crystal observeret omkring fire uger efter opsætning af forsøg. Den stærke fluorescens under UV-lys bekræfter det er et protein krystal.
| Nej | Protein | Kilde | Bicelle Formulering | Protein Concentratiom | Vaskemiddel 1 | Opløsning (Å) | Der henvises |
| 1 | Bacteriorhodopsin 2 | Halobacterium salinarum | 8% DMPC: CHAPSO (2.8:1) | 8 mg / ml | 2,0 | Faham og Bowie, 2002 | |
| 8% DTPC: CHAPSO (3:1) | 8 mg / ml | 1,8 | Faham et al., 2005 | ||||
| 2 | β2-adrenerge receptor / Fab komplekset | Homo sapiens | 8,3% DMPC: CHAPSO (3:1) | 10 mg / ml | DDM | 3.4/3.7 | Rasmussen et al., 2007 |
| 3 | Spænding-afhængige anion kanal 1 | Mus musculus | 7% DMPC: CHAPSO (2.8:1) | 12 mg / ml | LDAO | 2,3 | Ujwal et al., 2008 |
| 4 | Xanthorhodopsin | Salinibacter ruber | 4,2% DMPC, 5% NM | 4 mg / ml | DDM | 1,9 | Luecke et al., 2009 |
| 5 | Rombeformede protease | Escherichia coli | 2% DMPC: CHAPSO (2.6:1) | 9 mg / ml | Nonyl glucosid | 1,7 | Vinothkumar, 2011 |
1 Vaskemiddel anvendes til membran proteinoprensning
2 Native lipider fra violet membraner kan medbringes under rensningen
Tabel 1. Resumé af krystallisering betingelser for membran protein strukturer løses ved hjælp bicelles.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bicelles er en unik lipidic medier, der tilbyder en indfødt tolagede-lignende miljø, samtidig med at opføre sig som om opløst af rengøringsmidler. Denne ejendom giver bicelles en klar fordel frem for andre lipid-baserede krystallisering metoder, da der ikke er nogen indlæringskurve eller specialiseret udstyr, der kræves for denne teknik. Når bicelles er til rådighed, enten kommercielle eller forberedt i laboratoriet, kan de være direkte blandes med renset protein og fra dette punkt på krystallisering forsøg fortsætte stort set som med almindelige rengøringsmidler baserede protokoller. Desuden bicelles tilbyder en række praktiske fordele sammenlignet med andre teknikker, herunder udvidet oplagringsperioder, enkel iblanding af protein, high-throughput kapacitet ved hjælp af standard robotteknologi og rutine visualisering og krystal udvinding. En anden klar fordel er evnen til at dope bicelles med specifikke lipider til optimering, eller hvis det vises til gavn for protein af interesse. Taget sammen, lipiDIC bicelle metode giver stor alsidighed i kombination med praktiske lethed-i-brug, hvilket gør det let bortadopteres for alle membran protein krystallisering projekter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Drs. James Bowie og Salem Faham for at yde teknisk ekspertise og vejledning om de bicelle metode og Dr. Aviv Paz til nyttige diskussioner. Vi anerkender Le Du for eksperimentel støtte. Rachna Ujwal har økonomisk interesse i MemX Biosciences LLC, som dog ikke støtte dette arbejde. Dette arbejde blev støttet delvist af tilskud fra NIH (RO1 GM078844).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMPC | Affymetrix | D514 | |
| CHAPSO | Affymetrix | C317 | |
| Ready-to-use Bicelles | MemX Biosciences | MX201001/MX201002 | |
| Crystallization Screens | Qiagen, Hamptop Research, Molecular Dimensions, Emerald Biosystems, Jena Bioscience | Standard commercially available screens can be used for initial screening | |
| Crystallization Set-up | Standard manual and/or robotic set-up available in lab can be used. |
References
- Landau, E. M., Rosenbusch, J. P. Lipidic cubic phases: A novel concept for the crystallization of membrane proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences. 93, 14532-14535 (1996).
- Caffrey, M., Lyons, J., Smyth, T., Hart, D. J. Chapter 4 Monoacylglycerols: The Workhorse Lipids for Crystallizing Membrane Proteins in Mesophases. Current Topics in Membranes. 63, 83-108 (2009).
- Nollert, P., Landau, E. M. Enzymic release of crystals from lipidic cubic phases. Biochem. Soc. Trans. 26, 709-713 (1998).
- Cheng, A., Hummel, B., Qiu, H., Caffrey, M. A simple mechanical mixer for small viscous lipid-containing samples. Chem. Phys. Lipids. 95, 11-21 (1998).
- Faham, S., Bowie, J. U. Bicelle crystallization: a new method for crystallizing membrane proteins yields a monomeric bacteriorhodopsin structure. J. Mol. Biol. 316, 1-6 (2002).
- Faham, S., Ujwal, R., Abramson, J., Bowie, J. U. Chapter 5 Practical Aspects of Membrane Proteins Crystallization in Bicelles. Current Topics in Membranes. 63, 109-125 (2009).
- Faham, S. Crystallization of bacteriorhodopsin from bicelle formulations at room temperature. Protein Science. 14, 836-840 (2005).
- Luecke, H. Crystallographic structure of xanthorhodopsin, the light-driven proton pump with a dual chromophore. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 16561-16565 (2008).
- Ujwal, R. The crystal structure of mouse VDAC1 at 2.3 Å resolution reveals mechanistic insights into metabolite gating. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 17742-17747 (2008).
- Vinothkumar, K. R. Structure of rhomboid protease in a lipid environment. J. Mol. Biol. 407, 232-247 (2011).
- Rasmussen, S. G. F. Crystal structure of the human [bgr]2 adrenergic G-protein-coupled receptor. Nature. 450, 383-387 (2007).
- Prosser, R. S., Hwang, J. S., Vold, R. R. Magnetically aligned phospholipid bilayers with positive ordering: a new model membrane system. Biophys. J. 74, 2405-2418 (1998).
